專利名稱：一種檢測(cè)農(nóng)藥殘留的電流型免疫傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種檢測(cè)農(nóng)藥殘留的電流型免疫傳感器的制備方法，屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)業(yè)對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)以及人民生活有著舉足輕重的作用，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥是防治病蟲(chóng)害，保障農(nóng)業(yè)豐收，確保糧食供應(yīng)的重要生產(chǎn)資料。農(nóng)藥的大量使用，在提高農(nóng)作物產(chǎn)量的同時(shí)，其農(nóng)藥殘留超標(biāo)的負(fù)面影響也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)所謂的農(nóng)藥殘留是指農(nóng)藥使用后殘存于生物體、農(nóng)副產(chǎn)品和環(huán)境中的微量農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱。一般不易揮發(fā)和在植物體內(nèi)、土壤中不易分解，且脂溶性強(qiáng)的農(nóng)藥施用后殘留量更高。隨著我國(guó)人民生活水平不斷提高，農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全問(wèn)題越來(lái)越受到關(guān)注， 尤其蔬菜中農(nóng)藥殘留問(wèn)題已經(jīng)成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)，全國(guó)每年都有上百起因食用被農(nóng)藥污染的農(nóng)產(chǎn)品而引起的急性中毒事件，嚴(yán)重影響廣大消費(fèi)者的身體健康，因此由農(nóng)藥殘留超標(biāo)導(dǎo)致的食品安全問(wèn)題，已越來(lái)越受到各國(guó)政府和公眾的重視。關(guān)于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的方法和技術(shù)有多種，無(wú)論是傳統(tǒng)方法和近代快速檢測(cè)方法都存在一定的缺陷。傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法如氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法 (HPLC)、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/LC-MS)、毛細(xì)管電泳法(CE)雖然具有高選擇性和精確度， 但仍存在著樣品前處理復(fù)雜、儀器設(shè)備昂貴、操作麻煩、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等不足，因此不適用于農(nóng)產(chǎn)品快速檢測(cè)的要求。目前為了保障人們的食品安全，很多農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)、賓館、飯店等場(chǎng)所都應(yīng)用檢測(cè)設(shè)備檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留情況。目前，我國(guó)農(nóng)藥殘留的速測(cè)方法是酶抑制試紙法和酶抑制分光光度法(農(nóng)殘快速檢測(cè)儀)，可以實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，具有較好的實(shí)用價(jià)值。速測(cè)卡是通過(guò)肉眼觀察卡片的顏色變化，因此一般只能用于嚴(yán)重超標(biāo)的蔬菜樣品進(jìn)行定性測(cè)量。酶抑制分光光度法的應(yīng)用也比較廣泛，國(guó)內(nèi)已有多種農(nóng)藥殘留速測(cè)儀均是基于此原理。分光光法的原理是基于吸光度的變化進(jìn)行檢測(cè)的，但蔬菜水果中大量的色素會(huì)對(duì)分光光度法造成很大的影響，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。但是上述方法存在回收率低、錯(cuò)檢、漏檢比例較高、重復(fù)性差、難以滿足低殘留和定量檢測(cè)的要求等缺點(diǎn)。