專利名稱：一種氯胺酮膠體金唾液檢測試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種氯胺酮膠體金唾液檢測試紙條。
背景技術(shù)：
氯胺酮(Ketamine,KET)是苯環(huán)己哌唳(N-l-phenycyclohexy-piperidine, PCP)的衍生物，醫(yī)學(xué)上作為外科手術(shù)麻醉劑，黑市上俗稱“K粉”、“K仔”。近年來在娛樂場所濫用日趨嚴(yán)重。是我國目前的主要的新型毒品之一。目前，我國列入管制的麻醉藥品有120多種，精神藥品有130多種。研究表明，在服用氯胺酮后都會出現(xiàn)“去人格化”、“去真實(shí)感”、人體形象改變、夢境、幻覺以及惡心嘔吐，大劑量服用，會出現(xiàn)意識模糊、身體呈木僵狀，呼吸抑制，甚至出現(xiàn)四肢抽搐以及呼吸停止等現(xiàn)象；長期使用氯胺酮可造成記憶缺失、認(rèn)知功能 損害和精神病。人體服用的氯胺酮有70% -90%在肝內(nèi)代謝并經(jīng)尿液排出，其在體內(nèi)的代謝較快，清除半衰期約為2. 5小時(shí)，一般在吸食后2-4小時(shí)內(nèi)即可被檢出。目前對氯胺酮快速檢測的方法和儀器較多，主要依靠氣相色譜、高效液相色譜、質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳等進(jìn)行檢測，但存在儀器昂貴、檢測時(shí)間長，需要專業(yè)技術(shù)人員操作的缺點(diǎn)。膠體金免疫層析技術(shù)是目前較為成熟的技術(shù)方法，其原理是將氯胺酮-BSA結(jié)合物包被在硝酸纖維薄膜上，在玻璃纖維上包被膠體金標(biāo)記的特異性抗體。在檢測時(shí)，如樣本中沒有氯胺酮或其代謝產(chǎn)物存在，膠體金標(biāo)記的特異性抗體與膜區(qū)抗原結(jié)合形成兩條紅線(一條反應(yīng)線T，一條質(zhì)控線C)，表明檢測結(jié)果為陰性；如樣本中存在氯胺酮或其代謝產(chǎn)物，而且濃度高于檢測水平(1000ng/ml)時(shí)，毒品分子就與膠體金標(biāo)記的抗體競爭結(jié)合，從而阻止膠體金標(biāo)記的抗體與膜區(qū)抗原結(jié)合，使其對應(yīng)的紅色反應(yīng)線消失，僅出現(xiàn)一條紅色的質(zhì)控線，表明檢測結(jié)果為陽性。盡管以膠體金免疫層析技術(shù)為原理生產(chǎn)的的氯胺酮檢測試紙條(膠體金法)已經(jīng)得到了較為廣泛的臨床應(yīng)用，但其檢測標(biāo)本為尿液，目前國內(nèi)外尚未有研制和生產(chǎn)以人體唾液作為檢測樣本的氯胺酮唾液檢測試紙條?，F(xiàn)有的尿液試紙條在其使用過程中存在如下不足之處(I)樣本采集不衛(wèi)生，為很多樣本采集者和檢測者難以接受；(2)隱私權(quán)問題，SP性隱蔽取尿，女性尿檢時(shí)需要女性人員監(jiān)督；(3)新兵、公務(wù)員、特殊從業(yè)人員(飛行員、駕駛員、高空作業(yè)者等)體檢，受試者易在標(biāo)本采集中摻假制造假陰性；(4)而取尿時(shí)需有專用場所，而且必須一對一進(jìn)行監(jiān)督取尿，很不方便，不適用于駕駛員路旁篩查和娛樂場所突擊抽查；(5)在實(shí)際使用過程中，易發(fā)生與美沙酮、美沙芬等藥物交叉問題，從而導(dǎo)致錯(cuò)檢和誤檢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種使用方便、快捷，用于檢測人類唾液中氯胺酮的試紙條。本發(fā)明的另一目的是提供一種氯胺酮膠體金檢測試紙條的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供一種氯胺酮膠體金檢測試紙條的應(yīng)用。一種氯胺酮唾液檢測試紙條，包括反應(yīng)膜(3)和金標(biāo)墊(2)，所述反應(yīng)膜為硝酸纖維膜，其具有分別包被與載體蛋白連接的氯胺酮的反應(yīng)線和二抗IgG的質(zhì)控線；所述金標(biāo)墊是包被有膠體金標(biāo)記的氯胺酮單克隆抗體的玻璃纖維膜。