專利名稱：基于mosfet結構的dna電化學傳感器及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物傳感器技術領域，具體涉及一種基于MOSFET結構的DNA電化學傳感器及其制備方法。
背景技術：
傳感器與通信系統(tǒng)和計算機共同構成現(xiàn)代信息處理系統(tǒng)。傳感器相當于人的感官，是計算機與自然界及社會的接ロ，是為計算機提供信息的工具。傳感器通常由敏感(識別)元件、轉換元件、電子線路及相應結構附件組成。生物傳感器是指用固定化的生物體成分(酶、抗原、抗體、激素等)或生物體本 身(細胞、細胞器、組織等)作為感元件的傳感器。電化學生物傳感器則是指由生物材料作為敏感元件，電極(固體電極、離子選擇性電極、氣敏電極等)作為轉換元件，以電勢或電流為特征檢測信號的傳感器。由于使用生物材料作為傳感器的敏感元件，所以電化學生物傳感器具有高度選擇性，是快速、直接獲取復雜體系組成信息的理想分析工具。ー些研究成果已在生物技術、食品エ業(yè)、臨床檢測、醫(yī)藥エ業(yè)、生物醫(yī)學、環(huán)境分析等領域獲得實際應用。電化學DNA傳感器是近幾年迅速發(fā)展起來的一種全新思想的生物傳感器。其用途是檢測基因及一些能與DNA發(fā)生特殊相互作用的物質。電化學DNA傳感器是利用單鏈DNA(ssDNA)或基因探針作為敏感元件固定在固體電極表面，加上識別雜交信息的電活性指示劑(稱為雜交指示劑)共同構成的檢測特定基因的裝置。其工作原理是利用固定在電極表面的某一特定序列的ssDNA與溶液中的同源序列的特異識別作用(分子雜交)形成雙鏈DNA(dsDNA)(電極表面性質改變)，同時借助一能識別ssDNA和dsDNA的雜交指示劑的電流響應信號的改變來達到檢測基因的目的。電化學DNA傳感器離實用化還有相當距離，主要是傳感器的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、靈敏度等都還有待于提高。有關DNA修飾電極的研究除對于基因檢測有重要意義外，還可將DNA修飾電極用于其它生物傳感器的研究，用于DNA與外源分子間的相互作用研究，如抗癌藥物篩選、抗癌藥物作用機理研究；以及用于檢測DNA結合分子。無疑，它將成為生物電化學的ー個非常有生命力的前沿領域。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種基于MOSFET結構的DNA電化學傳感器,解決了現(xiàn)有技術中生物傳感器技術不能進行檢測DNA的合成和測序等問題。為了解決現(xiàn)有技術中的這些問題，本發(fā)明提供的技術方案是一種基于MOSFET結構的DNA電化學傳感器，包括CMOS襯底，所述CMOS襯底上沉積有氮化硅層，所述氮化硅層上覆蓋ニ氧化硅絕緣層；其特征在于所述ニ氧化硅絕緣層為具有微孔結構的微孔陣列，所述微孔側壁上SiO2絕緣層通過羧基偶聯(lián)有DNA探針作為敏感元件。優(yōu)選的，所述DNA探針具有SEQ No : I 3的連續(xù)核苷酸序列。
典型的，連續(xù)核苷酸序列列表如下SEQ No I5'-GAGGATCCAGAATTCTCGAGTT-3'
SEQ No 25，-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3，
SEQ No 3 5，-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3，~這些DNA探針是通用接頭的互補序列，可以檢測DNA的合成和測序。優(yōu)選的，所述氮化硅層的厚度為100-300納米。優(yōu)選的，所述Si02絕緣層的厚度為1-10微米。本發(fā)明的另ー目的在于提供一種所述的基于MOSFET結構的DNA電化學傳感器的制備方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(I)采用低壓化學氣相淀積方法在CMOS襯底上沉積形成氮化硅層，井根據微孔陣列的排布在所述氮化硅層上覆蓋正性光刻膠，通過正膠顯影溶解已曝光的光刻膠，然后采用低壓化學氣相淀積方法生長SiO2絕緣層；(2)進行正性光刻膠的剝離，并暴露作為襯底的氮化硅層，即在氮化硅層上形成微孔結構；(3)將SiO2絕緣層的微孔側壁采用羧基化方法進行羧基化處理，然后使將氨基化的DNA探針與SiO2絕緣層表面的羧基進行鍵合偶聯(lián)形成敏感元件。