專利名稱：使用hplc-dad同時測定丹紅注射液中6種有效成分含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥質(zhì)量檢測領(lǐng)域，具體是一種使用HPLC-DAD同時測定丹紅注射液中6種有效成分含量的方法。
背景技術(shù)：
丹紅注射液是由傳統(tǒng)的活血化瘀中藥丹參、紅花提取的復方制劑，具有活血化瘀，改善微循環(huán)，降低血液黏度，加快血液流速，清除氧自由基，保護細胞免受氧化損傷，抑制動脈粥樣硬化等作用。在臨床上廣泛用于冠心病、心絞痛、心肌梗死、急性腦梗死、慢性肺心 病、血栓閉塞性脈管炎、萎縮性胃炎以及高血壓腎病等。丹紅注射液的君藥丹參主要含丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A等水溶性成分。《國家中成藥標準匯編、內(nèi)科、心系分冊》中關(guān)于丹紅注射液的國家藥品標準(試行)頒布件中僅對丹參素鈉和原兒茶醛2種有效成分進行質(zhì)量控制。由于丹紅注射液中所含成分比較復雜，難以將6種有效成分與其他成分很好的分離，達到HPLC定量測定的要求。鑒于這一原因，故建立一種同時測定丹紅注射液中6種有效成分含量的方法具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種使用HPLC-DAD同時測定丹紅注射液中6種有效成分含量的方法。可以有效解決以丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A作為指標性成分，同時進行含量測定，為丹紅注射液質(zhì)量標準奠定基礎(chǔ)的問題，實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方案是
一種使用HPLC-DAD同時測定丹紅注射液中6種有效成分含量的方法，其特征在于包括如下步驟
1)精密吸取丹紅注射液，加超純水稀釋，搖勻，經(jīng)濾膜濾過，即得供試品溶液；
2)精密稱取對照品丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A，分別置容量瓶中，加超純水溶解，稀釋，混勻，作為對照品儲備溶液，于4°C冰箱內(nèi)冷藏備用；
3)再分別精密吸取6種對照品儲備溶液，加超純水稀釋，準確配制丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A的混合對照品溶液；
4)用以下色譜條件進行HPLC-DAD法檢測色譜柱EclipseXDB-C18 4.6X 150 mm, 5U m ;流動相包括流動相A 乙腈和流動相B :體積百分含量0. 05% - 0. 1%的磷酸水溶液；采用梯度洗脫方式，乙腈占流動相的體積比在下述范圍內(nèi)隨著時間的增加而增加0-6 min,5%-5% ；6-16 min, 5%-15% ； 16-30 min, 15%-26% ；35-40 min, 26%_27% ;DAD 檢測器檢測波長檢測丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A使用270-290 nm，檢測咖啡酸、迷迭香酸使用 320 -340nm ;柱溫25_35°C ;流速:0. 7-1. 2 mL mirT1 ；
5)取混合對照品溶液，分別用超純水稀釋不同的倍數(shù)，取上述稀釋混合對照品溶液與原混合對照品溶液各進樣10 u 1，記錄色譜圖和峰面積，分別以6種有效成分色譜峰的峰面積Y為縱坐標，以濃度X，y g mL-1為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)； 6)分別取不同批號的丹紅注射液，按供試品溶液的制備方法配制樣品溶液，分別進樣10 u L，測定峰面積，每批樣品測定3次，計算得到不同批號丹紅注射液中丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的含量。所述的方法，其特征在于步驟I)中精密吸取丹紅注射液2mL，置IOmL容量瓶中，力口超純水稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0. 45 um濾膜濾過，即得供試品溶液。所述的方法，其特征在于步驟2)中精密稱取對照品丹參素鈉6. 55mg、原兒茶醛
5.05mg、咖啡酸I. 55mg、迷迭香酸5. 45mg、丹酚酸BIO. 95mg、丹酚酸A5. 60mg，分別置5mL容量瓶中，加超純水溶解，稀釋至刻度，混勻，作為對照品儲備溶液，于4°C冰箱內(nèi)冷藏備用。所述的方法，其特征在于步驟3)中再分別精密吸取一定量的6種對照品儲備溶液，加超純水稀釋，準確配制丹參素鈉I. 310 mg mL'原兒茶醒0. 101 mg mL'咖啡酸
0.0041 mg .mL'迷迭香酸0. 109 mg .mL'丹酌 酸B 0. 219 mg .mL'丹酌 酸A3. 360 mg .mL-1的混合對照品溶液。所述的方法，其特征在于步驟4)中流動相B磷酸水溶液的體積百分含量為0. 1%。所述的方法，其特征在于步驟4)中DAD檢測器檢測波長檢測丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A使用280 nm，檢測咖啡酸、迷迭香酸使用330nm。所述的方法，其特征在于步驟4)中柱溫是30°C。所述的方法,其特征在于步驟4)中流速是I. 0 mL mirT1。所述的方法，其特征在于步驟5)中取混合對照品溶液，分別用超純水稀釋I. 25，5，10，20，100倍，取上述5種稀釋混合對照品溶液與原混合對照品溶液各自進樣10 yl，記錄色譜圖和峰面積，分別以6種有效成分色譜峰的峰面積Y為縱坐標，以濃度X，y g mL—1為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。本發(fā)明采用HPLC - DAD法，運用梯度洗脫測定了丹紅注射液中丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A 6種有效成分的含量。計算得丹紅注射液中6種有效成分的線性關(guān)系，結(jié)果見表I。表I 6種有效成分的線性關(guān)系fc=6)
