專利名稱：一種基于熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶檢測(cè)基因突變和snp位點(diǎn)的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶檢測(cè)基因突變和SNP位點(diǎn)的試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
個(gè)體化醫(yī)療，就是針對(duì)病人的特征，因病因人用藥，使病人在獲得最大利益的同時(shí)使毒副作用減少到最輕。目前，基因突變(點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)在個(gè)體化醫(yī)療中引起廣泛關(guān)注。
肺癌是嚴(yán)重危害人民生命和健康的常見病。研究表明表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因突變與肺癌病人對(duì)抗腫瘤藥物易瑞莎的敏感性有關(guān)，其中以19號(hào)外顯子內(nèi)缺失突變以及21號(hào)外顯子的點(diǎn)突變L858R最為常見。但當(dāng)用藥一段時(shí)間后，EGFR基因會(huì)發(fā)生二次突變，導(dǎo)致耐藥產(chǎn)生。EGFR基因耐藥主要突變型為Thr790位點(diǎn)的Thr790Met突變，發(fā)生C > T突變。此外，若肺癌患者存在K-ras原發(fā)性基因突變，即使存在EGFR基因敏感性突變，對(duì)易瑞莎等靶向藥物也會(huì)產(chǎn)生耐藥。主要突變型為Glyl2位點(diǎn)的Glyl2Arg、Glyl2Cys、Glyl2Ser、Glyl2Ala、Glyl2Asp、Glyl2Val, Glyl3 位點(diǎn)的 Glyl3Asp、Glyl3Val。因此，在對(duì)肺癌患者選擇進(jìn)行靶向藥物治療或?qū)τ盟幏伟┗颊哌M(jìn)行用藥監(jiān)控時(shí)，需對(duì)EGFR基因Thr790Met突變和K_ras基因的主要突變型進(jìn)行檢測(cè)，以確認(rèn)是否用藥有效。此外，K-ras基因突變與大腸癌等腫瘤患者酪氨酸激酶抑制劑等靶向藥物的原發(fā)性耐藥有關(guān)。K-ras基因突變檢測(cè)做為結(jié)直腸癌患者進(jìn)入個(gè)體化靶向治療療程之前需要進(jìn)行的檢測(cè)，已經(jīng)被NCCN(美國(guó)癌癥綜合網(wǎng)絡(luò))列為《結(jié)腸癌臨床治療指南》中必不可少的一項(xiàng)。K-ras基因野生型的患者能從愛必妥(Erbitux,又稱西妥昔單抗/Cetuximab)或維克替比(Vectibix,又稱帕尼單抗/Panitumumab)治療中獲益,而K_ras基因突變的大腸癌患者治療效果較差。美國(guó)FDA和歐洲藥監(jiān)局明確規(guī)定了在使用靶向藥物愛必妥和維克替比治療轉(zhuǎn)移性大腸癌前必須檢測(cè)K-ras基因。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是人類基因組中最常見的遺傳多態(tài)性表達(dá)形式，SNP在基因組中分布相當(dāng)廣泛，在人類基因組中每300-1000堿基對(duì)就出現(xiàn)一次，SNP總量大概是3 X IO6個(gè)。近年的研究表明，SNP位點(diǎn)與個(gè)體表型差異、對(duì)藥物或疾病的易感性相關(guān)。因此，SNP位點(diǎn)的研究已廣泛用于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計(jì)和測(cè)試以及生物學(xué)的基礎(chǔ)研究中等。SNP位點(diǎn)的檢測(cè)，在個(gè)體化醫(yī)療中也具有廣泛的應(yīng)用前景和價(jià)值。例如，核苷酸切除修復(fù)(NER)和堿基切除修復(fù)(BER)是人體內(nèi)兩種極為重要的DNA修復(fù)途徑，XRCCl和ERCCl基因分別在NER和BER途徑中發(fā)揮重要作用。XRCCl中Arg399Gln (CAG — CGG)多態(tài)性位于蛋白質(zhì)重要的結(jié)構(gòu)域內(nèi)，ERCCl中Asnll8Asn多態(tài)性(對(duì)應(yīng)于AAC和AAT的無義突變)能夠影響到ERCCl蛋白的表達(dá)水平，這兩個(gè)基因的多態(tài)性影響到腫瘤細(xì)胞對(duì)鉬類化療藥物的敏感性。有研究表明XRCCl基因中399位GG基因型患者采用鉬類藥物的療效更佳，而ERCCl基因中118位密碼子CC基因型對(duì)鉬類藥物化療反應(yīng)性較好。因此，可通過對(duì)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥指導(dǎo)。目前，DNA測(cè)序法仍然是檢測(cè)SNP位點(diǎn)和基因突變使用最多的方法，但需要獲取組織、分離細(xì)胞、提取核酸和進(jìn)行測(cè)序，所需時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用高，對(duì)取材和技術(shù)要求都比較嚴(yán)格，因此應(yīng)用于臨床仍受到一定程度的限制。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明將熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶與Taq酶融合在一個(gè)反應(yīng)體系中，通過在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中對(duì)野生型基因進(jìn)行實(shí)時(shí) 酶切，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)突變基因和SNP位點(diǎn)的檢測(cè)，為臨床提供一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的SNP位點(diǎn)和基因突變分析方法。