所述載體蛋白為小牛血清白蛋白(BSA)、雞卵白蛋白(OVA)和/或血藍(lán)蛋白(KLH)。所述的二抗IgG為抗鼠IgG抗體。所述玻璃纖維膜中膠體標(biāo)記的氯胺酮的單克隆抗體的pH值為8. 0 8. 5，膠體金和氯胺酮單克隆抗體的配比為2 12y g/ml膠體金。優(yōu)選地，所述玻璃纖維膜中膠體金標(biāo)記的氯胺酮的單克隆抗體的pH值為8. 2，膠體金和氯胺酮單克隆抗體的配比為g/ml膠體金。所述金標(biāo)墊是將膠體金標(biāo)記的氯胺酮單克隆抗體加入脫脂奶粉，離心后取沉淀，沉淀用復(fù)溶液復(fù)溶后噴涂于玻璃纖維膜上制得。所述復(fù)溶液是由終濃度為0. 01 0. 2mol/lTris，l% 5%BSA*0. 01% 0. 2%絡(luò)蛋白，I % -3%海藻糖或1% -5%蔗糖或0. I % -1% EDTA,0. 1% 2%曲拉通X-100或0. 1% 0.5%土溫-20或0.01% 0.5% S9表面活性劑，0. 1% 1%檸檬酸鈉，0. 1% 2% ￠-環(huán)糊精，0. 1% 1% PEG20000,0. 1 % 2%水解干絡(luò)素，0. I % 2%氯化鈉或0. 1% 2%氯化鉀或0. 1% 2%氫氧化鈉，0. 05% 0. 1%疊氮鈉配制而成，HCl調(diào)節(jié)pH值為7.0 8. O。所述脫脂奶粉加入量為按質(zhì)量比0. 5%。 1%。加入10%的脫脂奶粉。所述復(fù)溶液是按照原初始標(biāo)記時(shí)所用膠體金溶液體積的40% 100%進(jìn)行復(fù)溶的。所述氯胺酮或抗氯胺酮多克隆抗體的包被濃度為0. 2 I. Omg/ml，所述抗鼠IgG抗體的包被濃度為0. 2 I. Omg/ml o優(yōu)選地，所述氯胺酮或抗氯胺酮多克隆抗體的包被濃度為0.4mg/ml，所述抗鼠IgG抗體的包被濃度為0. 4mg/mlo所述包被濃度是由劃膜液稀釋獲得的，劃膜液是由終濃度為0. 01-0. 2mol/lTris,1% -3%海藻糖或1% -3%蔗糖或0. I % -1% EDTAjO. 05% -0. I %疊氮鈉配制而成，HCl調(diào)節(jié)pH值為7. 2 7.8。本發(fā)明氯胺酮唾液檢測試紙條，還包括反應(yīng)支持物(5)、上樣墊(I)，所述反應(yīng)支持物(5)上依次相互搭接粘貼的上樣墊(I)、金標(biāo)墊(2)、硝酸纖維膜(3)和吸水墊(4)。所述上樣墊含有上樣墊處理液，處理液配方為0.01 0. 2mol/LTris，0. 1% 2%曲拉通X-IOO或0. I % 0.5%土溫-20或0.01% 0.5% S9表面活性劑，0. 1% 2%檸檬酸鈉，0. I % 2%檸檬酸，0.05% 0.2%聚乙烯吡咯烷酮，0. 1% 2% P -環(huán)糊精，0. 1% 1%明膠，0. 1% 2% a淀粉酶，0. 1% 1%氯化鈉或0. 1% 1%氯化鉀或 0. 1% 1%氫氧化鈉，0. 05% 0. I %疊氮鈉配制而成，上述濃度均為配制處理液后的終濃度，HCl調(diào)節(jié)pH值為8. O 9. O。所述上樣墊為本發(fā)明試紙條的加樣區(qū)，反應(yīng)膜為反應(yīng)區(qū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要，將本發(fā)明提供的試紙條的加樣區(qū)制作為實(shí)際檢測中可接受的裝置，以利于唾液的收集。本發(fā)明提供一種制備上述氯胺酮唾液檢測試紙條的方法，其特征在于，包括如下步驟(I)制備氯胺酮的單 克隆抗體；(2)硝酸纖維膜的制備用劃膜液將與載體蛋白偶聯(lián)的氯胺酮稀釋為終濃度為0. 2 I. Omg/ml的包被抗原、將抗鼠IgG抗體稀釋為濃度為0. 2 I. Omg/ml,噴于硝酸纖維膜上，分別形成反應(yīng)線和質(zhì)控線，且于37°C中干燥4小時(shí)，備用；所述劃膜液由終濃度為0.01-0. 