發(fā)明的目的在于提供一種能克服上述缺陷、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，選擇性好的檢測(cè)農(nóng)藥殘留的電流型免疫傳感器的制備方法。其技術(shù)方案為一種檢測(cè)農(nóng)藥殘留的電流型免疫傳感器的制備方法，其特征在于 電流型免疫傳感器的組狀過(guò)程為電沉積納米金，滴涂三維納米復(fù)合膜，滴涂蛋白A，自組裝克百威單克隆抗體，自組裝BSA封閉。所述的一種檢測(cè)農(nóng)藥殘留的電流型免疫傳感器的制備方法，其特征在于玻碳電極(d=3mm)的清洗，免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建及過(guò)程表征，免疫傳感器工作曲線的建立， 免疫傳感器性能的檢測(cè)，免疫傳感器對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)。所述的一種檢測(cè)農(nóng)藥殘留的電流型免疫傳感器的制備方法，其特征在于所制備
3的電流型免疫傳感器的工作曲線為y=2. 3439x+4. 1535，免疫傳感器的性能為受免疫擴(kuò)散控制，免疫傳感器性能檢測(cè)包括選擇性、穩(wěn)定性和再生能力，免疫傳感器對(duì)蔬菜樣品回收率的測(cè)定。其制備原理為免疫生物傳感器以免疫生物分子作為識(shí)別元件，通過(guò)固定化技術(shù)將免疫蛋白結(jié)合到感受器表面，發(fā)生免疫識(shí)別反應(yīng)后，生成的免疫復(fù)合物與產(chǎn)生的物理或化學(xué)信號(hào)相關(guān)聯(lián)，由換能器將其轉(zhuǎn)化為與待測(cè)物質(zhì)濃度(或活度)有關(guān)的可定量或者可處理的物理化學(xué)信號(hào)，如電信號(hào)、光信號(hào)或者聲波信號(hào)等，再通過(guò)二次儀表放大并且輸出信號(hào)，從而可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)。本發(fā)明采用納米金晶體、三維納米復(fù)合膜和蛋白A對(duì)玻碳電極進(jìn)行修飾，與傳統(tǒng)的方法相比，由于納米金較高的比表面積、穩(wěn)定性和導(dǎo)電性可以增大電極表面電子的轉(zhuǎn)移和生物相容性，進(jìn)而增大免疫傳感器的響應(yīng)電流；將功能化多壁碳、 殼聚糖與普魯士藍(lán)同時(shí)復(fù)合制成三維納米復(fù)合膜，不但增大了傳感器的電流響應(yīng)以增大檢測(cè)精度，更獲得了具有大量氨基的共沉積膜，可為生物分子提供一個(gè)合適的親水性環(huán)境；蛋白A分子可以固定地結(jié)合克百威單克隆抗體的Fe端,從而可以將抗體定向地固定在電極上使與農(nóng)藥特異性結(jié)合端暴露在表面上，將經(jīng)過(guò)上述步驟修飾過(guò)的玻碳電極，制成免疫傳感器后，檢測(cè)農(nóng)藥的精度更高、實(shí)現(xiàn)小型、便捷、適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的目的。采用本發(fā)明制成的電流型免疫傳感器可以在蔬果采收、上市前，進(jìn)行農(nóng)藥殘留的快速測(cè)定，直接對(duì)克百威農(nóng)藥殘留是否超標(biāo)量進(jìn)行檢測(cè)，避免因食含有殘留農(nóng)藥的蔬果而引起中毒，為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)與消費(fèi)提供殘留檢測(cè)的技術(shù)支撐。為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種檢測(cè)農(nóng)藥殘留的電流型免疫傳感器的制備方法，其特征在于(1)電流型免疫傳感器制備前玻碳電極的清洗，活化和性能測(cè)試，如果測(cè)試循環(huán)伏安曲線中的峰電位差在SOmV以下，并盡可能接近64mV，所述玻碳電極可使用，否則要重新返回步驟清洗中，直到符合要求。⑵納米金晶體的電沉積在前處理好的電極上，接下來(lái)滴涂三維納米復(fù)合膜和蛋白A，然后固定克百威單克隆抗體，最后用BSA封閉電流型免疫傳感器制備結(jié)束，放入冰箱里4°C保存?zhèn)溆谩檫_(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種檢測(cè)農(nóng)藥殘留的電流型免疫傳感器的制備方法，其特征在于(1)將上述制備好的電流型免疫傳感器在工作底液中以不同的掃速做循環(huán)伏安方法掃描，可以得到峰值和掃速的關(guān)系，得到是受擴(kuò)散控制的。