專利名稱：一種基體輔助激光解吸離子源質(zhì)譜的在線樣品制備裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種面向質(zhì)譜的樣品制備裝置，尤其是涉及ー種與液相色譜分離技術(shù)聯(lián)用的面向基體輔助激光解吸離子源質(zhì)譜的在線樣品制備裝置。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組測序計(jì)劃的完成，蛋白質(zhì)組學(xué)研究逐漸成為生命科學(xué)研究的重心。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的難點(diǎn)在于其樣品的高度復(fù)雜性，這也決定了蛋白質(zhì)組學(xué)的研究強(qiáng)烈地依賴高分辨的分離技術(shù)和以質(zhì)譜為核心的鑒定技術(shù)?；w輔助激光解吸離子化技術(shù)和電噴霧離子化技術(shù)的出現(xiàn)使得質(zhì)譜分析生物大分子成為可能。電噴霧質(zhì)譜采用直接引入液體樣品的進(jìn)樣技術(shù)，可以與液相色譜等分離技術(shù)在線聯(lián)用，而基體輔助激光解吸離子源質(zhì)譜由于其特殊的離子化技術(shù)多采用離線的方式對(duì)樣品進(jìn)行檢測。目前液相色譜與基體輔助激光解吸離子源質(zhì)譜的聯(lián)用主要有樣品分段收集和在線點(diǎn)樣等方法。分段收集法是直接將液相分離后的樣品分段收集，操作簡便。然而，樣品在分區(qū)段收集的同時(shí)也造成了已分離樣品的返混，損失了液相分離的分辨率。當(dāng)使用流量較低的液相分離技術(shù)如納流液相色譜時(shí)，這種影響尤為顯著。在線點(diǎn)樣法是將分離后的樣品和基質(zhì)溶液同軸引入點(diǎn)樣針，然后由點(diǎn)樣針在線自動(dòng)點(diǎn)樣。然而對(duì)于連續(xù)流體系，柱后樣品區(qū)帶的展寬以及點(diǎn)樣之間的交叉污染等問題普遍存在。如何將前端液相分離的樣品進(jìn)行可靠的轉(zhuǎn)移和處理，一直是液相分離與基體輔助激光解吸離子源質(zhì)譜聯(lián)用中的ー項(xiàng)技術(shù)瓶頸。中國專利CN101382527公開ー種用于液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的毛細(xì)管噴霧接ロ的制作裝置，包括“U”型支架，“U”型支架的兩個(gè)頂端分別設(shè)置有同軸的橫向滑槽，在滑槽內(nèi)分別放置有中空的調(diào)節(jié)螺桿，調(diào)節(jié)螺桿可于滑槽內(nèi)沿水平方向橫向滑動(dòng)；調(diào)節(jié)螺桿里側(cè)的內(nèi)外表面分別設(shè)置有內(nèi)螺紋和外螺紋，并于其前端通過內(nèi)螺紋螺合有PEEK頭，PEEK頭內(nèi)穿設(shè)有聚四氟管或PEEK管，于其外螺紋上設(shè)置有調(diào)距螺母；“U”型支架的內(nèi)部設(shè)置有高溫火焰燈；其中聚四氟管或PEEK管內(nèi)腔用于穿套石英毛細(xì)管。該裝置制作エ藝簡單，使用材料低廉，可以較方便的制作出理想的質(zhì)譜噴霧接ロ，且成功率高，均勻性好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明g在針對(duì)液相色譜分離與基體輔助激光解吸離子源質(zhì)譜聯(lián)用過程中，存在的樣品返混、區(qū)帶展寬以及交叉污染等問題，提供ー種不僅簡便、可靠，而且可充分發(fā)揮液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析效能的基體輔助激光解吸離子源質(zhì)譜的在線樣品制備裝置。本發(fā)明設(shè)有第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)微流控芯片、第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)微流控芯片、基質(zhì)試劑注射泵和靶板；所述第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)微流控芯片用于將液相色譜分離后的樣品制備成液滴，并將液相色譜的水相淋洗液和另外ー種不相溶的油相同時(shí)引入第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片，第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的豎臂的進(jìn)ロ接液相色譜的水相淋洗液出ロ ；第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的左橫臂接油相出口，第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的右橫臂為樣品液滴出口；所述第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片用于將基質(zhì)試劑引入單個(gè)液滴，第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的豎臂進(jìn)ロ接基質(zhì)試劑注射泵出ロ；第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的左橫臂通過連接管與第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的樣品液滴出ロ連接，第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的右橫臂為收集的液滴樣品即目標(biāo)液滴出ロ ；所述靶板設(shè)于目標(biāo)液滴出口下方。