2mol/lTris, 1% -3%海藻糖或 I % -3%蔗糖或 0. 1% -1% EDTA,0. 05% -0. 1%疊氮鈉配制而成，HCl調(diào)節(jié)pH值為7. 2 7. 8。(3)金標(biāo)墊的制備氯胺酮的單克隆抗體標(biāo)記膠體金的pH值為8. O 8. 5，以2 12 ii g/ml膠體金加入氯胺酮的單克隆抗體，搖勻后靜置，按質(zhì)量比0.5%。 1%。，加入10%的脫脂奶粉，搖勻、靜置，離心，取沉淀，用復(fù)溶液按原初始標(biāo)記時(shí)所用膠體金溶液體積的40 % 100 %復(fù)溶，將復(fù)溶后的膠體金標(biāo)記物噴涂于玻璃纖維膜上，37 V，烘干4h，得到金標(biāo)墊；所述復(fù)溶液是由終濃度為0. Ol 0. 2mol/LTris，l% 5% BSA或0. Ol % 0. 2 %絡(luò)蛋白，I % -3%海藻糖或1% -5%蔗糖或0. 1% -I % EDTAjO. 1% 2%曲拉通X-100或0. 1% 0. 5%土溫-20 或 0. 01% 0. 5S9TETR0NIC 1307,0. 1% 1%檸檬酸鈉，0. 1% 2% ￠-環(huán)糊精，0. 1% 1% PEG20000,0. I % 2 %水解干絡(luò)素，0. 1% 2%氯化鈉或0. 1% 2%氯化鉀或0. 1% 2%氫氧化鈉，0. 05% 0. 1%疊氮鈉配制而成，HCl調(diào)節(jié)pH值為7. O 8.0。(4)在反應(yīng)支持物上依次相互搭接粘貼上樣墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維膜和吸水墊。具體地，所述步驟(2)中載體蛋白為BSA、OVA和/或KLH。所述步驟(4)中把上樣墊處理液涂于玻璃纖維上，37 0C，烘干4h，室溫密封保存。依次將上樣墊、膠體金標(biāo)記的氯胺酮單克隆抗體玻璃纖維膜、包被有氯胺酮-BSA(或氯胺酮-OVA或氯胺酮-KLH)和抗鼠IgG多克隆抗體的反應(yīng)膜、吸水墊在反應(yīng)支持物上進(jìn)行組裝；用切條機(jī)按縱向剪切，裁成寬度為4mm的條狀。待檢驗(yàn)合格后鋁箔袋封存。所述反應(yīng)支持物優(yōu)選PVC板；所述上樣墊優(yōu)選(玻璃纖維);所述吸水墊優(yōu)選吸水濾紙。本發(fā)明提供了所述氯胺酮膠體金檢測試紙條在檢測氯胺酮中的應(yīng)用。本發(fā)明采用氯胺酮或抗氯胺酮多克隆抗體和抗鼠IgG分別固相于硝酸纖維膜上(NC膜)，結(jié)合膠體金標(biāo)記的氯胺酮的單克隆抗體，檢測標(biāo)本中的氯胺酮。本發(fā)明通過優(yōu)化膠體金標(biāo)抗體復(fù)溶液、劃膜液配方，優(yōu)化標(biāo)記過程和包被過程的工藝參數(shù)，使唾液檢測試紙條能夠滿足產(chǎn)品設(shè)計(jì)的性能指標(biāo)要求；通過優(yōu)化上樣墊處理液配方，解決了唾液樣本粘稠、含有多種干擾物質(zhì)等阻礙因素。在本發(fā)明提供的復(fù)溶液配方中，與傳統(tǒng)配方相比增加了 3 -環(huán)糊精、海藻糖和水解干絡(luò)素等成分；在劃膜液配方中增加了海藻糖成分；整個(gè)試紙條反應(yīng)系統(tǒng)中選用Tris-HCl緩沖系統(tǒng)替代了傳統(tǒng)方法使用的磷酸緩沖液系統(tǒng)；在標(biāo)記過程中，選用脫脂奶粉替代BSA作為穩(wěn)定劑，能對氯胺酮單克隆抗體和氯金酸溶液的結(jié)合過程起到更好的保護(hù)。通過溶液的配方改進(jìn)提高了本發(fā)明試紙條的靈敏度，與現(xiàn)有的氯胺酮尿液試紙條的最低檢出量為1000ng/ml相比，而本發(fā)明的試紙條的最低檢出量為50ng/ml，靈敏度顯著高于現(xiàn)有技術(shù)的檢測試紙條。本發(fā)明提供的檢測試紙條檢測，以人體唾液為檢測樣本，可有效監(jiān)測唾液中氯胺酮，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，靈敏度高，最低檢出量達(dá)到50ng/ml，該試紙條操作簡單，不需特殊儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易辨，易于推廣，適合于現(xiàn)場檢測。


