專利名稱：基于紅外線(ir)定量生物分子的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于定量樣品中的分析物的紅外分光光度法領(lǐng)域和用于所述方法中的裝置。
背景技術(shù)：
紅外(IR)光譜法是研究實(shí)驗(yàn)室中用于分析樣品的常用分析工具。電磁波譜的IR區(qū)從可見光區(qū)的低端(波數(shù)約HJOOcnT1)延伸至微波區(qū)(接近20CHT1)。通常，對(duì)于吸收IR的分子而言，該分子內(nèi)的振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)必須引起該分子偶極矩的凈變化。輻射的交替變化的電場與該分子的偶極矩的波動(dòng)相互作用，并且如果輻射的頻率與該分子的振動(dòng)頻率相匹配時(shí)，則所述輻射被吸收，由此引起分子振動(dòng)幅度的變化。通常，對(duì)于生物分子例如蛋白質(zhì)的定量分析，最常用的技術(shù)是比色法(例如考馬斯藍(lán)測定法、Lowry測定法、BCA測定法以及Pierce 660蛋白質(zhì)測定法)和UV光譜技術(shù)(例如在280nm處的吸收)。在本領(lǐng)域已知的大多數(shù)定量方法中，在使用者每次進(jìn)行定量時(shí)，使用者需要使用校正物(calibrant)生成校正曲線，所述校正物通常是與被定量的分析物相同的分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供用于定量樣品中的分析物特別是生物分子的改進(jìn)的方法，其比本領(lǐng)域中已知的大多數(shù)方法需要更短的操作時(shí)間和更小的樣品體積，并且不需要如本領(lǐng)域已知的大多數(shù)方法所需的任何特殊的樣品準(zhǔn)備步驟。另外，本發(fā)明的方法還避免了使用者在每次定量分析物時(shí)生成校正曲線的需要，并且也不需要所述校正物是與被定量的分析物相同的分子。本發(fā)明還提供用于所要求保護(hù)的方法中的裝置?！矫?，本發(fā)明提供用于定量樣品中的一種或多種生物分子的基于IR的方法。在一種本發(fā)明的用于定量樣品中的一種或多種生物分子的方法中，所述方法包括以下步驟(a)提供包含多孔膜的樣品架，所述多孔膜包含被疏水區(qū)包圍的用于容納樣品的親水區(qū)；(b)使所述膜的所述親水區(qū)與樣品體積接觸；(c)干燥所述膜上的所述樣品體積；(d)將所述膜上的所述樣品體積暴露于包含4000-40001^1光譜范圍內(nèi)或所述光譜范圍的任意部分內(nèi)的波長的紅外光束，由此獲得紅外吸收光譜；其中所述紅外吸收光譜中的一個(gè)或多個(gè)吸收峰面積與所述樣品中的所述一種或多種生物分子的量相關(guān)。在另一本發(fā)明的用于定量樣品中的一種或多種生物分子的方法中，所述方法包括以下步驟(a)提供包含多孔膜的樣品架，所述多孔膜包含被疏水區(qū)包圍的用于容納樣品的親水區(qū)；(b)使所述膜的所述親水區(qū)與樣品體積接觸；(c)干燥所述膜上的所述樣品體積；(d)通過紅外吸收檢測步驟(C)后的所述樣品體積中是否存在水分，并在必要時(shí)重復(fù)步驟(C)直到不能檢出水分的存在；以及(e)將所述膜上的所述干燥的樣品體積暴露于包含4000-400cm^光譜范圍內(nèi)或所述光譜范圍的任意部分內(nèi)的波長的紅外光束，由此獲得紅外吸收光譜；其中所述紅外吸收光譜中的一個(gè)或多個(gè)吸收峰面積與所述樣品中的所述一種或多種生物分子的量相關(guān)。在所要求保護(hù)的方法的一些實(shí)施方案中，所述一種或多種生物分子選自核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖和脂多糖。示例性的脂多糖是內(nèi)毒素。 在各種實(shí)施方案中，所述光譜中的一個(gè)或多個(gè)吸收峰面積各自與所述樣品中的特定生物分子的量相關(guān)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法不需要在每次定量分析物時(shí)生成校正曲線。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將一條或多條校正曲線預(yù)載入所使用的儀器中，由此避免使用者每次想要定量樣品中的分析物時(shí)生成校正曲線的需要。在定量蛋白質(zhì)和肽的情況下，所述定量是基于存在于多肽分子中的酰胺鍵的數(shù)量或酰胺鍵的濃度，因此所述定 量與該分子的氨基酸序列無關(guān)。因此，與在每次定量分析物(例如蛋白質(zhì)或肽)時(shí)需要生成校正曲線并且還需要所述校正物是與被定量的分析物相同的分子的本領(lǐng)域已知并使用的大多數(shù)方法不同，在本發(fā)明的方法中，可將任意蛋白質(zhì)用作校正物來生成之后被預(yù)載入所使用的儀器中的校正曲線。相似地，在定量其它分析物例如核酸、碳水化合物等的情況下，可使用任意適合的校正物來生成被預(yù)載入所使用的儀器中的校正曲線。本發(fā)明的方法可用于定量具有非常小的樣品體積的分析物。在所要求保護(hù)的方法的各種實(shí)施方案中，所述樣品體積為O. 1-20 μ I。在一具體實(shí)施方案中，所述樣品體積為約2-5 μ I或更小，或小于I μ I。在一些實(shí)施方案中，所述樣品包括生物液體，例如血液、血漿、血清和尿液。在其它實(shí)施方案中，所述樣品是環(huán)境樣品、藥物樣品或食物樣品。在其它實(shí)施方案中，所述樣品是燃料樣品。在一些實(shí)施方案中，所述樣品包括細(xì)胞裂解產(chǎn)物或組織裂解產(chǎn)物。在各種實(shí)施方案中，所述樣品是粗樣品。在一些實(shí)施方案中，所述多孔膜是超濾膜。在其它實(shí)施方案中，所述多孔膜是微孔膜。在本發(fā)明的方法的一些實(shí)施方案中，所述多孔膜包含選自PVDF(聚偏氟乙烯)、PTFE (聚四氟乙烯)、親水性PTFE和聚乙烯的高分子材料。在一具體實(shí)施方案中，多孔膜包含親水性PTFE。然而，任意適合的高分子材料可用于本發(fā)明的方法中。高分子材料/膜的選擇會(huì)在很大程度上取決于被定量的分析物。例如，使用與所關(guān)注的分析物在相同的波長處具有吸收和/或干擾吸光度測定的高分子材料是不期望的。在一些實(shí)施方案中，樣品被點(diǎn)樣于其上的多孔膜被包含于為方便起見被稱作樣品架的裝置內(nèi)。在一具體實(shí)施方案中，所述樣品架是卡片形式，并且為方便起見被稱作卡式樣品架(sample holder card)。在所要求保護(hù)的方法的各種實(shí)施方案中，所述樣品架包含多孔膜，所述多孔膜包含其中將所述樣品體積容納于所述膜上的區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，用于容納樣品的所述區(qū)域包含疏水區(qū)內(nèi)的親水區(qū)，其中所述樣品體積被容納于所述親水區(qū)內(nèi)。