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本發(fā)明的方法簡便、靈敏度高，重現(xiàn)性好，解決了目前丹紅注射液的質(zhì)量評價不能全面地反映丹紅注射液質(zhì)量的問題，以對丹紅注射液的質(zhì)量進行多指標的控制，為科學評價和有效控制丹紅注射液的質(zhì)量提供更科學的依據(jù)。


圖1是丹參素鈉對照品的紫外可見吸收光譜 圖2是原兒茶醛對照品的紫外可見吸收光譜 圖3是咖啡酸對照品的紫外可見吸收光譜 圖4是迷迭香酸對照品的紫外可見吸收光譜 圖5是丹酚酸B對照品的紫外可見吸收光譜 圖6是丹酚酸A對照品的紫外可見吸收光譜 圖7是混合對照品溶液在280nm的色譜 圖8是混合對照品溶液在330nm的色譜 圖9是供試品溶液(No. 110934)在280nm的色譜 圖10是供試品溶液(No. 110934)在330nm的色譜 圖7至圖10中，I.丹參素鈉；2.原兒茶醛；3.咖啡酸；4.迷迭香酸；5.
丹酚酸B ;6.丹酚酸A。
具體實施例方式材料
Agilent 1200型高效液相色譜系統(tǒng)(包括G1311A四元梯度泵、G1316A柱溫箱、G131 二極管陣列檢測器、G1315D DAD檢測器、G1322A在線脫氣機和化學工作站)。超純水儀(美國Milipore公司)；XS105DualRange分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司)。丹紅注射液(菏澤步長制藥有限公司，規(guī)格10 mL/支)；丹參素鈉對照品(批號110855-200809)、原兒茶醛對照品(批號110810-201007)、咖啡酸對照品(批號20120211)、迷迭香酸對照品(批號111871-201102)購于中國藥品生物制品檢定所；丹酚酸B對照品(批號20110822)、丹酚酸A對照品(批號20120207)購于上海源葉生物科技有限公司。乙腈(批號102489)、甲醇(批號101437)購于美國Fisher公司，均為色譜純；磷酸，(批號76643827，國藥集團化學有限公司)為分析純；水為超純水。方法與結(jié)果
2.I供試品溶液的制備精密吸取丹紅注射液2 mL，置10 mL容量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0. 45 um濾膜濾過，即得供試品溶液?；旌蠈φ掌啡芤旱闹苽渚芊Q取對照品丹參素鈉6.55 mg、原兒茶醛5.05 mg、咖啡酸1.55 mg、迷迭香酸5.45 mg、丹酚酸B 10.95 mg、丹酚酸A 5. 60 mg，分別置5 mL容量瓶中，加超純水溶解，稀釋至刻度，混勻，作為對照品儲備溶液，于4°C冰箱內(nèi)冷藏備用。再分別精密吸取一定量的6種對照品儲備溶液，加超純水稀釋，準確配制丹參素鈉 I. 310 mg ml/1、原兒茶醒 0. 101 mg mL4、咖啡酸 0. 0041 mg mL'迷迭香酸 0. 109mg mL'丹酹酸B 0. 219 mg mL'丹酹酸A 3. 360 mg mL-1的混合對照品溶液。色譜條件 Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6X150 mm, 5 u m);流動相采用二元體系，A為乙腈，B為0. 1%磷酸水溶液，梯度洗脫方式為0-6 min，5%A ;6_16 min，5%A_15%A ；16-30 min, 15%A-26%A ；30-40 min, 26%A-27%A ;柱溫為 30°C ;流速為 I. 0 mL .mirT1 ;結(jié)果得到如圖I-圖6所示的6種對照品的紫外-可見光譜，由圖I及供試品溶液色譜圖確定檢測波長為280 nm (測定丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A)，330 nm (測定咖啡酸、迷迭香酸)。在所選擇的色譜條件下，樣品液中6種成分與其他共存峰得到很好的分離，混合對照品溶液及供試品溶液的色譜圖見圖7-圖10。
2.4線性關(guān)系考察取混合對照品溶液，分別用超純水稀釋1.25，5，10，20，100倍。取上述5種稀釋混合對照品溶液與原混合對照品溶液各進樣10 yl，記錄色譜圖和峰面積，分別以6種有效成分色譜峰的峰面積⑴為縱坐標，以濃度(X，y g mL-1)為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表I。表I 6種有效成分的線性關(guān)系(/7=6)
權(quán)利要求