本發(fā)明采用兩級(jí)“T”型正交結(jié)構(gòu)微流控芯片在質(zhì)譜前端在線地完成樣品的制備。 第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)微流控芯片用于將液相色譜分離后的樣品制備成液滴，并將液相色譜的水相淋洗液和另外ー種不相溶的油相同時(shí)引入“T”型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片，在兩相的界面處水相淋洗液被油相“切割”形成液滴，從而使得液相色譜的連續(xù)流在柱后被轉(zhuǎn)換成非連續(xù)流。經(jīng)液相色譜分離后樣品以液滴的形式進(jìn)行存儲(chǔ)，在微納尺度上對(duì)分析物進(jìn)行分裝和收集，最大限度地保留了液相色譜的分辨率。與此同時(shí)，液滴與液滴之間被不相溶的油相所間隔，樣品的區(qū)帶展寬現(xiàn)象可以得到有效的抑制，樣品與樣品之間的交叉污染問題也得以避免。第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)微流控芯片用于將基質(zhì)試劑順次引入單個(gè)液滴。使用精密注射泵將基質(zhì)溶液引入第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)微流控芯片，基質(zhì)試劑順次與單個(gè)液滴混合，通過流量的調(diào)節(jié)控制混入液滴的基質(zhì)的用量，完成對(duì)第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)微流控芯片所制備的液滴的批量處理?；烊牖|(zhì)的液滴樣品單元在點(diǎn)靶板后干燥，基質(zhì)與樣品形成共結(jié)晶，最后使用基體輔助激光解吸離子源質(zhì)譜對(duì)經(jīng)過處理的樣品進(jìn)行分析檢測。本發(fā)明可通過以下步驟實(shí)現(xiàn)I)微流控芯片的制備首先使用模塑法來制備聚ニ甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片。使用AutoCAD繪圖軟件繪制出芯片的結(jié)構(gòu)并制成相應(yīng)的掩模，通過光刻技術(shù)將掩模上的微結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到SU-8光刻膠上制備成SU-8陽模作為芯片母版。將PDMS前聚體和固化試劑充分混合并澆注于SU-8陽模上，在一定溫度下固化即得到帶有微孔道結(jié)構(gòu)的芯片基片，最后與基底封接完成芯片的制備。2)液滴的制備所需分離分析的樣品首先經(jīng)液相色譜分離，將液相色譜的淋洗液直接引入正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片，與此同時(shí)通過精密注射泵將另外一種不相溶的油相引入芯片，兩相在界面處形成水油相互間隔的液滴，經(jīng)液相色譜分離的樣品以液滴的形式進(jìn)行存儲(chǔ)。3)基質(zhì)試劑的引入將第一級(jí)正交結(jié)構(gòu)芯片制備的液滴通過連接管引入第二級(jí)正交結(jié)構(gòu)芯片，與此同時(shí)通過精密注射泵將基質(zhì)溶液引入該芯片，液滴順次與基質(zhì)溶液混合,將混合后的液滴樣品単元進(jìn)行收集。4)樣品的結(jié)晶將收集的液滴樣品點(diǎn)在MALDI靶板上，提高溫度使試劑揮發(fā)，基質(zhì)與樣品形成共結(jié)晶，處理完的樣品即可直接進(jìn)行質(zhì)譜檢測。本發(fā)明基于液滴微體積、低擴(kuò)散、無返混等獨(dú)特的優(yōu)勢，經(jīng)液相色譜分離后的樣品以液滴的形式進(jìn)行存儲(chǔ)，最大限度地保留了液相色譜的分辨率，與此同時(shí)樣品的區(qū)帶展寬以及樣品與樣品之間的交叉污染等問題也得以有效地解決。此外，在樣品單元中在線地加入基質(zhì)溶液可以大大簡化樣品制備過程。這種在線的樣品處理裝置在液相色譜與基體輔助激光解吸離子源質(zhì)譜聯(lián)用，以及復(fù)雜體系分離分析，如蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，具有良好的應(yīng)用前景。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例的結(jié)構(gòu) 組成示意圖。