專利名稱：檢測過氧化氫的生物電化學(xué)傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種新型生物電化學(xué)傳感器及其制備方法，特別是ー種檢測過氧化氫的新型生物電化學(xué)傳感器及其制備方法。
背景技術(shù)：
過氧化氫(H2O2)在食品、制藥、エ業(yè)、生物、臨床應(yīng)用和環(huán)境工程等許多領(lǐng)域都發(fā)揮著重要的作用，如食品加工、造紙業(yè)、消毒等。然而，過氧化氫作為ー種大氣污染物，是酸雨形成因素之一。此外，過氧化氫是細胞衰老、死亡以及ー些病理狀態(tài)細胞代謝的副產(chǎn)物。因此，快速、靈敏地檢測過氧化氫是科學(xué)界長期以來關(guān)注的ー個問題。目前，檢測過氧化氫的方法主要有滴定法、分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、熒光測定法以及電化學(xué)方法，其中電化學(xué)方法相比其他分析檢測方法，具有設(shè)備低廉、靈敏度高、簡便快捷等優(yōu)點。基于各種電化學(xué)方法所研制的電化學(xué)生物傳感器是ー類以電極作為信號轉(zhuǎn)換器，以電位或電流加以測量的生物傳感器。電化學(xué)體系借助電極實現(xiàn)電能的輸入或輸出，從而獲得電極表面修飾物質(zhì)的電信號，常用的為三電極體系。三電極體系包括工作電極、輔助電極(也稱對電極)和參比電極，其中的對電極是鉬電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電扱，電流流經(jīng)工作電極和對電扱。工作電極所測得的電位是相對于參比電極而言。在各種類型的電化學(xué)生物傳感器中，酶生物傳感器由于酶自身的選擇性和靈敏性等優(yōu)點，近幾年來得到了極大的發(fā)展。酶的固定方法直接決定了酶在傳感器中活性的高低，從而顯著地影響著酶生物傳感器的檢測性能。眾所周知，大多數(shù)酶的催化中心深埋在酶蛋白內(nèi)部，并且由于酶蛋白在電極表面的不規(guī)則定向和吸附變性等原因，酶蛋白大分子在未經(jīng)修飾的電極表面表現(xiàn)出較慢的異相電子傳遞速率。為解決這ー難題，研究人員發(fā)展了很多類型的修飾電極，利用各種膜材料比如表面活性剤、聚合物、脂類來固定酶蛋白，并且為酶蛋白提供一個合適的微環(huán)境來加速酶與電極之間的電子傳遞。然而，酶在這些修飾材料中的分布仍然是比較無序的。因此，如何使酶定向有序地固定在電極上，從而實現(xiàn)酶催化活性的最優(yōu)化，是研制新型酶生物傳感器亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー在于提供ー種檢測過氧化氫的生物電化學(xué)傳感器，該傳感器基于多肽矩陣對辣根過氧化物酶(HRP)的特異性結(jié)合及對酶活性的促進作用，實現(xiàn)酶傳感器中酶在電極表面的特異性定向，從而達到提高傳感器靈敏性的目的。本發(fā)明的目的之ニ在于提供該傳感器的制備方法。為達到上述目的，本發(fā)明采用如下機理某些特定序列的多肽可以與ー些酶，如HRP的特定位點特異性結(jié)合，通過調(diào)整酶的定向，使酶的活性中心暴露在外，從而促進酶的活性。根據(jù)上述機理，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
ー種檢測過氧化氫的生物電化學(xué)傳感器，為三電極體系傳感器，其中對電極是鉬電扱，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極，其特征在于所述的金電極表面構(gòu)建有多肽矩陣，辣根過氧化物酶HRP通過多肽矩陣定向固定到電極上；所述的多肽的序列為AHKVVPQRQIRHAYNRYGSC ;所述的多肽和辣根過氧化物酶的摩爾比為5 :1 I :5。一種制備上述的檢測過氧化氫的生物電化學(xué)傳感器的方法，其特征在于該方法的具體步驟為