優(yōu)選的，所述方法步驟(I)中采用低壓化學氣相淀積方法在CMOS襯底上沉積形成氮化硅層的方法是以ニ氯ニ氫硅和氨氣為反應原料在壓カ為O. I 10托范圍內，溫度為700-800 V的條件下進行沉積獲得氮化硅層。優(yōu)選的，所述方法步驟(I)中在所述氮化硅層上覆蓋正性光刻膠的方法為旋轉涂膠方法。優(yōu)選的，所述方法步驟(I)中正性光刻膠的曝光條件為光的波長是248nm，光源是氟化氬激光光源；曝光劑量為lOOmJ/cm2，曝光后正膠顯影所用的正膠顯影液為四甲基氫氧化銨，所述四甲基氫氧化銨的當量濃度為O. 2-0. 3。優(yōu)選的，所述方法步驟(3)中羧基化方法采用的試劑為丁ニ酸，羧基化方法的溫度控制在75で。優(yōu)選的，所述方法步驟(3)中偶聯(lián)反應中以I-こ基-3-(3-ニ甲基氨丙基)-碳化ニ亞胺(EDC)為羧基的活化試劑。優(yōu)選的，所述方法步驟(3)中氨基化的DNA探針具有氨基化處理的SEQ No : I 3的連續(xù)核苷酸序列。典型的，氨基化的DNA探針序列選自以下的任意ー種
5 '-Nh2-Gaggatccagaattctcgagtw;
5，-NH2-CC ATCTC ATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3，；
5’ -NH2-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-35 ο
本發(fā)明的另ー目的在于提供一種所述的基于MOSFET結構的DNA電化學傳感器在DNA測序方面的應用一般的DNA電化學傳感器可以檢測DNA之間的相互結合。本發(fā)明提出了ー種DNA電化學傳感器結構可以檢測DNA的合成和測序。這種DNA電化學傳感器結構是在MOSFET結構的基礎上，構建百萬個微孔陣列，微孔的結構是三明治式的三層結構，并且在中間層進
行羧基化。其可以按照如下步驟進行制備(I)在CMOS的基礎上用LPCVD (低壓化學氣相淀積)方法生長出ー層100-300納米的Si3N4。(2)在Si3N4上將要形成微孔底部的部分用正性光刻膠覆蓋，那樣在要形成微孔側壁的地方生長SiO2大約1-10微米。(3)用紫外光將正性光刻膠剝離，這樣會露出底部的Si3N4層。(4)用羧基化方法將SiO2進行羧基化(5)將氨基化的引物與SiO2的羧基進行鍵合。相對于現(xiàn)有技術中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明DNA電化學傳感器采用具有微孔結構的微孔陣列作為敏感元件，在微孔結構內設置DNA探針。這種微孔結構不但可以檢測DNA探針與DNA靶標之間的結合而且可以在微孔中進行模板擴增有利于利用PH檢測功能來檢測DNA的合成，進而具有DNA測序功倉^:。


下面結合附圖及實施例對本發(fā)明作進ー步描述圖I為Si3N4的形成；圖2為Si3N4上的光刻膠；圖3為光刻和顯影后的光刻膠；圖4為SiO2的生成；圖5為光刻膠剝離后SiO2形成的微孔結構示意圖；圖6為DNA探針與羧基的偶聯(lián)后的微孔結構示意圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例對上述方案做進ー步說明。應理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據具體廠家的條件做進ー步調整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。實施例基于MOSFET結構的DNA電化學傳感器制備示例一、在CMOS結構上生長Si3N4用LPCVD (低壓化學氣相淀積)可以獲得就有良好覆蓋能力和高度均勻性的Si3N4膜。在減壓和溫度在700-800°C的條件下，用ニ氯ニ氫硅(SiCl2H2)和氨氣(NH3) LPCVD淀積制作Si3N4。反應方程式如下3SiCl2H2 (氣態(tài))+4NH3 — Si3N4 (固態(tài))+6HC1 (氣態(tài))+6 (氣態(tài))；
形成厚約100_300nm的氮化硅層(如圖I所示為Si3N4的形成)。