圖2為色譜分離譜圖。在圖2中，橫坐標(biāo)為時(shí)間Time(sec)，縱坐標(biāo)為強(qiáng)度Abs (AU)。圖3為質(zhì)譜檢測結(jié)果圖。在圖3中,橫坐標(biāo)為質(zhì)/荷比m/z,縱坐標(biāo)為質(zhì)譜響應(yīng)值；從上至下分別為樣品編號(hào)25th，22nd，18th，12th，7th。圖4為經(jīng)過液相色譜分離收集的所有液滴的質(zhì)譜圖。在圖4中，橫坐標(biāo)為質(zhì)/荷比m/z,縱坐標(biāo)為液滴數(shù)量droplet number。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步的說明。參見圖1，本發(fā)明實(shí)施例設(shè)有第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)微流控芯片、第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)微流控芯片、基質(zhì)試劑注射泵和靶板3。所述第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)微流控芯片用于將液相色譜分離后的樣品制備成液滴，并將液相色譜的水相淋洗液A和另外ー種不相溶的油相B同時(shí)引入第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片，第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的豎臂11的進(jìn)ロ接液相色譜的水相淋洗液出口 ；第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的左橫臂121接油相出口，第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的右橫臂122為樣品液滴C出口。所述第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片用于將基質(zhì)試劑D引入單個(gè)液滴，第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的豎臂21進(jìn)ロ接基質(zhì)試劑注射泵出ロ；第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的左橫臂221通過連接管與第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的樣品液滴出ロ連接，第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的右橫臂222為收集的液滴樣品即目標(biāo)液滴出ロ ；所述靶板3設(shè)于目標(biāo)液滴出口下方。以下給出具體實(shí)施例。I、微流控芯片的制備使用AutoCAD繪圖軟件繪制出芯片的結(jié)構(gòu)，其中“T”型正交結(jié)構(gòu)芯片水平孔道寬度為300 iim，豎直孔道寬度為200 iim。然后將繪制好的芯片圖形制成相應(yīng)的掩模，通過光刻技術(shù)將掩模上的微結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到SU-8光刻膠上制備成SU-8陽模作為芯片母版。將質(zhì)量比為10 : I的PDMS前聚體和固化試劑充分混合并澆注于SU-8陽模上，然后置于真空干燥器內(nèi)抽負(fù)壓排盡混合液中的氣泡，在65°C下固化一小時(shí)即得到帶有微孔道結(jié)構(gòu)的芯片基片，將固化后的聚合物材料從陽模上剝離，在適宜位置打孔用于與外管路連接，最后與基底封接完成芯片的制備。2、樣品的分離與液滴的制備
以濃度為IOOOppm的核糖核酸酶A(Ribonuclease A)、細(xì)胞色素C(CytochromeC)、牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶(Lysozyme)、肌紅蛋白(Myoglobin)五種蛋白的混合物為樣品對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用納流液相色譜對(duì)混合物進(jìn)行分離，色譜分離條件進(jìn)樣量為IOnL,流速為500nL/min，流動(dòng)相A為H20+0. I % TFA,流動(dòng)相B為ACN+0. I % TFA,梯度洗脫程序?yàn)榱鲃?dòng)相B 20% 60% lOmin，所用色譜柱為內(nèi)徑lOOiim，外徑為375iim的毛細(xì)管柱，色譜固定相為PLRP-S IOii m，填充長度為12cm，檢測波長為紫外214nm。色譜分離譜圖如圖2所示。