圖I為本發(fā)明氯胺酮膠體金檢測試紙條的示意圖，其中圖IA為本發(fā)明氯胺酮膠體金檢測試紙條的正面示意圖；圖IB為本發(fā)明氯胺酮膠體金檢測試紙條的側(cè)面示意圖；其中，I :上樣墊；2 :金標(biāo)墊，為含有膠體金標(biāo)記氯胺酮單克隆抗體的玻璃纖維膜；3 :反應(yīng)膜(T :包被氯胺酮單克隆抗體的檢測條帶；C :包被抗鼠IgG的質(zhì)控條帶)；4 :吸水墊；5 :反應(yīng)支持物。圖2為本發(fā)明試紙條檢測結(jié)果示意圖；其中，6為加樣區(qū)，7為反應(yīng)區(qū)，圖2A、2B、2C的反應(yīng)區(qū)和加樣區(qū)同圖2D ;T為反應(yīng)線，C為質(zhì)控線；從左至右依次為圖2A，陽性，C 一條線；圖2B，陰性，C和T共兩條線；圖2C，無效，T 一條線；圖2D，無效，C和T均沒有顯示條線。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。若未特別說明，實(shí)施例中所用的試劑為市售。本發(fā)明中涉及到的百分號“％”，若未特別說明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分t匕，除另有規(guī)定外，是指溶液IOOml中含有溶質(zhì)若干克；液體之間的百分比，是指在20°C時(shí)容量的比例。本發(fā)明用到的試劑，其來源如下化學(xué)試劑(氯金酸、碳酸鉀、Tris、海藻糖、蔗糖、EDTA、曲拉通X-100、土溫20、S9表面活性劑、檸檬酸鈉、檸檬酸、PEG20000、水解干絡(luò)素、氯化鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、疊氮鈉、HC1、￠-環(huán)糊精、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、a淀粉酶等)均外購于國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司，試劑級別為分析純；脫脂奶粉外購于普通超市，品牌為完達(dá)山、光明；牛血清白蛋白(BSA)、絡(luò)蛋白外購于Sigma公司、羅氏公司；氯胺酮的單克隆抗體外購于Medix、Aresta公司；氯胺酮-BSA(或氯胺酮-OVA或氯胺酮-KLH)外購于Medix公司、Aresta、杭州隆基公司、廣州博肯公司；抗鼠IgG外購于杭州隆基公司、廣州博肯公司；
實(shí)施例I氯胺酮膠體金檢測試紙條的制備(參見圖I)I、膠體金的制備準(zhǔn)確量取IOOmL的純化水，放入圓底燒瓶中，加熱、攪拌至沸騰。將2mL 1%氯金酸溶液加入到沸水中，繼續(xù)加熱、攪拌。當(dāng)溶液再次沸騰時(shí)，準(zhǔn)確量取2mLl. 0%檸檬酸三鈉溶液快速加入到溶液中，繼續(xù)煮沸。仔細(xì)觀察溶液顏色，當(dāng)溶液由黃色變成紫黑色，最后變成酒紅色穩(wěn)定后，開始計(jì)時(shí)，繼續(xù)加熱IOmin即可。待溶液溫度恢復(fù)至室溫后，停止攪拌，用純化水恢復(fù)體積至IOOmL,放置在4°C條件下避光保存?zhèn)溆谩?、氯胺酮單克隆抗體金標(biāo)墊的制備2. I所需原料氯胺酮單克隆抗體；上述步驟I制得的膠體金溶液；1.0% K2CO3 ; 10%脫脂奶粉；復(fù)溶液；玻璃纖維。復(fù)溶液配方為按以下組分終濃度進(jìn)行配制0. 01mol/L Tris，2% BSA，2%海藻糖，2%曲拉通X-100，0. 2% ￠-環(huán)糊精，0. 5%檸檬酸鈉，0. 5% PEG20000，0. 2 %水解干絡(luò)素，0. 1%氯化鈉，0. 05%疊氮鈉配制而成，用HCl調(diào)節(jié)pH值為7.4。