在一些實(shí)施方案中，所述疏水區(qū)是通過用等離子體處理親水性多孔膜而形成的。在其它實(shí)施方案中，所述疏水區(qū)是通過熱處理親水性多孔膜而形成的。在一些實(shí)施方案中，所述親水區(qū)包含一個(gè)或多個(gè)疏水區(qū)點(diǎn)或者一條或多條疏水區(qū)線。重要的是將所述樣品體積容納于所述親水區(qū)的直徑內(nèi)。所述親水區(qū)的直徑取決于所使用的IR儀器的光束直徑，其中所述光束穿過被容納于所述親水區(qū)內(nèi)的樣品。為了有助于準(zhǔn)確地定量，需要使親水區(qū)的直徑小于或等于IR光束的直徑。這確保IR光束可照射到整個(gè)樣品體積并且確保實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定量。在一些實(shí)施方案中，所述樣品架的親水區(qū)的直徑為2. Omm-9. 2mm。在一些實(shí)施方案中，所述親水區(qū)的直徑為3. 0mm-6mm。在一些實(shí)施方案中,被點(diǎn)樣到膜上的樣品體積包含表面活性劑。在一些實(shí)施方案中，在將樣品點(diǎn)樣到膜上之前或之后將表面活性劑點(diǎn)樣到所述膜上。


圖I是為將來的使用生成的示例性校正曲線。在某一天用BSA生成校正曲線(虛線)。在數(shù)天后(例如此處為4天后)準(zhǔn)備4mg/ml的BSA樣品，并根據(jù)之前生成的校正曲線進(jìn)行檢驗(yàn)。圖2是本發(fā)明的示例性樣品架的示意圖。該示例性樣品架是包含四個(gè)不同的用于施加樣品溶液體積的膜點(diǎn)樣孔(spot)的卡片，各點(diǎn)樣孔包含被疏水區(qū)包圍的親水區(qū)。被稱作樣品點(diǎn)樣孔1、2和3的點(diǎn)樣孔用于點(diǎn)樣在適合的緩沖液中含有所關(guān)注的生物分子的樣品體積，而點(diǎn)樣孔B是用于點(diǎn)樣空白溶液或單獨(dú)的緩沖液的體積。點(diǎn)樣于點(diǎn)樣孔1、2和/或3的樣品體積可代表相同的樣品溶液或由不同的樣品溶液構(gòu)成。圖3是顯示定量同一樣品中的蛋白質(zhì)和核酸的代表性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的紅外吸收光譜。該實(shí)驗(yàn)中使用的蛋白質(zhì)是BSA。X-軸表示以cm—1為單位的波數(shù)，并且Y-軸表示吸光度單位。該圖證明使用本發(fā)明的基于IR的方法能夠定量同一樣品中的DNA和蛋白質(zhì)(即BSA)二者。圖4是顯示定量樣品中的肽的代表性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的紅外吸收光譜。BSA被用作該定量實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。X-軸表示以cm—1為單位的波數(shù)，并且Y-軸表示吸光度單位。圖5是顯示定量水中的脂多糖(LPS，其為內(nèi)毒素)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的紅外吸收光譜。X-軸表示以Cm—1為單位的波數(shù)，并且Y-軸表示吸光度單位。該光譜表明，當(dāng)水中的LPS濃度從20 μ g/ μ I降低至O. 2 μ g/ μ I時(shí)光譜強(qiáng)度降低。而且，利用該試驗(yàn)生成使用LPS的校正曲線，并且該校正曲線用于之后的內(nèi)毒素定量。圖6是顯示監(jiān)測/測定/檢測樣品中是否存在水分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的紅外吸收光譜。X-軸表示以cm—1為單位的波數(shù)，并且Y-軸表示吸光度單位。如該圖譜所示，當(dāng)樣品中存在水分時(shí)，存在與水的-OH鍵相關(guān)的鍵伸縮和彎曲振動(dòng)引起的光譜干擾，其干擾蛋白質(zhì)酰胺鍵的分辨率。但是，當(dāng)將樣品干燥并且使水分蒸發(fā)時(shí)，與水相關(guān)的光譜強(qiáng)度降低，這也顯示于該圖譜中。圖7顯示了證明當(dāng)向樣品中加入表面活性劑(例如SDS)時(shí)樣品具有更均勻的分布和吸收特征的圖。X-軸表示以CnT1為單位的波數(shù)，并且Y-軸表示吸光度單位。
圖8A和SB分別顯示了用于等離子體基樣品容納中的固定裝置和卡式樣品架組件的敞開視圖和閉合視圖。圖8A顯示完全組裝好的卡式樣品架和固定裝置兩側(cè)的敞開構(gòu)造。圖SB顯示在真空等離子體環(huán)境內(nèi)的卡式樣品架和固定裝置組件的閉合橫截面示意圖，其中將卡式樣品架上期望為疏水性的膜區(qū)域暴露于等離子體處理，而保護(hù)樣品被點(diǎn)樣于其上的親水區(qū)以免被等離子體處理。圖9顯示了等離子體處理后的卡式樣品架的示意圖。親水區(qū)表示被保護(hù)的膜區(qū)域，其被暴露于等離子體處理的疏水區(qū)包圍。圖10A-10D顯示了卡式樣品架的膜內(nèi)的疏水區(qū)和親水區(qū)的示例性形狀/圖形，可通過適當(dāng)?shù)胤胖脧椥悦芊馊?seal)(在等離子體處理法的情況下)或通過成型熱板(heated plate)(在加熱處理法的情況下)形成所述形狀/圖形。圖11是用于在所述膜內(nèi)生成疏水樣品容納區(qū)的凸起固定裝置和卡式樣品架系統(tǒng)的展開圖，包括熱板和硅酮基質(zhì)。圖12A和12B分別顯示將所述卡式樣品架置于所述系統(tǒng)中后，凸起頭(embossinghead)/熱板系統(tǒng)的敞開和閉合橫截面示圖。 圖13A-13D顯示表明相對(duì)于未進(jìn)行熱處理的膜(如圖13A(第O秒)和圖13B(第30秒)所示)，膜在熱處理后將樣品(例如水)保留于所述樣品容納區(qū)內(nèi)(如圖13C(第O秒)和圖13D(第30秒)所示)的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖14A和14B分別顯示化學(xué)破壞和物理破壞對(duì)樣品的“咖啡環(huán)”沉積模式的作用。圖14A顯示當(dāng)向樣品中加入去污劑(SDS)時(shí)通過化學(xué)破壞使樣品分布的均勻性增加。將溶解于水和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) 二者中的細(xì)胞色素C(10mg/ml)置于親水性PTFE膜(2uL和5uL)上并將其干燥。向所述樣品中加入SDS導(dǎo)致更均勻的樣品分布(PBS+SDS未顯示)。圖14B顯示引起多個(gè)“咖啡環(huán)”并且使更多的樣品位于所述樣品區(qū)的中心的對(duì)樣品分布的物理破壞(通過改變疏水屏障)。圖15是顯示向樣品中加入SDS的作用的柱狀圖。將SDS (1%和5%)加入到細(xì)胞色素C樣品中并干燥。加入SDS導(dǎo)致各自的峰面積增加。