將液相色譜的淋洗液直接引入正交的微流控芯片，與此同時(shí)使用精密注射泵將油相(FC-40)引入芯片，油相的流速為1.5i!L/min，兩相在交界處形成水油相互間隔的液滴，姆ー個(gè)液滴的大小約為50nL,經(jīng)液相色譜分離后的樣品以液滴的形式進(jìn)行存儲(chǔ)3、基質(zhì)試劑的引入將第一級(jí)正交結(jié)構(gòu)芯片制備的液滴通過連接管引入第二級(jí)正交結(jié)構(gòu)芯片，與此同時(shí)通過精密注射泵將基質(zhì)溶液引入芯片，基質(zhì)溶液的流速為I. Oii L/min，約有IOOnL的基質(zhì)溶液與液滴混合最終形成體積約為150nL的樣品單元,使用連接管將與基質(zhì)溶液混合后的液滴樣品單元進(jìn)行收集。4、樣品的結(jié)晶將收集的液滴樣品單元依次點(diǎn)在MALDI靶板上，提高一定的溫度使試劑揮發(fā)，基質(zhì)與樣品形成共結(jié)晶。5、質(zhì)譜檢測將處理好的MALDI靶板放入質(zhì)譜進(jìn)樣室，使用基體輔助激光解吸離子源質(zhì)譜對(duì)樣品進(jìn)行檢測。質(zhì)譜檢測結(jié)果如圖3和圖4所示。由質(zhì)譜檢測結(jié)果圖(圖3)可見，5種蛋白質(zhì)均被檢出。圖4為經(jīng)過液相色譜分離收集的所有液滴的質(zhì)譜圖，從圖4中可以看出，每ー個(gè)色譜峰都被切分成多個(gè)液滴單元最終進(jìn)入質(zhì)譜檢測，這充分保留了液相色譜的分辨率，利于充分發(fā)揮液相色譜質(zhì)譜的分離分析效能。質(zhì)譜檢測結(jié)果與色譜圖也有較好的對(duì)應(yīng)性，交叉污染等問題也得到有效抑制。
權(quán)利要求
1.一種基體輔助激光解吸離子源質(zhì)譜的在線樣品制備裝置，其特征在于設(shè)有第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)微流控芯片、第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)微流控芯片、基質(zhì)試劑注射泵和靶板； 所述第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)微流控芯片用于將液相色譜分離后的樣品制備成液滴，并將液相色譜的水相淋洗液和另外ー種不相溶的油相同時(shí)引入第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片，第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的豎臂的進(jìn)ロ接液相色譜的水相淋洗液出ロ；第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的左橫臂接油相出口，第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的右橫臂為樣品液滴出口； 所述第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片用于將基質(zhì)試劑引入單個(gè)液滴，第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的豎臂進(jìn)ロ接基質(zhì)試劑注射泵出ロ；第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的左橫臂通過連接管與第I級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的樣品液滴出ロ連接，第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的右橫臂為收集的液滴樣品即目標(biāo)液滴出ロ ；所述靶板設(shè)于目標(biāo)液滴出口下方。
全文摘要
一種基體輔助激光解吸離子源質(zhì)譜的在線樣品制備裝置，涉及一種面向質(zhì)譜的樣品制備裝置。提供一種不僅簡便、可靠，而且可充分發(fā)揮液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析效能的基體輔助激光解吸離子源質(zhì)譜的在線樣品制備裝置。設(shè)有2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)微流控芯片、基質(zhì)試劑注射泵和靶板；第1級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片豎臂的進(jìn)口接液相色譜的水相淋洗液出口，左橫臂接油相出口，右橫臂為樣品液滴出口；第2級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的豎臂進(jìn)口接基質(zhì)試劑注射泵出口；左橫臂通過連接管與第1級(jí)T型正交結(jié)構(gòu)的微流控芯片的樣品液滴出口連接，右橫臂為收集的液滴樣品即目標(biāo)液滴出口；所述靶板設(shè)于目標(biāo)液滴出口下方。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102621253SQ20121008651
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者張博, 王雪, 肖志良 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)