a.將處理過的金電極置于0.5 M H2SO4中，在0-1. 6 V電壓范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描，掃速設(shè)置為100 mV/s，直至達到穩(wěn)定，在氮氣氛圍內(nèi)干燥；
b.將步驟a所得金電極浸沒在多肽溶液中，室溫放置15 20小時；然后超純水沖洗，以去除金表面未共價結(jié)合的多肽，隨后，將電極浸沒在含有I mM巰基己醇的、pH為6.0的N- (2-羥こ基)哌嗪-N’ -2-こ烷磺酸HEPES溶液中0. 5 I小時，用超純水沖洗，在氮氣氛圍內(nèi)干燥，即得到多肽修飾的金電極；所述的多肽溶液含有I剛-10 MM多肽，20 mMHEPES 和 10 mM TCEP,其 pH 為 6. 0 ;
c.在密閉狀態(tài)下，將步驟b所得到的金電極浸沒在Img/mL -10 mg/mL的HRP溶液中，室溫孵育2 . 5 3. 5h ;再用超純水洗滌，即得到所需的工作電極；
d.將步驟c所得到的工作電極與鉬電極和飽和甘汞電極一起組成三電極體系的生物電化學(xué)傳感器。上述的金電極的處理方法具體為將待處理的金電極置于水虎魚溶液，即濃硫酸30%H202的體積比為3 I，中浸泡2分鐘以去除吸附在電極表面的有機物，用超純水充分沖洗干凈；隨后將金電極用5000目的細剛玉砂紙打磨，然后分別在含有粒度分別為IPm,0.3 um,0. 05 U m的氧化鋁砂漿的絲綢上依次拋光至鏡面，拋光后的金電極分別在こ醇和水中超聲清洗5分鐘。ー種檢測過氧化氫的方法，采用上述的生物電化學(xué)傳感器進行檢測，其特征在于該方法的具體步驟為在惰性氣氛下，將工作電極浸入含有待檢測液的緩沖液中，室溫下采用循環(huán)伏安法或計時安培法進行電化學(xué)掃描，所述的緩沖液采用100 mM、pH為7. 0的PBS緩沖液，其中加入有10 mM的鄰苯二胺；采用循環(huán)伏安法時的掃描速率為100 mV/s，掃描電壓為-0. 4 V -0. 8 V ;采用計時安培法時的工作電位-583 mV。本發(fā)明選取對HRP的酶活性有促進作用的多肽(多肽序列為AHKVVPQRQIRHAYNRYGSC)，在金電極表面構(gòu)建該多肽的ー個矩陣，然后利用多肽與HRP的特異性結(jié)合作用，將HRP定向固定到電極表面。在檢測過程中，在待檢測體系中引入了ー種電子導(dǎo)體——鄰苯ニ胺，它起到酶和電極間電子傳遞的橋梁作用。在HRP的作用下，鄰苯ニ胺提供電子還原過氧化氫，自身被氧化為具有電化學(xué)活性的2，2’ - ニ胺基偶氮苯，可被電化學(xué)方法所檢測，從而取得了滿意的檢測結(jié)果。本發(fā)明構(gòu)建了ー種利用多肽矩陣和辣根過氧化物酶的新型過氧化氫生物電化學(xué)傳感器。它是基于某些特異性序列的多肽對辣根過氧化物酶的定向結(jié)合和對其酶活性的促進作用，將酶定向有序地固定在電極表面，從而解決了傳統(tǒng)的酶電化學(xué)傳感器所不能解決的酶的定向性問題，促進了酶在電極表面的電子傳遞，從而極大地提高了過氧化氫檢測的靈敏性。本發(fā)明對于酶在電極表面的定向固定這ー課題具有重大意義。


圖I為在含有10 mM鄰苯ニ胺的100 mM PBS (pH 7. 0)溶液的循環(huán)伏安圖，其中a為僅修飾了多肽的金電極；b為同時修飾了 HRP和多肽的金電極。圖2為在含有10 mM鄰苯ニ胺的100 mM PBS (pH 7. 0)溶液中，HRP及多肽修飾的金電極的循環(huán)伏安圖，其中a為不含H2O2 ；b為含有I mM H2O2條件下。圖3為向含有10 mM鄰苯ニ胺的100 mM PBS (pH 7. 0)溶液中，連續(xù)加入H2O2 (濃度IX 10_9 2X 10_4 M)的條件下，HRP及多肽修飾的金電極的計時安培曲線。插入圖為H2O2濃度在IX 10_9 IX 10_5 M范圍內(nèi)的計時安培曲線。
圖4為緩沖液中H2O2濃度與電流的線性關(guān)系。
具體實施例方式實施例一多肽修飾的金電極的制備