⑵配置一系列的克百威標(biāo)準(zhǔn)液，用以得出上述制備的電流型免疫傳感器的工作曲線、檢測(cè)范圍和檢測(cè)限；(3)配置一系列經(jīng)?；旌鲜褂玫霓r(nóng)藥溶液，以檢測(cè)所制備電流型免疫傳感器的選擇性； 〖41通過(guò)循環(huán)伏安掃描多段驗(yàn)證上述免疫傳感器的穩(wěn)定性，通過(guò)解離和再次免疫檢測(cè)其再生性能;[51通過(guò)檢測(cè)實(shí)際蔬菜樣品得出免疫傳感器的回收率。本發(fā)明采用電沉積納米金晶體，組裝三維納米復(fù)合膜和固定的蛋白A與傳統(tǒng)的自組裝納米金膠的方法相比增大了其穩(wěn)定性、固定量并可使界面更均勻；功能化多壁碳、殼聚糖與普魯士藍(lán)同時(shí)復(fù)合制成三維納米復(fù)合膜，增大了傳感器的電流響應(yīng)以增大檢測(cè)精度， 更獲得了具有大量氨基的共沉積膜，可為生物分子蛋白A提供一個(gè)合適的親水性環(huán)境；蛋白A的大量固定可以增大抗體的固定量，其定向固定的作用可以增大抗體的利用率。所述電流型免疫傳感器的制備工藝如下⑴將預(yù)處理好的玻碳電極浸入2mLl%的氯金酸溶液中，在-O. 2V的電壓下應(yīng)用恒電位法電沉積40S。電沉積結(jié)束后用PH=7. 5的PBS緩沖液沖洗，氮?dú)獯蹈?。U取10 μ L制備好的三維納米復(fù)合膜滴涂在電沉積過(guò)納米金晶體的電極表面，常溫下靜置I. 5h，然后用ΡΗ=7. 5的PBS緩沖液沖洗表面I丨上述制作好的電極晾干后，取10μ L 2mg/mL的蛋白A溶液滴涂在電極上，常溫下2h，然后用PH=7. 5的 PBS緩沖液沖洗表面；四將上述制備好的電極浸于克百威單克隆抗體溶液中，4°C條件下浸泡8h，取出后沖去多余部分，晾干待用；[51最后將上述制備好的電極最后浸入1%的BSA溶液中室溫下靜置2h，以封閉電極上非特異性結(jié)合位點(diǎn)，取出置于室溫下晾干，免疫傳感器制作完成，保存在4 C條件下備用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例⑴玻碳電極的清洗所述玻碳電極修飾前，首先浸入熱的“piranha”溶液 (H2SO4:30% H2O2 = 3:1)中浸泡15min，用水清洗干凈，接下來(lái)用O. 3 μ m、30nm的Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面，拋光后用去離子水洗去表面污物，再移入超聲水浴中清洗，每次5min， 重復(fù)二次，然后依次用6mol/L的HNO3、無(wú)水乙醇和去離子水超聲清洗，氮?dú)猸h(huán)境下干燥;[2j 玻碳電極的活化徹底洗滌后，電極在O. 5mol/L H2SO4溶液中用循環(huán)伏安法活化，掃描范圍
I.O 一 I. 0V，反復(fù)掃描直至達(dá)到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖為止。(3j預(yù)處理好的玻碳電極的測(cè)試 最后在O. 20mol/L KNO3中記錄I X 10_3mol/L K3Fe (CN) 6溶液的循環(huán)伏安曲線，以測(cè)試所述玻碳電極的性能，掃描速度50 mV/S，掃描范圍為一 O. IV 0.6 ;當(dāng)所述循環(huán)伏安曲線中的峰電位差在SOmV以下，并盡可能接近64mV，所述玻碳電極可使用，否則要重新返回步驟⑴ 中，處理所述玻碳電極，直到符合要求丨4丨將上述前處理好的玻碳電極浸入2mLl%的氯金酸溶液中，在-O. 2V的電壓下應(yīng)用恒電位法電沉積40S。電沉積結(jié)束后用PH=7. 5的PBS緩沖液沖洗，氮?dú)獯蹈?。[5丨取IOyL制備好的三維納米復(fù)合膜滴涂在電沉積過(guò)納米金晶體的電極表面，常溫下靜置I. 5h，然后用PH=7. 5的PBS緩沖液沖洗表面；(6)上述制作好的電極晾干后，取10 μ L 2mg/mL的蛋白A溶液滴涂在電極上，常溫下2h，然后用PH=7. 5的PBS緩沖液沖洗表面；( )將上述制備好的電極浸于克百威單克隆抗體溶液中，4°C條件下浸泡8h，取出后沖去多余部分，晾干待用I I最后將上述制備好的電極最后浸入1%的BSA溶液中室溫下靜置2h，以封閉電極上非特異性結(jié)合位點(diǎn)，取出置于室溫下晾干，免疫傳感器制作完成， 保存在4°C條件下備用丨…將上述制備好的免疫傳感器在含有5 mM [Fe (CN)6] 3_/4_和O. I M KCl的O. I M磷酸鹽緩沖液(PBS) (pH 7. 