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)基因突變(包括點(diǎn)突變、缺失突變和插入突變)和SNP位點(diǎn)的試劑盒。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)基因突變(包括點(diǎn)突變、缺失突變和插入突變)和SNP位點(diǎn)的方法，利用該方法可以提高檢測(cè)基因突變的分辨率。根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)基因突變(包括點(diǎn)突變、缺失突變和插入突變)和SNP位點(diǎn)的試劑盒，其中，所述試劑盒包含酶切野生型基因的熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶。本發(fā)明中，所述試劑盒包含擴(kuò)增引物，優(yōu)選地，在所述擴(kuò)增引物中通過錯(cuò)配堿基的方式引入所述熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，從而使所述熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶在PCR反應(yīng)的同時(shí)酶切野生型PCR產(chǎn)物。更具體而言，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，提供了一種檢測(cè)EGFR基因突變、K-ras基因突變、B-raf基因突變、PI3K基因突變和/或XRCCl基因SNP位點(diǎn)的試劑盒。其中，所述EGFR基因突變選自EGFR基因Thr790Met點(diǎn)突變、Leu858Arg點(diǎn)突變，和EGFR基因 19 號(hào)外顯子 2235_2249 區(qū)域的 2235_2249 del 15、2236_2250 del 15、2236_2253del 18、2237_2251 del 15、2237_2254 del 18、2239_2247 del 9、2239_2253 del 15、2240_2251 del 12、2240_2254 del 15、2235_2252 > AAT、2237_2250 > T、2238_2248 >GC、2238_2252 > GCA、2239_2248 TTAAGAGAAG > C、2239_2251 > C 等 15 種缺失突變中，所述 K-ras 基因突變選自 K-ras 基因 Glyl2Arg> Glyl2Cys> Glyl2Ser> Glyl2Ala> Glyl2Asp>Glyl2Val、Glyl3Asp 和 Glyl3Val 點(diǎn)突變中，所述 B_raf 基因突變?yōu)?B_raf 基因 Val600Glu點(diǎn)突變，所述PI3K基因突變選自PI3K基因Glu542Lys和Glu545Lys點(diǎn)突變中，以及所述XRCCl 基因 SNP 位點(diǎn)為 Arg399Gln。本文中“ > ”前表示缺失區(qū)域，“ > ”后堿基表示在缺失后又在此區(qū)域內(nèi)插入的堿基。本發(fā)明中，所述試劑盒包括以下組分(I)檢測(cè)EGFR基因Thr790Met突變的組合體a) Thr790Mix 包括 Thr790 上游引物(SEQ ID No. I)、Thr790 下游引物(SEQIDNo. 2)、Thr790 探針(SEQ ID No. 3)；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶Bstn ;和/或(2)檢測(cè)EGFR基因Leu858Arg突變的組合體
a) Leu858Mix 包括 Leu858 上游引物(SEQ ID No. 4)、Leu858 下游引物(SEQIDNo. 5)、Leu858 探針(SEQ ID No. 6)；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI ;和/或(3)檢測(cè)EGFR基因19號(hào)外顯子15種缺失突變的組合體a) 19del Mix :包括 19del 上游引物(SEQ ID No. 7)、19del 下游引物(SEQ IDNo. 8)、19del 探針(SEQ ID No. 9)；
b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶MwoI ;和/或(4)檢測(cè)K-ras基因Glyl2位點(diǎn)突變的組合體a)Glyl2Mix 包括 Gly 12 上游引物(SEQ ID No. 10)、Gly 12 下游引物(SEQIDNo. 11)、Gly 12 探針(SEQ ID No. 12)；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI和/或(5)檢測(cè)K-ras基因Glyl3位點(diǎn)突變的組合體a)Glyl3Mix 包括 Gly 13 上游引物(SEQ ID No. 13)、Gly 13 下游引物(SEQIDNo. 14)、Glyl3 探針(SEQ ID No. 15)；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PhoI ;和/或(6)檢測(cè)B-raf基因Val600Glu突變的組合體a) Val600 Mix :包括 Val600 上游引物(SEQ ID No. 16)、Val600 下游引物(SEQIDNo. 