具體配置方法為(以IOOml為例):取IOOml純化水，依次加入0. OOlmol的Tris、2g BSA、2g海藻糖、0. 2g ￠-環(huán)糊精、0. 5g檸檬酸鈉、0. 5gPEG20000、0. 2g解干絡(luò)素，0. Ig氯 化鈉，常溫?cái)嚢枞芙夂蟀大w積比加入2ml曲拉通X-100,均勻攪拌30min,后加入0. 05g疊氮鈉均勻攪拌lOmin，用HCl調(diào)節(jié)pH值為7. 4，4°C條件下避光保存?zhèn)溆谩?. 2膠體金-氯胺酮抗體標(biāo)記過程氯胺酮抗體標(biāo)記的過程(用2mL膠體金標(biāo)記為例):取2mL制備好的膠體金溶液，用I. 0% K2CO3調(diào)pH值至8. 2后，移液器準(zhǔn)確吸取5mg/mL氯胺酮單克隆抗體0. 8 ii L，緩慢加到膠體金溶液中，搖勻后靜置30min。然后取10 y L的10%脫脂奶粉(終濃度質(zhì)量比0. 5%0)逐滴加入溶液中，搖勻后靜置30min。然后放入離心機(jī)，在12000rpm溫度為4°C的條件下離心30min。完畢后，吸取上清液，棄掉，沉淀用復(fù)溶液按原初始標(biāo)記時(shí)所用膠體金溶液體積的60 %復(fù)溶，混勻。2. 3膠體金標(biāo)記物固相化把I. 25ml的復(fù)溶好的膠體金標(biāo)記物噴涂于0. 6cmX30cm
的玻璃纖維上，370C，烘干4h。鋁箔袋密封，室溫保存?zhèn)溆?。?jīng)實(shí)驗(yàn)確定，氯胺酮單克隆抗體膠體標(biāo)記的其最佳結(jié)合pH值為8. 2，膠體金和抗體的配比為8 u g/ml膠體金。標(biāo)記膠體金經(jīng)復(fù)溶液處理后，按每平方厘米70 u I的量，取膠體金-抗體結(jié)合物溶液，均勻吸附于玻璃纖維上。3、包被硝酸纖維素膜制備反應(yīng)膜將氯胺酮-BSA(用于包被反應(yīng)線T)、羊抗鼠IgG多克隆抗體(用于包被質(zhì)控線C)用劃膜液分別稀釋至0. 4mg/mL，然后分別加入到自動劃膜儀的T杯和C杯中；調(diào)試自動劃膜儀，噴液量設(shè)定為I. 0 ii L/cm,導(dǎo)軌速度8. Ocm/sec,噴嘴I與2間隔6mm。調(diào)試完成后，劃膜包被，形成反應(yīng)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，37°C，烘干4小時(shí)。待檢驗(yàn)合格后鋁箔袋密封，室溫存放備用。劃膜液配方為按以下組分終濃度進(jìn)行配制0. lm0l/lTriS，2%海藻糖、0.4%EDTA,0. 05%疊氮鈉配制而成，用HCl調(diào)節(jié)pH值為7.4。4、上樣墊的制作上樣墊處理液配制方法為按以下組分終濃度進(jìn)行配制0. 03mOl/lTriS，2%曲拉通x-100，0. 5%檸檬酸鈉，0. 2%檸檬酸，0. I %聚乙烯吡咯烷酮，0. 15% ￠-環(huán)糊精，0. 1%明膠，0.15% a淀粉酶，0.2%氯化鈉，0.05%疊氮鈉配制而成，用HCl調(diào)節(jié)pH值為8. O。具體配置方法為(以IOOml為例)取IOOml純化水，邊加熱邊加入0. Ig明膠后攪拌溶解，溶解后恢復(fù)體積和室溫，依次加入0. 003mol的Tris、0. 5g檸檬酸鈉、0. 2g檸檬酸、0. Ig的聚乙烯吡咯烷酮、0. 15g ￠-環(huán)糊精、0. 15ga淀粉酶、0. 2g氯化鈉，常溫?cái)嚢枞芙夂蟀大w積比加入2ml曲拉通X-100,均勻攪拌30min,后加入0. 05g疊氮鈉均勻攪拌IOmin,用HCl調(diào)節(jié)pH值為8. O，2-8°C條件下避光保存?zhèn)溆谩Ｈ∩鲜錾蠘訅|處理液45ml，噴涂于25 X 30cm的玻璃纖維上，37°C，烘干4h，得到上樣墊。鋁箔袋密封，室溫保存?zhèn)溆谩?、氯胺酮膠體金檢測試紙條組成反應(yīng)支持物5 為 6. 5cm X 0. 4cm PCV 板；上樣墊I為2cmX0. 4 cm的玻璃纖維；0. 4cmX 0. 