圖16是顯示IR光譜的峰高和峰面積的示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供使用紅外光譜法(IR)定量樣品中的一種或多種生物分子的改進(jìn)的方法以及用于本發(fā)明的方法中的裝置。為了更容易地理解本發(fā)明，首先對(duì)某些術(shù)語進(jìn)行定義。對(duì)另外的定義的闡述貫穿于詳細(xì)的說明中。I.定義在本文中互換使用的術(shù)語“定量”或“測定”指使用本發(fā)明的方法測定樣品中分析物的量或濃度。本文使用的術(shù)語“分析物”指期望使用本文所述的方法進(jìn)行定量的任意所關(guān)注的分子。在各種實(shí)施方案中，分析物是生物分子。本文使用的術(shù)語“生物分子”指期望使用本發(fā)明的方法進(jìn)行定量的任意所關(guān)注的生物材料。示例性的生物分子包括蛋白質(zhì)、肽、包括DNA和RNA在內(nèi)的核酸分子、脂質(zhì)、碳水化合物和內(nèi)毒素(例如脂多糖)。可使用本發(fā)明的方法定量任意生物分子，只要該生物分子在電磁波譜的紅外范圍內(nèi)能夠吸收。本文使用的術(shù)語“樣品”指包含欲使用本發(fā)明的方法定量的分析物(例如生物分子)的任意介質(zhì)。樣品可包括但不限于例如食物(例如家禽、新鮮的肉類、奶、酸奶、乳制品、烘烤產(chǎn)品、飲料、啤酒、檸檬水、果汁、奶酪、蔬菜、水果、魚等)、水體或污水體(例如池塘水、湖水、河水、海水、下水道污水、飲用自來水等)、臨床樣本(例如血液、血衆(zhòng)、血清、痰、組織、尿液、唾液、來自呼吸道的樣品/液體等)、土壤以及化妝品和藥品(例如洗劑、乳膏劑、軟膏劑、溶液劑、藥品、滴眼劑和滴耳劑等)。在一具體實(shí)施方案中，樣品包括細(xì)胞裂解產(chǎn)物或組織裂解產(chǎn)物。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，樣品可以是粗樣品，即其在用于要求保護(hù)的方法中之前無需任何準(zhǔn)備或處理。在一些實(shí)施方案中，將小體積(例如O. 1-20 μ I)的樣品吸移或點(diǎn)樣到包含于樣品架(例如為卡片形式)內(nèi)的膜的親水區(qū)，隨后進(jìn)行干燥，之后將所述樣品暴露于基于IR的光譜法?？墒褂萌我膺m合的方法干燥所述卡片上的樣品體積。例如，可將所述樣品體積風(fēng)干或者使用對(duì)流加熱器或常規(guī)的烘箱或者甚至是微波爐干燥。在一些實(shí)施方案中，將干燥裝置并入所述IR系統(tǒng)中。一般而言，由于水分可能妨礙獲得準(zhǔn)確的定量，因此期望在定量 前樣品體積中不存在痕量的水分。在要求保護(hù)的方法的一些實(shí)施方案中，對(duì)樣品體積被點(diǎn)樣到其上的膜進(jìn)行干燥步驟，然后利用紅外吸收檢測是否存在水分。如果檢測到水分，則再次對(duì)所述膜進(jìn)行干燥步驟并且重復(fù)所述干燥步驟直到不能檢測出水分的存在。通常，在干燥步驟后吸光度無進(jìn)一步變化表示不能檢測出水分的存在，或者換言之，對(duì)于IR分析而言，所述樣品是足夠干燥的。本發(fā)明的方法和裝置使得能夠使用非常小的樣品體積實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中分析物的準(zhǔn)確定量。在各種實(shí)施方案中，所述樣品體積是約0.05μ 1、0. 1μ I或O. 2μ I或O. 3μ I或0.4卩1或0.5卩1或0.6卩1或0.7卩1或0.8卩1或0.9卩1或1.0卩1或1.5卩1或2卩1或2·5μ1 或 3μ1 或 3·5μ1 或 4μ1 或 4·5μ1 或 5μ1 或 5·5μ1 或 6μ1 或 6·5μ1 或 7μ1或 7·5μ1 或 8μ1 或 8·5μ1 或 9μ1 或 9·5μ1 或 10μ1 或 10·5μ1 或 Ι μ 或 11·5μ1 或12μ1 或 12·5μ1 或 13μ1 或 13·5μ1 或 14μ1 或 14·5μ1 或 15μ1 或 15·5μ1 或 16μ1或 16. 5 μ I 或 17 μ I 或 17. 5 μ I 或 18 μ I 或 18. 5 μ I 或 19 μ I 或 19. 5 μ I 或 20 μ I 或大于20 μ I。盡管本文所述的裝置和方法有助于使用非常小的體積來定量一種或多種生物分子，但是為了提高使用本文所述方法的檢測下限和定量下限，可將多個(gè)等分部分的樣品體積施加到卡式樣品架上，并在該等分部分之間干燥所述樣品體積。舉例而言，在樣品含有非常低水平的分析物(其可能難以或不能通過使用本文所述方法檢測出)的情況下，可將多個(gè)等分部分的某樣品體積(例如10-20μ1)點(diǎn)樣到卡式樣品架上，并在不同的等分部分之間干燥所述樣品體積。因此，盡管每次施加僅將10-20 μ I的小體積點(diǎn)樣到所述卡式樣品架上，但是在所述樣品體積的多次施加中能夠總共施加50μ 1-100μ I或更多的總樣品體積，并在多次施加之間干燥各樣品體積。在一些實(shí)施方案中，通過將20 μ I的樣品體積施加到卡片上并干燥所述卡片來將100 μ I或更大的樣品體積施加到所述卡式樣品架上。一旦所述樣品體積完全干燥，則可將另外的20 μ I樣品體積施加到所述卡式樣品架上，并且可再次干燥所述卡片?？蓪⒃撨^程重復(fù)多次以將需要的樣品體積點(diǎn)樣到所述卡片上。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于其提高了分析物檢測/定量的下限。
本文使用的術(shù)語“裂解”指可將細(xì)胞或組織破開的任意方式，例如通過破壞細(xì)胞膜并可能引起細(xì)胞的內(nèi)容物釋放。可用于裂解細(xì)胞或組織的示例性方法包括但不限于酶法、超聲、機(jī)械作用(例如剪切和擠壓)和化學(xué)方法。本文使用的術(shù)語“核酸”或“核酸分子”指共價(jià)結(jié)合在一起的兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸、核苷或核堿基(nucleobase)例如脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的任意鏈。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法定量的生物分子是核酸分子。核酸分子包括但不限于病毒基因組或其部分(DNA或RNA)、細(xì)菌基因組或其部分、真菌、植物或動(dòng)物基因組或其部分、信使RNA (mRNA)、核糖體RNA (rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (tRNA)、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA或者合成DNA或RNA?？梢灾辨?例如mRNA)、環(huán)狀(例如質(zhì)粒)或支鏈形式以及雙鏈或單鏈形式提供核酸分子。核酸分子可包含修飾堿基以改變?cè)摵怂岬墓δ芑蛐袨椋缣砑?'-端基雙脫氧核苷酸以阻斷其它核苷酸被添加到所述核酸中。術(shù)語“波長”通常指波的一個(gè)峰或嵴與下一個(gè)峰或嵴之間的距離。其等于波速除以波的頻率，并且等于波速乘以波的周期。波長是行波和駐波二者以及其它空間波型的特征。波長通常由希臘字母λ來表示。假定正弦波以固定的波速移動(dòng)，則波長與該波的頻率 成反比。因此，頻率較高的波的波長較短，并且頻率較低的波的波長較長。術(shù)語“波數(shù)”是與波長的倒數(shù)成比例的波的性質(zhì)。波數(shù)通常以單位CnT1測定，并且可被定義為每單位距離的波長的數(shù)量，即l/λ，其中λ是波長。