17)、Val600 探針(SEQ ID No. 18)；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI ;和/或(7)檢測(cè)PI3K基因Glu542Lys突變的組合體a)Glu542 Mix :包括 Glu542 上游引物(SEQ ID No. 19)、Glu542 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu542 探針(SEQ ID No. 21)；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI ;和/或(8)檢測(cè)PI3K基因Glu545Lys突變的組合體a)Glu545 Mix :包括 Glu545 上游引物(SEQ ID No. 22)、Glu545 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu545 探針(SEQ ID No. 21)；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI ;和/或(9)檢測(cè)XRCCl基因SNP位點(diǎn)Arg399Gln的組合體a)Arg399 Mix :包括 Arg399 上游引物(SEQ ID No. 23)、Arg399 下游引物(SEQIDNo. 24)、Arg399 探針(SEQ ID No. 25)；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的試劑盒包括以下組分(I)檢測(cè)EGFR基因Thr790Met突變的組合體a) Thr790 Mix 包括 Thr790 上游引物(SEQ ID No. I)、Thr790 下游引物(SEQIDNo. 2)、Thr790 探針(SEQ ID No. 3)、Rox 校正液、純水；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶Bstn ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品；e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和EGFR基因Thr790Met突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或(2)檢測(cè)EGFR基因Leu858Arg突變的組合體a) Leu858 Mix :包括 Leu858 上游引物(SEQ ID No. 4)、Leu858 下游引物(SEQIDNo. 5)、Leu858 探針(SEQ ID No. 6)、Rox 校正液、純水；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品；e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和EGFR基因Leu858Arg突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或
(3)檢測(cè)EGFR基因19號(hào)外顯子15種缺失突變的組合體a) 19del Mix :包括 19del 上游引物(SEQ ID No. 7)、19del 下游引物(SEQ IDNo. 8)、19del 探針(SEQ ID No. 9)、Rox 校正液、純水；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶MwoI ；c)、Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品；e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和EGFR基因2235_2249 del 15突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或(4)檢測(cè)K-ras基因Glyl2位點(diǎn)突變的組合體a) Gly 12 Mix 包括 Gly 12 上游引物(SEQ ID No. 10)、Gly 12 下游引物(SEQIDNo. 11)、Gly 12 探針(SEQ ID No. 12)、Rox 校正液、純水;b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品；e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和K_ras基因Glyl2Arg突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或(5)檢測(cè)K-ras基因Glyl3位點(diǎn)突變的組合體a) Gly 13 Mix 包括 Gly 13 上游引物(SEQ ID No. 13)、Gly 13 下游引物(SEQIDNo. 14)、Gly 13 探針(SEQ ID No. 15)、Rox 校正液、純水；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PhoI ；c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品；e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和K_ras基因Glyl3Asp突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或(6)檢測(cè)B-raf基因Val600Glu突變的組合體a) Val600 Mix :包括 Val600 上游引物(SEQ ID No. 16)、Val600 下游引物(SEQIDNo. 17)、Val600 探針(SEQ ID No. 18)、Rox 校正液、純水；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品；