4cm的金標(biāo)墊2含有膠體金標(biāo)記的氯胺酮單抗玻璃纖維膜；I. 8cmX0. 4cm的硝酸纖維膜依次包被氯胺酮-BSA，羊抗鼠IgG，二者間隔6mm ；吸水墊4為2. 7cmX0. 4cm的吸水濾紙；按照由1_4的順序依次組織。上樣墊I為加樣區(qū)，反應(yīng)膜3為反應(yīng)區(qū)。即形成了氯胺酮檢測試紙條(膠體金法)。實(shí)施例2氯胺酮膠體金檢測試紙條的制備I、膠體金的制備準(zhǔn)確量取IOOmL的純化水，放入圓底燒瓶中，加熱、攪拌至沸騰。將2mL 1%氯金酸溶液加入到沸水中，繼續(xù)加熱、攪拌。當(dāng)溶液再次沸騰時(shí)，準(zhǔn)確量取2mLl. 0%檸檬酸三鈉溶液快速加入到溶液中，繼續(xù)煮沸。仔細(xì)觀察溶液顏色，當(dāng)溶液由黃色變成紫黑色，最后變成酒紅色穩(wěn)定后，開始計(jì)時(shí)，繼續(xù)加熱IOmin即可。待溶液溫度恢復(fù)至室溫后，停止攪拌，用純化水恢復(fù)體積至IOOmL,放置在4°C條件下避光保存?zhèn)溆谩?、氯胺酮單克隆抗體金標(biāo)墊的制備2. I所需原料氯胺酮單克隆抗體；上述步驟I制得的膠體金溶液；1. 0% K2CO3 ;10%脫脂奶粉；復(fù)溶液；玻璃纖維。復(fù)溶液按照以下終濃度組分進(jìn)行配制0. 2mol/L Tris，4% BSA，3%蔗糖，0. 2%曲拉通X-100，2% ^ -環(huán)糊精，I %檸檬酸鈉，1% PEG20000,1. 2%水解干絡(luò)素，2%氫氧化鈉，0. I %疊氮鈉配制而成，用HCl調(diào)節(jié)pH值為8. O。2. 2膠體金-氯胺酮抗體標(biāo)記過程氯胺酮抗體標(biāo)記的過程(用2mL膠體金標(biāo)記為例)取2mL制備好的膠體金溶液，用I. 0 % K2CO3調(diào)pH值至8. 4后，移液器準(zhǔn)確吸取5mg/mL氯胺酮單克隆抗體0. 8 y L，緩慢加到膠體金溶液中，搖勻后靜置30min。然后取IOii L的10%脫脂奶粉(終濃度質(zhì)量比0. 5%0)逐滴加入溶液中，搖勻后靜置30min。然后放入離心機(jī)，在12000rpm溫度為4°C的條件下離心30min。完畢后，吸取上清液，棄掉，沉淀用復(fù)溶液按原初始標(biāo)記時(shí)所用膠體金溶液體積的80%復(fù)溶，混勻。2. 3膠體金標(biāo)記物固相化把I. 25ml的復(fù)溶好的膠體金標(biāo)記物噴涂于0. 6cmX30cm的玻璃纖維上，37°C，烘
干4h。鋁箔袋密封，室溫保存?zhèn)溆?。?biāo)記膠體金經(jīng)復(fù)溶液處理后，按每平方厘米70 Ul的量，取膠體金-抗體結(jié)合物溶液，均勻吸附于玻璃纖維上。3、包被硝酸纖維素膜制備反應(yīng)膜將氯胺酮-BSA (用于包被反應(yīng)線T)、羊抗鼠IgG多克隆抗體(用于包被質(zhì)控線C)用劃膜液分別稀釋至0. 4mg/mL，然后分別加入到自動劃膜儀的T杯和C杯中；調(diào)試自動劃膜儀，噴液量設(shè)定為I. O i! L/cm,導(dǎo)軌速度8. Ocm/sec,噴嘴I與2間隔6mm。調(diào)試完成后，劃膜包被，形成反應(yīng)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，37°C，烘干4小時(shí)。待檢驗(yàn)合格后鋁箔袋密封，室溫存放備用。劃膜液配方為按以下組分終濃度進(jìn)行配制0. 2m0l/lTriS，2%蔗糖、0. 2% EDTA，0. I %疊氮鈉配制而成，用HCl調(diào)節(jié)pH值為7.8。4、上樣墊的制作上樣墊處理液配制方法為按以下組分終濃度進(jìn)行配制0. lmol/lTris,0. 5%曲拉通x-100，l. 5%檸檬酸鈉，2%檸檬酸，0. 15%聚乙烯吡咯烷酮，0. 15% ￠-環(huán)糊精，0.8%明膠，1% a淀粉酶，0.6%氯化鈉，0. I %疊氮鈉配制而成，用HCl調(diào)節(jié)pH值為9. O。2_8°C條件下避光保存?zhèn)溆谩?