將待處理的金電極置于水虎魚溶液(濃硫酸30%H202 = 3 I)中浸泡2分鐘以去除吸附在電極表面的有機物，用超純水充分沖洗干凈。隨后將金電極用細剛玉砂紙(5000目)打磨，然后分別在含有氧化鋁(粒度分別為I um，0.3 um,0. 05 U m)砂漿的絲綢上依次拋光至鏡面，拋光后的金電極分別在こ醇和水中超聲清洗5分鐘。最后將電極置于0.5 M H2SO4中，在0-1. 6 V電位范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定。在氮氣氛圍內(nèi)干燥，得到表面清潔的裸金電極，可用于多肽矩陣的修飾。將含有70 UL多肽溶液(10 m多肽，20 mM HEPES和10 mM TCEP, pH 6. 0)的Eppendorf管倒扣于金電極上，保證修飾液完全覆蓋金表面，室溫放置16小時后，用超純水沖洗，以去除金表面未共價結(jié)合的多肽。隨后，將電極浸入含有ImM巰基己醇的20 mM HEPES溶液(pH 6. 0)中0. 5小時，用超純水沖洗，在氮氣氛圍內(nèi)干燥，即得到多肽修飾的金電極。實施例ニ 辣根過氧化物酶(HRP)在金電極表面的修飾
將配制好的HRP溶液10 UL滴加至已成功修飾多肽的金電極表面，室溫孵育3 h，在電極表面用Eppendorf管蓋著，以防止酶溶液揮發(fā)。修飾好的電極在使用前用超純水將表面弱吸附的物質(zhì)沖洗棹。實施例三工作電極電化學(xué)信號的獲取
由于多肽的導(dǎo)電性較差，對于HRP和電極間的電子傳遞有一定的阻隔作用，所以修飾電極在100 mM PBS緩沖液(pH7. 0)中無法得到HRP的直接電化學(xué)信號。因此，我們在體系中引入了ー種電子導(dǎo)體——鄰苯ニ胺。它可以起到酶和電極間電子傳遞的橋梁作用。由圖I可以看到，僅修飾了多肽的金電極在含有10 mM鄰苯ニ胺的100 mM PBS緩沖液(pH7. 0)中沒有任何電化學(xué)響應(yīng)，而同時修飾了 HRP之后的金電極出現(xiàn)了ー對穩(wěn)定的、峰形対稱的氧化還原峰。在100 mVs—1掃速下，其還原峰和氧化峰電位分別為-583 mV和-547 mV，與文獻中報道的2，2’ - ニ胺基偶氮苯的電化學(xué)參數(shù)基本一致。其表觀標準電極電位(E°’)為-565mV，峰間距(AE)為36 mV。實施例四工作電極的催化性能研究
如圖2所示，向含有10 mM鄰苯ニ胺的100 mM PBS緩沖液(pH7. 0)體系中加入I mM的H2O2后，HRP及多肽修飾的金電極得到ー對非常明顯的氧化還原峰，說明由于HRP的催化活性，本體系可對溶液中存在的H2O2產(chǎn)生靈敏的電流響應(yīng)。實施例五不同濃度過氧化氫的檢測向含有10 mM鄰苯ニ胺的100 mM PBS (pH 7. 0)溶液中連續(xù)加入H2O2 (濃度IX 1(T9 2X 10_4 M)的條件下，HRP及多肽修飾的金電極在-583 mV的工作電位下所得的計時安培曲線如圖3所示。隨著H2O2濃度的增加，得到的電流響應(yīng)也増大。響應(yīng)電流在3 s內(nèi)達到穩(wěn)態(tài)，表明電極上發(fā)生了快速電子傳遞。圖4所示為HRP及多肽修飾的金電極對不同濃度H2O2響應(yīng)的標準曲線。在H2O2濃度范圍從5.0 X 10 8molじ1到1.0 X 10 4molじ1之間變化時，電流與H2O2濃度成線性關(guān)系，線性回歸方程式為y = 0. 0087x + 0.0374，R2 = 0.9979，檢出限為I. 7 X 10 8Hiolじ1 (信噪比為3)。因此，本發(fā)明可以用于過氧化氫的定量檢測。表觀米氏常數(shù)(it:,)作為酶和底物結(jié)合緊密程度的ー個度量，表示酶和底物結(jié)合
的親和カ大小，可以作為衡量固定在電極上的酶活性的指標。/らフ值越小，表示酶與底物親和力越大。根據(jù)Lineweaver-Burk方程
權(quán)利要求
1.一種檢測銀離子的生物電化學(xué)傳感器，為三電極體系傳感器，其中對電極是鉬電扱，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極，其特征在于所述的金電極上修飾有模板DNA，模板 DNA 的序列為5’-CCTA CGACTGGATGACGATCCCTACGACTGAAAAAAAAAAAA-C6_SH -3’，該模板DNA在金電極上的修飾密度為1. 2 X IO12個分子/平方厘米 I. 2 X IO13個分子/平方厘米。