e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和B_raf基因Val600Glu突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或(7 )檢測(cè)PI3K基因Glu542Lys突變的組合體a)Glu542 Mix :包括 Glu542 上游引物(SEQ ID No. 19)、Glu542 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu542 探針(SEQ ID No. 21)、Rox 校正液、純水；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品；e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和PI3K基因Glu542Lys突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或(8)檢測(cè)PI3K基因Glu545Lys突變的組合體a)Glu545 Mix :包括 Glu545 上游引物(SEQ ID No. 22)、Glu545 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu545 探針(SEQ ID No. 21)、Rox 校正液、純水；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品；e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和PI3K基因Glu545Lys突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或(9)檢測(cè)XRCCl基因SNP位點(diǎn)Arg399Gln的組合體a)Arg399 Mix :包括 Arg399 上游引物(SEQ ID No. 23)、Arg399 下游引物(SEQIDNo. 24)、Arg399 探針(SEQ ID No. 25)、Rox 校正液、純水；b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI ；c) Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水；d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品；e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和K-ras基因Arg399Gln型標(biāo)準(zhǔn)品。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組合體中，引物和探針的比例為I : I 5 : 2，優(yōu)選為5 4。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)基因突變(包括點(diǎn)突變、缺失突變和插入突變)和SNP位點(diǎn)的方法。本發(fā)明的方法的特征在于，在同一個(gè)反應(yīng)體系中采用熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶進(jìn)行邊擴(kuò)增邊酶切野生型PCR產(chǎn)物的反應(yīng)。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，可以包括在擴(kuò)增引物中通過錯(cuò)配堿基的方式引入一個(gè)所述熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的步驟。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，在使所述熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶在PCR反應(yīng)的同時(shí)酶切野生型PCR產(chǎn)物的反應(yīng)中，使用的熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶在95°C的半衰期為20-120min。更具體而言，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，提供了一種檢測(cè)EGFR基因突變、K-ras基因突變、B-raf基因突變、PI3K基因突變和/或XRCCl基因SNP位點(diǎn)的方法。其中，所述EGFR基因突變選自EGFR基因Thr790Met點(diǎn)突變、Leu858Arg點(diǎn)突變，EGFR基因 19 號(hào)外顯子 2235_2249 區(qū)域的 2235_2249 del 15、2236_2250 del 15、2236_2253del 18、2237_2251 del 15、2237_2254 del 18、2239_2247 del 9、2239_2253del 15、2240_2251del 12、2240_2254 del 15、2235_2252 > AAT、2237_2250 > T、2238_2248 > GC、2238_2252 > GCA、2239_2248TTAAGAGAAG > C,22392251 > C 等 15 種缺失突變中，所述 K_ras 基因突變選自 K_ras 基因 Glyl2Arg、Glyl2Cys、Glyl2Ser、Glyl2Ala、Glyl2Asp、Glyl2Val、Glyl3Asp 和 Glyl3Val 點(diǎn)突變中，所述 B_raf 基因突變?yōu)?B_raf 基因Val600Glu點(diǎn)突變，所述PI3K基因突變選自PI3K基因Glu542Lys和Glu545Lys點(diǎn)突變中，以及XRCCl基因SNP位點(diǎn)為Arg399Gln。