1.一種使用HPLC-DAD同時測定丹紅注射液中6種有效成分含量的方法，其特征在于包括如下步驟 · 1)精密吸取丹紅注射液，加超純水稀釋，搖勻，經(jīng)濾膜濾過，即得供試品溶液； ·2)精密稱取對照品丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A，分別置容量瓶中，加超純水溶解，稀釋，混勻，作為對照品儲備溶液，于4°C冰箱內(nèi)冷藏備用； ·3)再分別精密吸取6種對照品儲備溶液，加超純水稀釋，準確配制丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A的混合對照品溶液； ·4)用以下色譜條件進行HPLC-DAD法檢測色譜柱EclipseXDB-C18 4.6X 150 mm, 5U m ;流動相包括流動相A :乙腈和流動相B 0. 05% - 0. 1%(體積百分含量)的磷酸水溶液；采用梯度洗脫方式，乙腈占流動相的體積百分比在下述范圍內(nèi)隨著時間的增加而增加0-6min，5%-5% ;6-16 min，5%_15% ; 16-30 min，15%-26% ；35-40 min, 26%_27% ;DAD 檢測器檢測波長檢測丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A使用270-290 nm，檢測咖啡酸、迷迭香酸使用 320 -340nm ;柱溫25_35°C，優(yōu)選 30°C ;流速:0. 7-1. 2 mL mirT1 ； ·5)取混合對照品溶液，分別用超純水稀釋不同的倍數(shù)，取上述稀釋混合對照品溶液與原混合對照品溶液各進樣10 u 1，記錄色譜圖和峰面積，分別以6種有效成分色譜峰的峰面積Y為縱坐標，以濃度X，y g mL-1為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)； ·6)分別取不同批號的丹紅注射液，按供試品溶液的制備方法配制樣品溶液，分別進樣10 u L，測定峰面積，每批樣品測定3次，計算得到不同批號丹紅注射液中丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的含量。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟I)中精密吸取丹紅注射液2mL，置IOmL容量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0. 45 um濾膜濾過，即得供試品溶液。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟2)中精密稱取對照品丹參素鈉6.55mg、原兒茶醒5. 05mg、咖啡酸I. 55mg、迷迭香酸5. 45mg、丹酹酸BIO. 95mg、丹酹酸A5. 60mg,分別置5mL容量瓶中，加超純水溶解，稀釋至刻度，混勻，作為對照品儲備溶液，于4°C冰箱內(nèi)冷藏備用。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟3)中再分別精密吸取一定量的6種對照品儲備溶液，加超純水稀釋，準確配制丹參素鈉I. 310 mg 、原兒茶醛0. 101 mg 、咖啡酸 0. 0041 mg mL'迷迭香酸 0. 109 mg mL—1、丹酚酸 B 0. 219 mg mL—1、丹酚酸 A3. 360mg ml/1的混合對照品溶液。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟4)中流動相B磷酸水溶液的體積百分含量最佳為0. 1%。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟4)中DAD檢測器檢測波長檢測丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A使用280 nm左右，檢測咖啡酸、迷迭香酸使用330nm左右。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟4)中流速最佳是I.0 mL mirT1。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟5)中取混合對照品溶液，分別用超純水稀釋I. 25，5，10，20，100倍，取上述5種稀釋混合對照品溶液與原混合對照品溶液各進樣·10 u 1，記錄色譜圖和峰面積，分別以6種有效成分色譜峰的峰面積Y為縱坐標，以濃度X，u g mL-1為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種HPLC-DAD同時測定丹紅注射液中丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A6種有效成分含量的方法。實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方案是分別制備供試品溶液和對照品溶液，采用HPLC-DAD法進行梯度洗脫，同時測定丹紅注射液中丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A6種有效成分的含量，本發(fā)明方法簡便、靈敏度高，重現(xiàn)性好，解決了目前丹紅注射液中僅控制2種有效成分的含量，不能全面地反映丹紅注射液質(zhì)量的問題，以對丹紅注射液的質(zhì)量進行多指標的控制，為科學評價和有效控制丹紅注射液的質(zhì)量提供更科學的依據(jù)。
文檔編號G01N30/02GK102621246SQ20121010725
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者萬海同, 付巍, 何昱, 周惠芬, 張恒義, 張茹萍, 蓋玉權(quán), 趙濤, 邢攀科, 黃翔 申請人:浙江中醫(yī)藥大學