2.一種制備根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測銀離子的生物傳感器的方法，其特征在于制備該傳感器的工作電極的具體步驟為 a.將處理過的金電極置于0.5 M H2SO4中，在0 I. 55 V電壓范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描，掃速設(shè)置為100 mV/s，直至達到穩(wěn)定； b.用氮氣吹干步驟a所得金電極后，將該金電極浸沒在緩沖溶液中，倒置15 18小時后，再浸沒在I mM巰基己醇水溶液中反應(yīng)0. 5 I. 5小時，用超純水沖洗，并用氮氣吹干，即得到模板DNA鏈修飾的金電極；所述的緩沖溶液中含有濃度為I U M的模板DNA鏈、10 mM 的 Tris-HClUO mM 的 TCEP 以及 0. I M 的 NaCl，溶液的 pH 為 I. 4。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的金電極的處理方法的具體步驟為在待處理的金電極表面滴20 y L水虎魚溶液，即濃硫酸過氧化氫的體積比為3 :1，反應(yīng)2min，用超純水沖洗干凈，氮氣吹干；將金電極在5000目砂紙上打磨5 min之后，在含有粒度分別為I U m、0. 3 u m、0. 05 u m的氧化鋁的砂漿的絲綢上依次拋光至鏡面，然后在こ醇、超純水中依次超聲5 min,除去雜質(zhì)。
4.一種檢測銀離子的方法，采用根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測銀離子的生物傳感器，其特征在于該方法的具體步驟為 a.將生物傳感器中的工作電極金電極浸沒在反應(yīng)緩沖溶液和待測溶液按9:1的體積比形成的混合液中；所述的反應(yīng)緩沖溶液內(nèi)含有100 nM引物DNA，0. 5 U/u L BsaBI核酸內(nèi)切酶,0.05 U/u L Bst核酸聚合酶，50 uM dNTPs, I X NE緩沖4 ;所述的為50 mM KAc,.20 mMpH 7. 9的Tris-HAc, 10 mM Mg(Ac)2，在55 65度反應(yīng)5 10分鐘，用超純水沖洗，用氮氣吹干，得到酶切處理過的金電極；所述的引物DNA序列為5’ -CAGTCCTAGG-3’ ； b.在惰性氣氛下，將步驟a所得的金電極放入電化學(xué)檢測緩沖液中，所述的電化學(xué)檢測緩沖液為含50 uM [Ru(NH3)6]3+的10 mM Tris-HCl，pH=7. 4的檢測緩沖液，采用循環(huán)伏安法或計時電量法進行電化學(xué)掃描，反應(yīng)緩沖為添加50 UM [Ru (NH上]3+的10 mM pH 7. 4Tris-HCl ;采用循環(huán)伏安法時的掃描速率為50 mV/s，掃描范圍為-0. 45 V 0. 05 V ;采用計時電量法時的脈沖周期為250 ms，初始電位0.2 V，終止電位-0.5 V。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測過氧化氫的生物電化學(xué)傳感器及其制備方法。該新型生物電化學(xué)傳感器為三電極體系傳感器，其中對電極是鉑電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極。本發(fā)明基于一種序列特異的多肽對辣根過氧化物酶的定向結(jié)合及其對該酶活性的促進作用，以及電化學(xué)檢測方法高靈敏度的特點，有效地提高了過氧化氫傳感器的靈敏度，取得了滿意的結(jié)果。
文檔編號G01N27/327GK102654475SQ20121007933
公開日2012年9月5日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者孫麗亞, 朱小立, 李根喜, 范琦, 賀曉琳, 閆雅琳 申請人:上海大學(xué)