所述方法包括I)制備檢測(cè)樣本；2)在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行邊擴(kuò)增邊酶切反應(yīng)，其中，可以在引物中通過錯(cuò)配堿基方式引入酶切位點(diǎn)，使野生型的PCR產(chǎn)物可被內(nèi)切酶酶切，其中①檢測(cè)EGFR基因Thr790Met突變的引物和探針的制備EGFR基因Thr790位點(diǎn)在下游引物3’末端第三個(gè)堿基通過c/A錯(cuò)配，引入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶Bstn酶切位點(diǎn)CGCG，引物及探針序列如下EGFR Thr790 上游引物:5，-ACGTGTGCCGCCTGCT-3’ (SEQ ID No. I)EGFR Thr790 下游引物5’ -CCGAAGGGCATGAGCcGC-3’ (SEQ ID No. 2)EGFR Thr790 探針5’ -FAM-CATCTGCCTCACCTCCACCGTGC-BHQ2-3，(SEQ IDNo. 3)；②檢測(cè)EGFR基因Leu858Arg突變的引物和探針的制備EGFR基因Leu858位點(diǎn)在上游引物3’末端第二個(gè)堿基通過c/C錯(cuò)配，引入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI酶切位點(diǎn)CCWGG (W = A或者T)，引物及探針序列如下EGFR Leu858 上游引物5’ -GTCAAGATCACAGATTTTGGcC-3’ (SEQ ID No. 4)EGFR Leu858 下游引物5’ -GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3’ (SEQ ID No. 5)EGFR Leu858 探針5， -FAM-TTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGT-BHQ2-3’ (SEQIDNo.6)；③檢測(cè)EGFR基因19號(hào)外顯子15種缺失突變的引物和探針的制備EGFR基因19號(hào)外顯子的缺失突變，在下游引物3’末端第三個(gè)堿基通過c/C錯(cuò)配，弓I入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶MwoI酶切位點(diǎn)GCNNNNNNNGC (N = A或者T或者G或者C)，引物及探針序列如下EGFR 19del 上游引物:5，-GTCATAGGGACTCTGGATCCC-3’ (SEQ ID No. 7)EGFR 19del 下游引物5，-AITTCCTTGITGGCnTCGcAG-3’ (SEQ ID No. 8)EGFR 19del 探針5’ -FAM-CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAG-BHQ2-3’ (SEQIDNo. 9)；④檢測(cè)K-ras基因Glyl2位點(diǎn)突變的引物和探針的制備K-ras基因Glyl2位點(diǎn)在上游引物3’末端第三個(gè)堿基通過c/C錯(cuò)配，引入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI酶切位點(diǎn)CCWGG (W = A或者T)，引物及探針序列如下K-ras Glyl2 上游引物:5’ -TAAACTTGTGGTAGTTGGAcCT-3，(SEQ ID No. 10)K-ras Glyl2 下游引物:5’ -TGGTCCTGCACCAGTAATATGC-3，(SEQ ID No. 11)K-ras Glyl2 探針5’ -FAM-AGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCA-BHQ2-3’ (SEQIDNo. 12)；⑤檢測(cè)K-ras基因Glyl3位點(diǎn)突變的引物和探針的制備K-ras基因Glyl3位點(diǎn)在下游引物3’末端第二個(gè)堿基通過g/G錯(cuò)配,引入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PhoI酶切位點(diǎn)GGCC，引物及探針序列如下K-ras Glyl3 上游引物5’ -GCCTGCTGAAAATGACTGAA-3’ (SEQ ID No. 13)K-ras Glyl3 下游引物5，-GTCAAGGCACTCTTGCCTAgG-3’ (SEQ ID No. 14)K-ras Glyl3 探針5， -FAM-TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGT-BHQ2-3， (SEQIDNo.15)；⑥檢測(cè)B-raf基因Val600Glu突 變的引物和探針的制備B-raf基因Val600位點(diǎn)，具有天然的熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI酶切位點(diǎn)CASTG (S =C或者G)，無需引入酶切位點(diǎn)，即可直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，引物及探針序列如下Val600 上游引物5，-ACCCACTCCATCGAGATTTC-3’ (SEQ ID No. 16)Val600 下游引物5’ -AACTCTTCATAATGCTTGCTCTGA-3’ (SEQ ID No. 17)Val600 探針5， -FAM-ACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTC-BHQ2-3， (SEQIDNo. 18)；⑦檢測(cè)PI3K基因Glu542Lys突變的引物和探針的制備PI3K基因Glu542位點(diǎn)，在上游引物3 ’末端第三個(gè)堿基通過a/A錯(cuò)配，弓丨入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI酶切位點(diǎn)CASTG (S = C或者G)，引物及探針序列如下Glu542 上游引物(引入酶切位點(diǎn)):5，-TTTCTACACGAGATCCTCTCaCT-3’ (SEQIDNo. 19)Glu542 下游引物5’-GCTGAGATCAGCCAAAITCAGT-3’ (SEQ ID No. 20)Glu542 探針5， -FAM-ATGGAGTCACAGGTAAGTGCTAAAATGGAG-BHQ2-3’ (SEQIDNo. 