本文使用的術(shù)語“(一個(gè)或多個(gè))吸收峰面積”指如本文所述將樣品暴露于IR光譜法后觀察到的紅外吸收光譜的一個(gè)或多個(gè)部分。一旦使用本文所述的基于IR的方法獲得紅外吸收光譜，則通過繪出橫跨所述峰的基線并測定該峰內(nèi)包圍的面積來計(jì)算所述光譜中的一個(gè)或多個(gè)峰下的面積。如圖16所示，通?；诠庾V上峰前和峰后的點(diǎn)繪制基線。在要求保護(hù)的方法的一些實(shí)施方案中，峰面積與樣品中分析物的濃度或量相關(guān)。在一些實(shí)施方案中，如下測定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。第一步，使用包含已知濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的校正物生成校正曲線，并且將所述校正曲線預(yù)載入IR光譜儀。隨后可在每次使用所述儀器定量樣品中的蛋白質(zhì)時(shí)使用同一校正曲線。另外，不需要所述校正物存在于被分析的樣品中，或者換言之，所述校正物可來自與所述樣品完全不同的來源。舉例而言，在一具體實(shí)施方案中，以各種已知的濃度在緩沖液中準(zhǔn)備蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品例如BSA的溶液。將該標(biāo)準(zhǔn)品溶液施加到卡片形式的樣品架內(nèi)的膜的親水區(qū)，將該膜干燥并使用IR儀器例如Bruker IR儀器測定吸收光譜。不希望受到理論的約束，任意適合的IR儀器均可用于本發(fā)明的方法中。大多數(shù)現(xiàn)代IR吸收儀器使用具有邁克耳孫干涉儀的傅里葉變換技術(shù)。在所要求保護(hù)的方法的一些實(shí)施方案中，為了獲得IR吸收光譜，所述干涉儀的一面鏡子移動(dòng)從而在到達(dá)檢測器的輻射中產(chǎn)生干擾。由于所有的波長均穿過所述干涉儀，所以干涉圖是復(fù)雜圖形。從作為鏡面移動(dòng)(cm)的函數(shù)的干涉圖的傅里葉變換獲得作為波數(shù)(cm—1)的函數(shù)的吸收光譜。該設(shè)計(jì)不具有色散儀器的參比池，所以將參比光譜記錄并保存于內(nèi)存中以從樣品光譜中扣除。其它示例性的IR吸收儀器包括色散型IR吸收儀器和單波長IR儀器。色散型IR光譜儀使用單色儀中的衍射光柵以便分散光的不同波長。一般而言，色散型IR光譜儀已被FTIR儀器取代。單波長IR儀器可用于監(jiān)測單個(gè)IR波長以測定快速反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用FTIR儀器定量一種或多種生物分子。通過內(nèi)置于該儀器中的軟件計(jì)算涵蓋酰胺I和酰胺II的峰(1800-1450(3!^1)的曲線下面積。例如，Bruker IR光譜儀包含Bruker Opus軟件。然后設(shè)置校正曲線,其將峰下面積對(duì)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作圖。接著使用通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品生成的校正曲線測定樣品中的分析物的濃度。通常，校正曲線是指觀察到的信號(hào)的期望值與分析物的量或濃度之間的函數(shù)關(guān)系的圖形表示。通常使用涵蓋校正物的已知濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)品生成校正曲線。然后將用樣品獲得的光譜與所述標(biāo)準(zhǔn)品比較以獲得期望分析物的濃度。 在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述方法還包括監(jiān)測/檢測樣品中的水分引起的吸收的步驟。水在約34000^1和1600CI!!—1處具有吸收，因此與用許多生物分子獲得的光譜重疊。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用包含內(nèi)置軟件的IR儀器監(jiān)測與水分引起的吸收相關(guān)的光譜強(qiáng)度的變化，所述光譜強(qiáng)度在樣品中的水分的量減少時(shí)降低。因此，通過監(jiān)測與水分相關(guān)的光譜強(qiáng)度，使用者可確定所述樣品是否需要進(jìn)一步干燥。通常，在干燥過程中數(shù)次測量與水分引起的吸收相關(guān)的光譜強(qiáng)度，直到在2次或3次或更多次的連續(xù)讀數(shù)中觀察到相同的光譜強(qiáng)度，由此驗(yàn)證該樣品對(duì)于實(shí)際定量是干燥的。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法分析的樣品中包含表面活性劑。表面活性劑可包含于被點(diǎn)樣到膜上的樣品中，或者可在將樣品點(diǎn)樣前或點(diǎn)樣后將其添加到所述膜上。表面活性劑(例如十二烷基硫酸鈉(SDS)或吐溫20)或化學(xué)添加劑(例如甘油)降低溶液的表面張力，由此使得樣品能夠在區(qū)域內(nèi)均勻分布。當(dāng)在親水性PTFE基質(zhì)上干燥包含一種或多種生物分子的含水樣品時(shí)，隨著樣品的干燥形成濃度梯度。這一沉積模式導(dǎo)致最大量的樣品被沉積在最外圍，并且最小量的樣品被沉積在樣品區(qū)的中心。這一圖形通常被稱作“咖啡環(huán)”或“炸面圈”圖形。當(dāng)(例如通過加入表面活性劑)降低所述含水樣品的表面張力時(shí)，所述樣品的沉積在整個(gè)樣品區(qū)內(nèi)更為均勻。在樣品被能量源輻射的情況中，包含表面活性劑導(dǎo)致所述樣品在暴露于該能量源的區(qū)域內(nèi)更均勻的分布。示例性的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯系非離子型表面活性劑，例如吐溫
20、吐溫40、吐溫60和吐溫80 ;陰離子型表面活性劑例如十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基硫酸銨、十二烷基醚硫酸鈉(SLES)、硬脂酸鈉。在一些實(shí)施方案中，表面活性劑的濃度為約1%或約2%或約3%或約4%或約5%或約6%或約7%或約8%或約9%或約10%。在一具體實(shí)施方案中，表面活性劑的濃度為約5%。示例性的化學(xué)添加劑包括但不限于多元醇，例如甘油、乙二醇、丙二醇、雙丙二醇。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)添加劑的濃度為約1%或約2%或約3%或約4%或約5%或約6%或約7%或約8%或約9%或約10%。在一具體實(shí)施方案中，化學(xué)添加劑的濃度為約5%。本發(fā)明還包括用于使用基于IR的方法定量樣品中的一種或多種生物分子的裝置以及制造這樣的裝置的方法。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，用于定量生物分子的裝置是包含多孔膜(例如超濾膜或微孔膜)的卡片形式的樣品架。一般而言，認(rèn)為超濾膜具有小于