5)中以30 -500 mV/s的掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試；[10)配置O. Ing/mL-l μ g/mL的克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液，將上述制備好的電流型免疫傳感器分別浸入不同濃度5mL的克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液，在常溫下孵育12min，檢測(cè)免疫前后電流變化得到其工作曲線；(丨I丨將電流型免疫傳感器分別在10 ng/mL常混合使用的農(nóng)藥溶液中常溫下孵育12min，以檢測(cè)其選擇性，另外將免疫傳感器連續(xù)掃描120段以檢測(cè)其穩(wěn)定性，將免疫后的傳感器用甘氨酸-HCl緩沖液(pH 2.8)解離克百威農(nóng)藥5min后再次免疫，重復(fù)操作 5次以檢測(cè)其再生能力；(丨2)把蔬菜徹底清洗干凈并用去離子水清洗3次，噴灑上一定濃度的農(nóng)藥，放置24h后，用PBS (pH 7. 5)做溶劑超聲處理30min (換溶劑三次)，以檢測(cè)實(shí)際樣品的回收率。
此種電流型免疫傳感器農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法操作工藝簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間較短，靈敏度高，選擇性穩(wěn)定性好，再生能力好和回收率符合要求，符合我國(guó)農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)發(fā)展和國(guó)際化要求。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)農(nóng)藥殘留的電流型免疫傳感器的制備方法，其特征在于電流型免疫傳感器的組狀過(guò)程為電沉積納米金，滴涂三維納米復(fù)合膜，滴涂蛋白A，自組裝克百威單克隆抗體，自組裝BSA封閉。
2.如權(quán)利要求I所述的一種檢測(cè)農(nóng)藥殘留的電流型免疫傳感器的制備方法，其特征在于玻碳電極(d=3mm)的清洗，免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建及過(guò)程表征，免疫傳感器工作曲線的建立，免疫傳感器性能的檢測(cè)，免疫傳感器對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)。
3.如權(quán)利要求I所述的一種檢測(cè)農(nóng)藥殘留的電流型免疫傳感器的制備方法，其特征在于所制備的電流型免疫傳感器的工作曲線為y=2. 3439x+4.1535，免疫傳感器的性能為受免疫擴(kuò)散控制，免疫傳感器性能檢測(cè)包括選擇性、穩(wěn)定性和再生能力，免疫傳感器對(duì)蔬菜樣品回收率的測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)農(nóng)藥殘留的電流型免疫傳感器的制備方法，其特征在于玻碳電極的清洗活化和表征，電沉積納米金，滴涂三維納米復(fù)合膜，滴涂蛋白A，自組裝克百威單克隆抗體，自組裝BSA封閉，免疫傳感器工作曲線的建立，免疫傳感器性能如選擇性、穩(wěn)定性和再生能力的檢測(cè)，免疫傳感器對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)。采用電沉積納米金晶體，組裝三維納米復(fù)合膜和固定的蛋白A與傳統(tǒng)的自組裝納米金膠的方法相比增大了其穩(wěn)定性、固定量并可使界面更均勻；功能化多壁碳、殼聚糖與普魯士藍(lán)同時(shí)復(fù)合制成三維納米復(fù)合膜，增大了傳感器的電流響應(yīng)以增大檢測(cè)精度，更獲得了具有大量氨基的共沉積膜，可為生物分子蛋白A提供一個(gè)合適的親水性環(huán)境；蛋白A的大量固定可以增大抗體的固定量，其定向固定的作用可以增大抗體的利用率，從而使制備的電流型免疫傳感器檢測(cè)時(shí)間較短，靈敏度高，選擇性穩(wěn)定性好，再生能力好和回收率符合要求。
文檔編號(hào)G01N27/36GK102608188SQ201210088849
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者劉君峰, 孫霞, 李青青, 杜淑媛, 王相友 申請(qǐng)人:山東理工大學(xué)