取上述上樣墊處理液45ml，噴涂于25 X 30cm的玻璃纖維上，37°C，烘干4h，得到上樣墊。鋁箔袋密封，室溫保存?zhèn)溆谩?5、氯胺酮膠體金檢測試紙條組成反應(yīng)支持物5為6. 5cmX0. 4cm PCV板；上樣墊I為2cmX0. 4cm的玻璃纖維；0. 4cmX0. 4cm的金標(biāo)墊2含有膠體金標(biāo)記的氯胺酮單抗玻璃纖維膜；1. 8cmX0. 4cm的硝酸纖維膜依次包被氯胺酮-BSA，羊抗鼠IgG，二者間隔6mm ;吸水墊4為2. 7cmX0. 4cm的吸水濾紙；按照由1-4的順序依次組織。上樣墊I為加樣區(qū)，硝酸纖維素膜3為反應(yīng)區(qū)。即形成了氯胺酮檢測試紙條(膠體金法)。實(shí)施例3檢測方法(參見圖2)將待檢標(biāo)本唾液直接吐入或滴加到實(shí)施例I和實(shí)施例2制得的試紙條加樣區(qū)處或唾液收集裝置中，樣品液通過毛細(xì)作用沿膜前移，3-5分鐘內(nèi)判讀結(jié)果，超出10分鐘，結(jié)果無效。結(jié)果如果樣本中含有氯胺酮(陽性)，則在質(zhì)控線C處出現(xiàn)一條紅色條帶，反應(yīng)線T處沒有條帶。如果樣本中沒有含氯胺酮(陰性)，則在質(zhì)控線C處和反應(yīng)線T處各有一條條帶，共兩條帶。無論標(biāo)本中是否含有氯胺酮，檢測結(jié)果在“C”處都形成一條條帶。此線是質(zhì)控線，如果膠體金失效，此線就不會出現(xiàn)，說明試紙條失效。實(shí)施例4試紙條性能評估試驗(yàn)用于性能評估的氯胺酮唾液檢測試紙條的批號分別為Lotl、Lot2、Lot3，包裝規(guī)格為40人份/盒。氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)品(批號為171228-200605)，購于中國藥品生物制品檢定所。I、最低檢出量評估I. I實(shí)驗(yàn)材料和方法將購于中國藥品生物制品檢定所的氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)品用正常人唾液配制成如下濃度的樣品100、75、50、25、10ng/mL。選擇三批本發(fā)明實(shí)施例I制得的氯胺酮唾液檢測試紙條各15人份。取出檢測試劑卡，將其置于干凈平坦的臺面上，用塑料滴管垂直滴加3滴無氣泡的上述檢測樣本(約IOOyL)于加樣區(qū)內(nèi)，5分鐘內(nèi)觀察結(jié)果，并記錄。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，5分鐘后不再進(jìn)行結(jié)果判讀。每個(gè)檢測樣本重復(fù)3次。I. 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果本發(fā)明的最低檢出量評估資料的試驗(yàn)結(jié)果見表I。結(jié)果顯示，當(dāng)樣本中氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)品的含量為100ng/mL、75ng/mL時(shí)氯胺酮檢測試劑的檢測結(jié)果為陽性，其中氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)品含量為50ng/mL時(shí)，檢測結(jié)果為弱陽性(±)，正確率為100% ;當(dāng)樣本中氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)品的含量為25ng/mL以及10ng/mL以下時(shí)氯胺酮檢測試劑的檢測結(jié)果為陰性(_)，正確率為100%。以上結(jié)果表明本發(fā)明試紙條的檢測最低檢出量不低于50ng/mL。表I最低檢出量評估試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.ー種氯胺酮唾液檢測試紙條，包括反應(yīng)膜(3)和金標(biāo)墊(2)，所述反應(yīng)膜為硝酸纖維膜，其具有分別包被與載體蛋白連接的氯胺酮的反應(yīng)線和ニ抗IgG的質(zhì)控線；所述金標(biāo)墊是包被有膠體金標(biāo)記的氯胺酮單克隆抗體的玻璃纖維膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述氯胺酮唾液檢測試紙條，其特征在于，所述載體蛋白為BSA、OVA和/或KLH，所述的ニ抗IgG為抗鼠IgG抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述氯胺酮唾液檢測試紙條，其特征在于，所述玻璃纖維膜中膠體金標(biāo)記的氯胺酮的單克隆抗體的PH值為8. O 8. 5，膠體金和氯胺 酮單克隆抗體的配比為2 12 μ g/ml膠體金。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述氯胺酮唾液檢測試紙條，其特征在于，所述金標(biāo)墊是將膠體金標(biāo)記的氯胺酮單克隆抗體加入脫脂奶粉，離心后取沉淀，沉淀用復(fù)溶液復(fù)溶后噴涂于玻璃纖維膜上制得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述氯胺酮唾液檢測試紙條，其特征在干，所述復(fù)溶液是由終濃度為O. Ol O. 2mol/LTris，l% 5% BSA或O. 01 % O. 2 %絡(luò)蛋白，I % -3%海藻糖或1% -5%蔗糖或 O. 1% -1% EDTA,0. 1% 2 % 曲拉通 X-100 或 O. I % O. 5%土溫-20 或O.01% 0.5% S9表面活性剤，O. 1% 1%檸檬酸鈉，O. 1% 2% β-環(huán)糊精，O. 1% 1%PEG20000,0. I % 2%水解干絡(luò)素，O. I % 2%氯化鈉或O. I % 2%氯化鉀或O. 1% 2%氫氧化鈉，O. 05% O. I %疊氮鈉配制而成，HCl調(diào)節(jié)pH值為7. O 8. O。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述氯胺酮唾液檢測試紙條，其特征在于，所述氯胺酮或抗氯胺酮多克隆抗體的包被濃度為O. 2 I. Omg/ml,所述抗鼠IgG抗體的包被濃度為O. 2 I. Omg/ml ο