O.Ιμ 的孔徑。在一些實(shí)施方案中，包含于樣品架內(nèi)的多孔膜包含被疏水區(qū)包圍的親水區(qū)。所述親水區(qū)是可被水立即潤濕的所述膜的區(qū)域以及通常樣品被點(diǎn)樣或吸移到所述膜上的區(qū)域。其還是通常暴露于IR光束的區(qū)域。在 一些實(shí)施方案中，所述膜的親水區(qū)被未被水潤濕的疏水區(qū)包圍。在一些實(shí)施方案中，用于容納樣品的區(qū)域包含親水區(qū)和疏水區(qū)的形狀/圖形，例如為在所述親水區(qū)內(nèi)形成的疏水區(qū)的線或點(diǎn)的形式。示例性的形狀和圖形顯示于圖8A-8D中。這樣的形狀和圖形還使得樣品能夠在暴露于IR光束的區(qū)域內(nèi)更均勻地分布，就像添加了表面活性劑或化學(xué)添加劑。包含微孔膜的用于紅外光譜分析的卡式樣品架之前已在本領(lǐng)域中有所記載，例如美國專利第5，470，757號(hào)和第5，764，355號(hào)中討論的那些，這些專利以其整體援引加入本文。然而，不存在如本發(fā)明中的包含被疏水區(qū)包圍的用于容納樣品的親水區(qū)的卡式樣品架的教導(dǎo)。另外，這些專利也未記載表現(xiàn)出本文所述的改進(jìn)的卡式樣品架和方法，所述改進(jìn)例如在樣品中定量多于一種生物分子、使用非常小的樣品體積和無需在每次操作時(shí)生成校正曲線等。所述卡片形式的樣品架通常由用粘合劑層壓到膜基質(zhì)上的兩層紙卡材料制成。還可由任意其它物質(zhì)(例如可用粘合劑粘著的塑料)制造樣品架。另外，可在不使用任何粘合劑的情況下構(gòu)成樣品架，并通過當(dāng)暴露于熱時(shí)粘附到卡材料上的所述卡材料上的涂層對(duì)其進(jìn)行層壓。在一些實(shí)施方案中，樣品架的形式為約I. 4英寸寬、2. 5英寸長的卡片，并且可容納至少4個(gè)樣品。然而，可設(shè)計(jì)樣品架使其可容納I個(gè)樣品至多達(dá)96個(gè)或更多個(gè)樣品(例如96-孔板形式)。特別是當(dāng)樣品架是卡片形式時(shí)，可在其設(shè)計(jì)中加入刻痕以便對(duì)IR系統(tǒng)定位所述樣品架，從而確認(rèn)所述樣品架被正確地插入所述IR系統(tǒng)的支架(carrier)內(nèi)以暴露于IR光束。將樣品架正確定位使得IR光束穿過包含樣品的親水區(qū)也是重要的。本文所述的卡式樣品架易于生產(chǎn)、成本低并且是一次性的。通過以下實(shí)施例(其不應(yīng)被解釋為具有限制性)進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明。本申請(qǐng)中通篇引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請(qǐng)的內(nèi)容以及附圖均援引加入本文。實(shí)施例實(shí)施例I :生成用于將來的樣品定量的校[H曲線本文描述的定量樣品中的一種或多種生物分子的方法避免了每次在儀器上進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)時(shí)生成校正曲線的需要。這與使用者通常需要在每次進(jìn)行定量測定時(shí)生成新的校正曲線或標(biāo)準(zhǔn)曲線的本領(lǐng)域的現(xiàn)有測定法相比有所改進(jìn)。在本文描述的方法中，使用者生成一次校正曲線或標(biāo)準(zhǔn)曲線并且可將其用于將來的分析。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，如下生成校正曲線。在緩沖液中準(zhǔn)備分析物(BSA)的各種濃度的溶液并且采用本文所述的基于FTIR的檢測法進(jìn)行分析。圖I中的圖顯示與分析物的濃度或量(X軸)相對(duì)的峰面積或峰高(Y軸)。當(dāng)已知峰面積時(shí)，將該校正曲線的線性范圍用于計(jì)算未知樣品的濃度。典型的等式是Y = mx+c,其中C = Y軸上的截距，m =線的斜率；y =峰面積或峰高，并且X =分析物的濃度或量。另外，使用者可向原始校正曲線添加數(shù)據(jù)來增強(qiáng)定量的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。圖I是某一天使用緩沖液中各種已知濃度的BSA生成的校正曲線，以及在數(shù)天后根據(jù)同一曲線定量未知濃度蛋白質(zhì)的相關(guān)樣品的實(shí)例。
實(shí)施例2 定暈樣品中的生物分子的一般方案在代表性的實(shí)驗(yàn)中，在去離子水或適合的緩沖液中準(zhǔn)備包含一種或多種生物分子(例如蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)等)的樣品。將約O. 2-10μ1的空白溶液(例如單獨(dú)的去離子水或緩沖液)施加到包含于例如卡片形式的樣品架(在本文中稱作卡式樣品架)內(nèi)的膜的親水區(qū)。將相同體積的所準(zhǔn)備的樣品溶液施加到一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)樣孔中，所述點(diǎn)樣孔可存在于同一卡式樣品架上或存在于并非同一個(gè)但相同的卡式樣品架上。接著采用以下技術(shù)中的一種將所述卡式樣品架干燥加熱(40-60°C，0. 5-2分鐘)；壓縮空氣/氮?dú)饣蛉我馄渌栊詺怏w(O. 5-2分鐘)；或微波爐。隨后將干燥的卡式樣品架插入IR儀器的樣品室內(nèi)。在4000-400(31^1下測定空白溶液的透射/吸收光譜以獲得本底譜圖，然后在相同的波長范圍下測定所述樣品。接著使用內(nèi)置于所述系統(tǒng)中并使用各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品生成的校正曲線測定未知樣品的濃度。圖2顯示具有用于施加空白的一個(gè)點(diǎn)樣孔(以B表示)和用于施加3個(gè)樣品(以 1、2和3表示)的點(diǎn)樣孔的示例性卡式樣品架的圖像。然而，如上文所述，卡式樣品架可被設(shè)計(jì)成具有任意數(shù)量的用于施加樣品的點(diǎn)樣孔的形式。實(shí)施例3 :使用IR光譜法定暈樣品中的蛋白質(zhì)和核酸在代表性的實(shí)驗(yàn)中，使用本發(fā)明的方法如下定量樣品中的蛋白質(zhì)和核酸二者。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，將牛血清白蛋白(BSA ；SIGMA Cat#A_7030)和脫氧核糖核酸(DNA ；Ambion Cat#AM9680剪切的鮭精DNA)以不同的比例(10_1 μ g，以等比和反比)混合在一起并溶解于IxPBS緩沖液中。在如圖2所示的卡式樣品架的1、2和3位置，使用PlORainin移液器將I μ I樣品吸移到卡式樣品架的親水性PTFE膜上。將相同體積的用于準(zhǔn)備上述樣品的緩沖液吸移到如圖2所示的卡式樣品架的B位置。用高壓空氣干燥包含緩沖液點(diǎn)樣孔和樣品點(diǎn)樣孔二者的卡式樣品架。將所述卡式樣品架插入IR儀器中，并且首先在4000-400(3!^1下測定緩沖液的吸收/透射光譜。隨后，使用緩沖液光譜作為本底譜圖測定樣品的光譜。