ニ、用旋轉涂膠方法在Si3N4上鋪ー層正性化學放大深紫外光刻膠(CADUV膠)(I)滴膠。當硅片靜止或旋轉的非常緩慢時，光刻膠被分滴在硅片上。(2)旋轉鋪開。快速加速硅片的旋轉到一高的轉速(rpm)使光刻膠伸展到整個硅片表面。光刻膠的厚度正比于I/(RPM)1/2。(3)旋轉甩棹。甩去多余的光刻膠，在硅片上得到均勻的光刻膠膠膜覆蓋層。(4)溶劑揮發(fā)。以固定轉速繼續(xù)旋轉ー涂膠的硅片，直至溶劑揮發(fā)，光刻膠膠膜幾乎干燥。如圖2所示為獲得的1-5 的光刻膠層。三、光刻膠的曝光及顯影在曝光過程中，從光源發(fā)出的光通過對準的掩膜版。版上有不透明和透明區(qū)域，這些區(qū)域形成了要轉移到硅片表面的圖形。曝光的目的就是要把版上圖形精確的復制成光刻膠上的最終圖像。所用的光的波長是248nm，光源是氟化氬(ArF)激光光源。曝光劑量為IOOmJ/cm2。正膠顯影包含顯影液和光刻膠之間的化學反應從而溶解已曝光的光刻膠。所用的正膠顯影液為四甲基氫氧化銨(TMAH)。TMAH顯影液的當量濃度為0. 2-0. 3時，選擇性比較好且使光刻膠對比度高。百萬分之幾的表面活性劑通常被添加到TMAH顯影液中，減少了光刻膠表面的任何殘留。TMAH顯影液的清洗僅需要去離子(DI)水。經曝光和顯影后的圖形如圖3所示。四、SiO2的生長采用LPCVD方法制備SiO2的做法是低壓650_750°C下，熱分解TE0S，可以加入02。由于氣體分子在表面的擴散速度快，這種方法可以制作均勻性優(yōu)異的Si02。液態(tài)的TEOS源通常用載流氣體鼓泡方式攜帯(例如以N2、O2或者He)。液態(tài)源被其自身的獨立的溫度源加熱。進入反應器的液態(tài)源的濃度受到載流氣體的速率和液態(tài)源溫度的控制。也可以采用在較低溫度下(約450°C )氧化硅烷的方法LPCVD淀積SiO2,如圖4所示。五、光刻膠的剝離去膠是通過氧原子與光刻膠在等離子體環(huán)境中發(fā)生反應來去除光刻膠的。原子氧
(0)通過微波或RF能量分解氧分子產生。常常加入N2或H2來提高去膠性能并加強對殘留聚合物的去除。因而典型的去膠機氣體使用的是02/N2。因為光刻膠的基本成分是碳氫聚合物。氧原子很快與光刻膠反應生成揮發(fā)性的一氧化碳、ニ氧化碳和水等主要生成物。這些生成物被真空系統(tǒng)抽走。如圖5為光刻膠剝離后SiO2形成的微孔。六、微孔側壁SiO2的羧基化取50ml的こ腈于燒杯中，再取3g 丁ニ酸，加入到盛有50mlこ腈的燒瓶中，連續(xù)攪拌，回流加熱到60°C，直到丁ニ酸完全溶解。在真空條件下，將燒杯中的溶液倒入微孔陣列中，回流升溫至75°C，連續(xù)震蕩保溫24小吋。將產物冷卻到65°C，熱抽濾后，用無水こ醇和去離子水的混合液離心洗滌3次，120°C真空干燥，即得到羧基化的Si02。七、DNA探針與羧基的偶聯(lián)在10mg/mL I-こ基-3_ (3_ ニ甲基氨丙基)-碳化ニ亞胺(EDC)存在下，5’-NH2末端DNA探針(由金斯瑞合成)0.5 PM與微孔表面羧基發(fā)生偶聯(lián)反應，使得DNA探針通過化學鍵在微孔表面進行結合。偶聯(lián)方法是加入IOOiiLO. lmol/L 2-嗎啉代こ基磺酸(MES pH4. 6)緩沖溶液、適量DNA探針溶液和3. 6 ii L 10mg/mL新配制EDC水溶液，漩渦混勻后在暗處使用旋轉混合器反應lh。然后姆0. 5h補加I. 8 ii L lOOmg/mL新配制的EDC水溶液。反應總時間為2h。結束反應后加入I. OOmL 0. 02% Tween 20，混勻后離心沉降，棄去上層清液(對沒有熒光標記的DNA探針)。再加入I. OOmL 0. I % SDS溶液洗滌微孔并棄去離心清液，在4°C儲存。如圖6為DNA探針與羧基的偶聯(lián)后的微孔結構。其中5’_NH2末端DNA探針(由金斯瑞合成)的連續(xù)核苷酸序列選自:5, -NH2-GAGGATCCAGAATTCTCGAGTT-3';或 5 ’ -NH2-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG_3 ’ ；或 5 ’ -NH2- CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3，。