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述氯胺酮唾液檢測試紙條，其特征在于，所述包被濃度是由劃膜液稀釋獲得的，劃膜液是終濃度為O. 01-0. 2mol/lTris，1% -3%海藻糖或1% -3%蔗糖或O. 1% -1% EDTA,0. 05% -O. 1%疊氮鈉；HC1 調(diào)節(jié) pH 值為 7. 2 7. 8。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述氯胺酮唾液檢測試紙條，其特征在于，還包括反應(yīng)支持物(5)、上樣墊(I)、吸水墊(4);所述反應(yīng)支持物(5)上依次相互搭接粘貼的上樣墊(I)、金標(biāo)墊(2)、反應(yīng)膜(3)和吸水墊(4)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述氯胺酮唾液檢測試紙條，其特征在于，所述上樣墊含有上樣墊處理液,處理液配方為0.01 O. 2mol/LTris,0. 1% 2%曲拉通X-100或O. 1% 0.5%土溫-20或O. 01% O. 5% S9表面活性剤，O. 1% 2%檸檬酸鈉，O. 1% 2%檸檬酸，O.05% O. 2%聚こ烯吡咯烷酮，O. 1% 2% β-環(huán)糊精，O. 1% 1%明膠，O. 1% 2%α淀粉酶，O. 1% 1%氯化鈉或者O. 1% 1%氯化鉀或O. 1% 1%氫氧化鈉，O. 05% 0.I %疊氮鈉，所述濃度均為配置后的終濃度；HC1調(diào)節(jié)pH值為8. O 9. O。
10.ー種制備權(quán)利要求1-9任一所述氯胺酮唾液檢測試紙條的方法，其特征在于，包括如下步驟 .1)制備氯胺酮的單克隆抗體； .2)硝酸纖維膜的制備用劃膜液將與載體蛋白偶聯(lián)的氯胺酮稀釋為濃度為O.2 .1.Omg/ml、將抗鼠IgG抗體稀釋為濃度為O. 2 I. Omg/ml,噴于硝酸纖維膜上,分別形成反應(yīng)線和質(zhì)控線，且于37°C中干燥4小時(shí)，備用；所述劃膜液由終濃度為O. 01-0. 2mol/lTris,1% -3%海藻糖或1% -3%蔗糖或O. 1% -1% EDTA,0. 05% -.O. I %疊氮鈉配制而成，HCl調(diào)節(jié)pH值為7. 2 7.8。
3)金標(biāo)墊的制備氯胺酮的單克隆抗體標(biāo)記膠體金的pH值為8.O 8. 5，以2 12μ g/ml膠體金加入氯胺酮的單克隆抗體，搖勻后靜置，按質(zhì)量比0.5%。 1%。，加入10%的脫脂奶粉，搖勻、靜置，離心，取沉淀，用復(fù)溶液按原初始標(biāo)記時(shí)所用膠體金溶液體積的40% 100 %復(fù)溶，將復(fù)溶后的膠體金標(biāo)記物噴涂于玻璃纖維膜上，370C，烘干4h，得到金標(biāo)墊；所述復(fù)溶液是由終濃度為O. 01 O. 2mol/LTris，l% 5% BSA或O. 01 % O. 2%絡(luò)蛋白，1% -3%海藻糖或1% -5%蔗糖或O. 1% -1% EDTA,0. 1% 2%曲拉通X-100或O.1% O. 5% 土溫-20或O. 01% O. 5% S9表面活性剤，O. 1% 1%檸檬酸鈉，O. 1% 2% β-環(huán)糊精，O. 1% 1% PEG20000,0. I % 2 %水解干絡(luò)素，O. 1% 2%氯化鈉或O.1% 2%氯化鉀或O. 1% 2%氫氧化鈉，O. 05% O. 1%疊氮鈉配制而成，HCl調(diào)節(jié)pH值為7. O 8. O。
4)在反應(yīng)支持物上依次相互搭接粘貼上樣墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維膜和吸水墊。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種氯胺酮膠體金唾液檢測試紙條，包括反應(yīng)膜和金標(biāo)墊，所述反應(yīng)膜是在硝酸纖維膜(NC膜)上分別包被與載體蛋白連接的氯胺酮和質(zhì)控二抗IgG，形成反應(yīng)線和質(zhì)控線；所述金標(biāo)墊包被有膠體金標(biāo)記的氯胺酮單克隆抗體，應(yīng)用膜層析競爭抑制法，檢測唾液標(biāo)本中氯胺酮。應(yīng)用本發(fā)明試紙條，可有效監(jiān)測唾液中氯胺酮，檢測特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，靈敏度高，最低檢出量達(dá)到50ng/ml，該試紙條操作簡單，不需特殊儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易辨，易于推廣，適合于現(xiàn)場檢測。
文檔編號G01N33/577GK102636647SQ201210093290
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者戴國華 申請人:戴國華