采用用于蛋白質(zhì)的HOO-HOOcnT1的光譜范圍以及用于核酸的1740-14000^1和1120-9400^1的光譜范圍測定蛋白質(zhì)和核酸的量。應(yīng)注意蛋白質(zhì)和核酸均在HOO-HOOcnT1的波長范圍內(nèi)有吸收。因此，一旦測定了核酸的濃度，則可將其從利用HOO-HOOcnT1的峰面積獲得的蛋白質(zhì)加核酸的濃度中扣除，由此提供單獨(dú)的蛋白質(zhì)濃度。因此，可在一次實(shí)驗(yàn)中測定蛋白質(zhì)和核酸二者的濃度。在該實(shí)驗(yàn)中，使用溶解于緩沖液或去離子水的純的蛋白質(zhì)和DNA樣品獨(dú)立地生成用于蛋白質(zhì)和DNA的校正曲線。一項(xiàng)這樣的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖3中。實(shí)施例4 :使用IR定量樣品中的肽在另一項(xiàng)代表性的實(shí)驗(yàn)中，證明本發(fā)明的方法可用于定量肽。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，將肽樣品溶解于水中達(dá)到lmg/ml的濃度。使用P2 Rainin移液器將2 μ I體積的該樣品吸移到如圖2所示的包含親水性PTFE膜的卡式樣品架上，并在40°C的加熱器內(nèi)干燥。所述同一卡式樣品架還具有被稱作空白的位置(B)，向其中吸移2μ I體積的其中未溶解樣品的水。將該卡片插入IR儀器中并測定水/緩沖液空白的吸收/透射光譜，然后使用該水/緩沖液光譜作為背景測定所述樣品。使用HOO-HOOcnT1的光譜范圍測定肽的量。使用緩沖液/水中的純BSA樣品作為校正物生成校正曲線。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖4中。實(shí)施例5 :使用IR定量樣品中的脂多糖
在代表性的實(shí)驗(yàn)中，將本發(fā)明的方法用于定量樣品中的脂多糖。具體而言，將諸如內(nèi)毒素的脂多糖(脂多糖(LPS) ；SIGMA L2630)溶解于IxPBS緩沖液中以獲得20mg/ml的儲(chǔ)備溶液。使用P2Rainin移液器將2 μ I體積的樣品吸移到如圖2中的圖像所示的包含親水性PTFE膜的卡式樣品架上，并使用40°C的加熱器干燥。所述同一卡式樣品架還具有被稱作空白的位置(B)，向其中施加2μ I體積的其中未溶解樣品的緩沖液。將該卡式樣品架插入IR儀器中，并且首先測定緩沖液的光譜，然后將該空白緩沖液光譜視作本底譜圖測定所述樣品的光譜?；趦?chǔ)備溶液的計(jì)算記錄LPS稀釋物的滴定(titration)從而獲得校正曲線。一項(xiàng)這樣的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖5中。實(shí)施例6 :使用IR監(jiān)測樣品中是否存在水分本文所述的方法還可用于檢測樣品中是否存在水分。由于水分能夠影響生物分子 定量的準(zhǔn)確度(例如在定量蛋白質(zhì)/肽的情況下更是如此)，因此非常不希望使用基于IR的方法分析的樣品中含有水分。在代表性的實(shí)驗(yàn)中，將2μ I BSA (Sigma Cat#A_7030)在 Milli Q 水中的 10mg/ml溶液施加到包含于例如卡片形式的樣品架(本文中被稱作卡式樣品架)中的膜的親水區(qū)。然后將濕樣品置于IR光譜儀的IR光束內(nèi)，并測定IR吸收光譜。當(dāng)例如由于水分的蒸發(fā)引起信號(hào)強(qiáng)度和信號(hào)形狀變化時(shí)記錄吸收光譜。當(dāng)所述吸收光譜的信號(hào)強(qiáng)度在3次連續(xù)測定中保持恒定時(shí)，則認(rèn)為該樣品是干燥的，并且用軟件(例如Bruker儀器內(nèi)的Opus軟件)采集BSA在4000-4000^1下的吸收光譜，并使用內(nèi)置的校正曲線測定該溶液中的BSA濃度。一項(xiàng)這樣的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖6中，其顯示干燥樣品時(shí)與水分相關(guān)的信號(hào)強(qiáng)度的降低。實(shí)施例7 :表面活性劑對(duì)樣品分布的作用水溶液可能具有難以均勻干燥和難以在暴露于IR光束的膜區(qū)域上獲得均勻分布的問題。該實(shí)驗(yàn)證明向樣品中加入表面活性劑導(dǎo)致所述樣品在暴露于IR光束的區(qū)域上均勻地分布并因此導(dǎo)致更準(zhǔn)確的定量。在一項(xiàng)代表性的實(shí)驗(yàn)中，使用5μ I 10mg/ml細(xì)胞色素C蛋白質(zhì)樣品溶液，將其溶解于PBS中，并在加入和不加入5% SDS的情況下干燥。將該樣品點(diǎn)樣到卡式樣品架上，并置于總直徑為4. 5mm的IR光束內(nèi)。觀察到僅有約10%的不含SDS的樣品吸收所述IR光束，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的樣品被容納在樣品區(qū)的外圍1_內(nèi)。然而，在存在SDS的樣品中，由于所述樣品在所述光束的最大福照度(Ι/e2)之內(nèi)，因此所述樣品的更加均勻的分布導(dǎo)致更多的IR吸收。經(jīng)積分的酰胺I和2的峰面積(1725-1479(3!^1)約為不含SDS的樣品的3倍。一項(xiàng)這樣的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖7中。該IR吸收光譜中的X軸表示波數(shù)(cm—1)，而Y軸表示吸光度單位。實(shí)施例8使用等離子體處理制造用于容納樣品的卡式樣品架本發(fā)明還包括可用于本文所述的用于定量樣品中的一種或多種生物分子的方法中的樣品架。在一些實(shí)施方案中，樣品架為卡片形式，并且為方便起見被稱作卡式樣品架。為了獲得準(zhǔn)確的吸收光譜并由此定量一種或多種所關(guān)注的生物分子，所述卡式樣品架必須能夠?qū)悠啡菁{于IR光束內(nèi)。在一種制造用于本發(fā)明方法中的卡式樣品架的方法中，利用真空等離子體環(huán)境生成用于容納樣品的區(qū)域。用于所述卡式樣品架的原料膜是由Sumitomo以商品名Poreflon銷售的親水性PTFE膜。該膜包含平均孔徑為O. 03 ym(HHPSff-005-30)的孔，并且經(jīng)親水化處理涂布以獲得可被水潤濕的表面。將所述Poreflon親水膜暴露于真空等離子體環(huán)境以清除表面的所述處理，曝露出原本的疏水性PTFE。圖8A和8B分別顯示遮蔽固定裝置的實(shí)驗(yàn)性敞開視圖和閉合視圖，在所述遮蔽固定裝置內(nèi)放置了用以暴露于等離子體的組裝好的卡式樣品架。將所述膜裝配于由兩張硬質(zhì)的涂布有粘合劑的紙板組成的卡片內(nèi)，各紙板的中心具有12. 5_的通孔。將兩張紙板與放置在它們中間的Sumitomo親水膜組裝到一起，由此覆蓋了所組裝紙卡中的孔。組裝卡(10)顯示于圖8A中，其中固定裝置(12)為敞開結(jié)構(gòu)。將包含親水膜(14)的組裝卡(10)放置于包含用于將所述卡片置于中心的框架(16)的遮蔽固定裝置(12)內(nèi)，如圖8A和SB所示。在被置于中心且被放置的膜卡片(10)的相對(duì)兩側(cè)存在彈性密封圈(18)。在該彈性密封圈