上述實例只為說明本發(fā)明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人是能夠了解本發(fā)明的內容并據以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據本發(fā)明精神實質所做的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種基于MOSFET結構的DNA電化學傳感器，包括CMOS襯底，所述CMOS襯底上沉積有氮化硅層，所述氮化硅層上覆蓋二氧化硅絕緣層；其特征在于所述二氧化硅絕緣層為具有微孔結構的微孔陣列，所述微孔側壁上SiO2絕緣層通過羧基偶聯(lián)有DNA探針作為敏感元件。
2.根據權利要求I所述的基于MOSFET結構的DNA電化學傳感器，其特征在于所述DNA探針具有SEQ No r3的連續(xù)核苷酸序列。
3.根據權利要求I所述的基于MOSFET結構的DNA電化學傳感器，其特征在于所述氮化硅層的厚度為100-300納米。
4.根據權利要求I所述的基于MOSFET結構的DNA電化學傳感器，其特征在于所述Si02絕緣層的厚度為1-10微米。
5.—種權利要求I所述的基于MOSFET結構的DNA電化學傳感器的制備方法,其特征在于所述方法包括以下步驟 (1)采用低壓化學氣相淀積方法在CMOS襯底上沉積形成氮化硅層，并根據微孔陣列的排布在所述氮化硅層上覆蓋正性光刻膠，通過正膠顯影溶解已曝光的光刻膠，然后采用低壓化學氣相淀積方法生長SiO2絕緣層； (2)進行正性光刻膠的剝離，并暴露作為襯底的氮化硅層，即在氮化硅層上形成微孔結構； (3)將SiO2絕緣層的微孔側壁采用羧基化方法進行羧基化處理，然后使將氨基化的DNA探針與SiO2絕緣層表面的羧基進行鍵合偶聯(lián)形成敏感元件。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述方法步驟(I)中采用低壓化學氣相淀積方法在CMOS襯底上沉積形成氮化娃層的方法是以二氯二氫娃和氨氣為反應原料在壓力為0. riO托范圍內，溫度為700-800°C的條件下進行沉積獲得氮化硅層。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述方法步驟(I)中在所述氮化硅層上覆蓋正性光刻膠的方法為旋轉涂膠方法。
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述方法步驟(I)中正性光刻膠的曝光條件為光的波長是248nm，光源是氟化氬激光光源；曝光劑量為lOOmJ/cm2，曝光后正膠顯影所用的正膠顯影液為四甲基氫氧化銨，所述四甲基氫氧化銨的當量濃度為0. 2-0. 3。
9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述方法步驟(3)中羧基化方法采用的試劑為丁二酸，羧基化方法的溫度控制在75°C。
10.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述方法步驟(3)中偶聯(lián)反應中以I-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)為羧基的活化試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于MOSFET結構的DNA電化學傳感器，包括CMOS襯底，所述CMOS襯底上沉積有氮化硅層，所述氮化硅層上覆蓋二氧化硅絕緣層；其特征在于所述二氧化硅絕緣層為具有微孔結構的微孔陣列，所述微孔側壁上SiO2絕緣層通過羧基偶聯(lián)有DNA探針作為敏感元件。該微孔結構不但可以檢測DNA探針與DNA靶標之間的結合而且可以在微孔中進行模板擴增有利于利用pH檢測功能來檢測DNA的合成，進而具有DNA測序功能。
文檔編號G01N27/26GK102628827SQ201210103139
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月10日 優(yōu)先權日2012年4月10日
發(fā)明者何越, 楊楠, 臧伯瑋, 艾洪新 申請人:凱晶生物科技(蘇州)有限公司