(18)周圍有4個(gè)孔(19)，其提供等離子體氣接近待處理膜(14)的通道。接著如圖SB中的橫截面示圖所示，將遮蔽固定裝置(12)閉合，使得彈性密封圈(18)在壓力下密封卡片(10)內(nèi)的膜(14)的相對(duì)兩側(cè)。使用例如通過夾子產(chǎn)生的力使固定裝置(12)在包含親水膜(14)的卡式樣品架(10)上閉合。 接著將置于固定裝置(12)內(nèi)的卡片(10)置于真空等離子體環(huán)境中，其閉合狀態(tài)的橫截面示圖顯示于圖8B中?？墒褂玫氖纠哉婵盏入x子體系統(tǒng)是roc-001型Harrick真空等離子體系統(tǒng)。使用真空泵(未顯示)將該系統(tǒng)內(nèi)的室(20)抽成真空。使大氣進(jìn)入室(20)，并將流速維持在約2-5cc/min。向RF發(fā)生器(未顯示)通電并維持約10秒至7分鐘的一段時(shí)間。保護(hù)彈性密封圈(18)之間的卡式樣品架(10)的膜(15)的區(qū)域以免其暴露于接觸等離子體，而其余的外部則暴露于以點(diǎn)表示的等離子體。使用圖8A和圖SB描述的固定裝置的等離子體暴露實(shí)驗(yàn)表明任意長于I分鐘的處理時(shí)間導(dǎo)致明確地限定出親水區(qū)和疏水區(qū)，在彈性密封圈(18)的位置出現(xiàn)清晰的過渡邊界。短于I分鐘的等離子體處理時(shí)間導(dǎo)致模糊的過渡邊界乃至根本無過渡邊界，得到仍保持親水性的膜和未被容納的樣品。圖9顯示使用該實(shí)施例中描述的方法制造的示例性的卡式樣品架(22)，其包含具有被疏水區(qū)(26)包圍的親水區(qū)(24)的膜。兩個(gè)區(qū)域之間的界限是過渡邊界或過渡線
(28)。如上文所述，還需要使樣品盡可能均勻地分布在IR光束內(nèi)。如上文所述，一種實(shí)現(xiàn)均勻分布的方法是向樣品中加入表面活性劑。另一種實(shí)現(xiàn)均勻分布的方法是在所述膜上形成如本文所述的散布于親水區(qū)的疏水區(qū)的圖形/形狀。應(yīng)當(dāng)理解，干燥中的液滴會(huì)優(yōu)先沿著該干燥中的液滴的外圍沉積樣品，例如通常觀察到的咖啡環(huán)現(xiàn)象。為了將這一干燥圖形最小化，可進(jìn)一步改進(jìn)包圍親水區(qū)的疏水區(qū)。這可通過例如以在膜上生成親水區(qū)內(nèi)的疏水點(diǎn)或疏水線的圖形的方式適當(dāng)?shù)卦谒瞿ど戏胖盟鰪椥悦芊馊韺?shí)現(xiàn)。這樣的圖形預(yù)期得到多個(gè)較小的液滴，由此形成越來越小的干燥圖形。這些較小的干燥圖形以更均勻的構(gòu)造將樣品沉積于IR光束內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解，可在所述膜上構(gòu)造的可能的形狀/圖形可為線形、點(diǎn)形、星形和其它常見形狀的形式。另外，所述外圍疏水區(qū)的形狀還可以是星形、方形等?？赏ㄟ^將所述彈性密封圈適當(dāng)?shù)胤胖迷诠潭ㄑb置上而生成的示例性的疏水/親水圖形顯示于圖10A-10D中。編號(hào)30表示親水區(qū)，而編號(hào)32表示疏水區(qū)。
實(shí)施例θ:使用熱處理制造用于容納樣品的卡式樣品架在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，使用熱處理作為在所述卡片內(nèi)的膜上實(shí)現(xiàn)樣品容納的另一替代方法，如下制造用于本發(fā)明的IR方法中的卡式樣品架。在示例性的實(shí)驗(yàn)中，為了形成用于容納樣品的區(qū)域，通過暴露于熱板來改變親水性PTFE膜的表面潤濕性。所使用的親水性PTFE膜由Sumitomo以商品名Poreflon銷售，其具有平均孔徑為O. 05 μ m的孔(HHPSW-005-30)，并且經(jīng)親水化處理涂布以獲得可被水潤濕的表面。一般而言，使用該實(shí)施例中描述的方法時(shí)，可使用熱板改性孔徑為O. 05 μ m-0. 45 μ m 且厚度為 30 μ m_80 μ m 的任意 Poreflon 膜。與實(shí)施例8中相同，將親水性PTFE膜裝配于由具有四個(gè)IOmm通孔的涂布有粘合劑的紙板組成的卡片內(nèi)。將兩張紙板與放置在它們中間的Sumitomo親水膜組裝到一起，由此覆蓋所組裝紙卡中的孔。將包含親水膜(36)的組裝卡(34)放入凸起固定裝置(38)內(nèi)，所述固定裝置(38)包括與熱棒(cal-rod)(未顯示)結(jié)合的氣缸(未顯示)和熱板(42)，如圖11所示。所述氣缸將熱板(42)置于卡式樣品架(34)內(nèi)的膜(36)上或其上方，并且 底座(nest) (40)上的彈性墊(44)支撐該膜(40)的底面。熱板(42)包含凸起結(jié)構(gòu)(46)，并且底座(40)包含與凸起結(jié)構(gòu)(46)對(duì)齊的彈性墊(44)，當(dāng)將卡式樣品架(34)置于它們之間時(shí)導(dǎo)致與熱板(42)直接接觸的區(qū)域變成疏水性的。凸起固定裝置/卡/熱板組件的敞開和閉合橫截面示圖分別顯示于圖12A和12B中。將熱板(42)暴露于膜(36) —段固定的時(shí)間(例如5秒至5分鐘)后,所述氣缸(未顯示)將熱板(42)從膜卡(34)上移除。同樣如實(shí)施例8中的情況，可改變?nèi)菁{區(qū)域的形狀。例加在熱處理的情況下，可通過與膜非常接近的突起結(jié)構(gòu)和彈性墊的形狀來控制容納區(qū)域的形狀，使得與熱板的凸起結(jié)構(gòu)接觸的膜的部分變成疏水性的，而未與熱板接觸的部分仍為親水性的。為了證實(shí)使用實(shí)施例8中描述的等離子體處理或使用本實(shí)施例中描述的熱處理生成的疏水區(qū)可有效地容納樣品，使用水作為樣品來研究經(jīng)熱處理或等離子體處理的膜和未經(jīng)處理的膜的樣品容納性質(zhì)。圖13A-13B顯示未經(jīng)熱處理或等離子體處理的膜的樣品容納性質(zhì)，并且圖13C和13D顯示經(jīng)熱處理或等離子體處理的膜的樣品容納性質(zhì)。將作為樣品的2μ I體積的水(50)點(diǎn)樣到卡式樣品架(54)的親水膜(52)上。圖13Α顯示時(shí)間為O時(shí)的水樣品(50)，并且圖12Β顯示時(shí)間為30秒時(shí)的水樣品(50)。如圖13Β所示，所述水樣品在整個(gè)膜區(qū)域擴(kuò)散，導(dǎo)致被潤濕的區(qū)域的直徑大于IR光束的直徑。而在經(jīng)熱處理或等離子體處理的膜的情況中，如圖13C和13D所示，在時(shí)間為0(圖13C)和30秒(圖13D)時(shí)，水樣品(50)被容納于被疏水屏障區(qū)(58)包圍的膜的親水區(qū)(56)內(nèi)。因此，如本文所述的熱處理或等離子體處理可用于生成被外部疏水屏障區(qū)(56)包圍的內(nèi)部親水區(qū)(56)。實(shí)施例10 :通過化學(xué)或物理破壞實(shí)現(xiàn)樣品的均勻分布人們已觀察到在干燥用于FTIR分析的含水生物樣品時(shí)常常得到不均勻的樣品分布圖形，其中最高的樣品濃度位于樣品區(qū)的外緣，由此形成所謂的“咖啡環(huán)”或“炸面圈”圖形，其可導(dǎo)致不準(zhǔn)確的定量。在本文描述的代表性的實(shí)驗(yàn)中，使用表面活性劑或去污劑通過使樣品在樣品容納區(qū)內(nèi)以更均勻的模式干燥而得到更為均勻的樣品分布，如圖14Α所示。而且，在樣品區(qū)內(nèi)加入疏水屏障圖形(例如“X”交叉圖形)能夠使樣品更傾向所述樣品區(qū)的中心干燥，如圖14B所示，得到與使用表面活性劑添加劑的作用接近的樣品分布。所述樣品的分布或?qū)Α翱Х拳h(huán)”的破壞得到更高的濃度和更低的變動(dòng)系數(shù)百分比CV)。可使用的表面活性劑的實(shí)例包括但不限于吐溫20和十二烷基硫酸鈉(SDS)。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，已證明干燥的細(xì)胞色素C樣品的環(huán)狀圖形隨溶解有樣品的溶液(例如PBS相對(duì)于氏0)而變化。IR光束內(nèi)樣品分布的差異可影響所述IR光束穿過所述樣品的透射。為了干擾所述環(huán)狀圖形從而得到更均勻的樣品分布，可將去污劑或表面活性劑加入到樣品中或直接加入到樣品被點(diǎn)樣于其上并干燥的膜上。在下表I中，在不存在SDS(僅H2O)和存在SDS(1%和5%)的情況下計(jì)算細(xì)胞色素C蛋白質(zhì)的酰胺I和2的峰面積。加入SDS導(dǎo)致計(jì)算的樣品面積增加以及變異系數(shù)百分比CV)降低(例如從9. 1%降低至2. 3% )。圖15顯示在下表I和表2中所示的匯總數(shù)據(jù)的柱狀圖。加入SDS引起的樣品值 的增加和％ CV的降低歸因于更均勻的樣品分布(更多的樣品在總IR光束內(nèi))以及更低的存在于樣品之間的變異性(均勻的樣品分布相對(duì)于形成環(huán)情況下的差異)。使用OPUS 6. 5軟件(Bruker)計(jì)算表I和表2中的B列的酰胺I和2的峰面積。計(jì)算平均值和％ CV。向樣品中加入SDS (I %和5% )，并且再次分析峰面積和％ CV。表I:
權(quán)利要求
1.用于定量樣品中的一種或多種生物分子的方法，所述方法包括以下步驟 (a)提供包含多孔膜的樣品架，所述多孔膜包含被疏水區(qū)包圍的用于容納樣品的親水區(qū)； (b)使所述膜的所述親水區(qū)與樣品體積接觸； (c)干燥所述膜上的所述樣品體積； (d)將所述膜上的所述樣品體積暴露于包含4000-4000^1光譜范圍內(nèi)或4000-4000^1光譜范圍的任意部分內(nèi)的波長的紅外光束，由此獲得紅外吸收光譜； i)其中所述紅外吸收光譜中的一個(gè)或多個(gè)吸收峰面積與所述樣品中的所述一種或多種生物分子的量相關(guān)。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述一種或多種生物分子選自核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖和脂多糖。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述脂多糖是內(nèi)毒素。
4.權(quán)利要求I的方法，其中所述方法不需要使用者在每次分析樣品以定量所述一種或多種生物分子時(shí)生成校正曲線。
5.權(quán)利要求I的方法，其中樣品體積為O.1-20 μ I。
6.權(quán)利要求5的方法，其中樣品體積為Iμ I或更小。
7.權(quán)利要求I的方法，其中所述多孔膜被包含于裝置內(nèi)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述裝置是卡式樣品架。
9.權(quán)利要求I的方法，其中所述樣品包括生物液體。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述生物液體選自血液、血漿、血清和尿液。
11.權(quán)利要求I的方法，其中所述樣品包括細(xì)胞裂解產(chǎn)物或組織裂解產(chǎn)物。
12.權(quán)利要求I的方法，其中所述樣品是粗樣品。
13.權(quán)利要求8的方法，其中所述卡式樣品架包含多孔膜，所述多孔膜包含其中將所述樣品容納于所述膜上的區(qū)域。
14.權(quán)利要求I的方法，其中所述多孔膜是超濾膜。
15.權(quán)利要求I的方法，其中所述多孔膜是微孔膜。
16.權(quán)利要求I的方法，其中所述多孔膜包含選自PVDF(聚偏氟乙烯)、聚四氟乙烯、親水性聚四氟乙烯、聚乙烯和聚丙烯的高分子材料。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述膜上用于容納樣品的所述區(qū)域包含被疏水區(qū)包圍的未水區(qū)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述疏水區(qū)是通過等離子體處理親水性多孔膜而形成的。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述樣品被容納于所述親水區(qū)內(nèi)。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述疏水區(qū)是通過熱處理親水性多孔膜而形成的。
21.用于權(quán)利要求I的方法中的卡式樣品架，其中所述卡式樣品架包含多孔膜，所述多孔膜包含被疏水區(qū)包圍的親水區(qū)，其中所述樣品被容納于所述親水區(qū)的邊界內(nèi)。
22.權(quán)利要求21的卡式樣品架，其中所述親水區(qū)的直徑是2.0mm-10mm。
23.權(quán)利要求21的卡式樣品架,其中所述親水區(qū)的直徑是3.0mm-6mm。
24.用于定量樣品中的一種或多種生物分子的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供包含多孔膜的卡式樣品架，所述多孔膜包含被疏水區(qū)包圍的用于容納樣品的親水區(qū)； (b)使所述膜的所述親水區(qū)與樣品體積接觸； (c)干燥所述膜上的所述樣品體積； (d)使用紅外吸收檢測所述膜上是否存在水分并在必要時(shí)重復(fù)步驟(c)直到不能檢出水分；以及 (e)將所述膜上的所述樣品體積暴露于包含4000-400(3!^1光譜范圍內(nèi)或所述光譜范圍的任意部分內(nèi)的波長的紅 外光束，由此獲得紅外吸收光譜； i)其中所述紅外吸收光譜中的一個(gè)或多個(gè)吸收峰面積與所述樣品中的所述一種或多種生物分子的量相關(guān)。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于紅外線(IR)定量生物分子的裝置和方法。具體而言，本發(fā)明提供使用基于IR的技術(shù)定量樣品中的一種或多種生物分子的方法、用于這樣的方法中的樣品架裝置以及制造這樣的樣品架裝置的方法。
文檔編號(hào)G01N21/35GK102901712SQ20121011046
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月14日
發(fā)明者E·切爾諾卡爾斯卡亞, V·喬西, P·克拉克, C·烏特札特, R·阿瑪拉, T·S·里德爾 申請(qǐng)人:Emd密理博公司