21)；⑧檢測(cè)PI3K基因Glu545Lys突變的引物和探針的制備PI3K基因Glu545位點(diǎn)，具有天然的熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI酶切位點(diǎn)CASTG (S = C或者G)，無需引入酶切位點(diǎn)，即可直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，引物及探針序列如下Glu545 上游引物5’-GAGATCCTCTCTCTGAAATCACT-3’ (SEQ ID No. 22)Glu545 下游引物同 SEQ ID No. 20Glu545 探針同 SEQ ID No. 21 ；⑨檢測(cè)XRCCl基因SNP位點(diǎn)Arg399Gln的引物和探針的制備XRCCl基因SNP位點(diǎn)Arg399Gln，在下游引物3’末端第二個(gè)堿基通過c/A錯(cuò)配，弓丨入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI酶切位點(diǎn)CCWGG (W = A或者T)，引物及探針序列如下Arg399 上游引物5’-TTGCCAACACCCCCAAGTAC-3’ (SEQ ID No. 23)Arg399 下游引物5，-GGCGTGTGAGGCCTTACCcC-3’ (SEQ ID No. 24)Arg399 探針5，-FAM-AGGCCGCATCGTGCGTAAGGAG-BHQ2-3，(SEQ ID No. 25)；以及，使用選自上述制備的引物和探針中的一種或多種分別進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；3)結(jié)果分析。本發(fā)明中，所述步驟2)中進(jìn)一步包括a)試劑配制Thr790內(nèi)參體系包括Taq Mix、Thr790 Mix、純水；Thr790檢測(cè)體系包括TaqMix、Thr790 Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶Bstn ；
Leu858內(nèi)參體系包括Taq Mix、Leu858 Mix、純水；Leu858檢測(cè)體系包括的TaqMix、Leu858 Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶 PspGI ；19del內(nèi)參體系:包括Taq Mix、19del Mix、純水；19del檢測(cè)體系:包括Taq Mix、19del Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶MwoI ；Glyl2內(nèi)參體系:包括Taq Mix、Glyl2 Mix、純水;Glyl2檢測(cè)體系:包括Taq Mix、Glyl2 Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI ；Glyl3內(nèi)參體系:包括Taq Mix、Glyl3 Mix、純水;Glyl3檢測(cè)體系:包括Taq Mix、Glyl3 Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PhoI ；Val600內(nèi)參體系包括Taq Mix、Val600 Mix、純水；Val600檢測(cè)體系包括Taq Mix、Val600 Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI ；Glu545內(nèi)參體系包括Taq Mix、Glu542 Mix、純水；Glu545檢測(cè)體系包括TaqMix、Glu542 Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI ；Glu545內(nèi)參體系包括Taq Mix、Glu545 Mix、純水；Glu545檢測(cè)體系包括TaqMix、Glu545 Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI ；Arg399內(nèi)參體系包括Taq Mix、Arg399 Mix、純水；Arg399檢測(cè)體系包括TaqMix、Arg399 Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI ；b)向a)中的內(nèi)參體系及檢測(cè)體系中，加所述步驟I)中制備的檢測(cè)樣本，以及陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；C)、運(yùn)行程序，Thr790Met 檢測(cè)程序95°C 3min ;40 個(gè)循環(huán)92 °C 15sec，60°C 2min(收集熒光);Leu858Arg 檢測(cè)程序?yàn)?5°C 3min ;40 個(gè)循環(huán)92°C 15sec,60°C 35sec(收集突光)，75°C 2min ；EGFR基因19號(hào)外顯子的缺失突變型檢測(cè)程序?yàn)?5°C 3min ;40個(gè)循環(huán)92°C15sec,60°C 2min(收集突光)；K-ras Glyl2 位點(diǎn)檢測(cè)程序95°C 3min ;40 個(gè)循環(huán)92°C 15sec，55°C 35sec (收集熒光)，75°C 2min ；K-ras Glyl3 位點(diǎn)檢測(cè)程序95°C 3min ;40 個(gè)循環(huán)92°C 15sec，55°C 35sec (收集熒光)，75°C 2min ；B-raf■基因 Val600 檢測(cè)程序?yàn)?5 °C 3min ;40 個(gè)循環(huán)92 °C 15sec，60°C35sec (收集熒光)，65°C 2min ；PI3K 基因 Glu542 位點(diǎn)檢測(cè)程序?yàn)?5°C 3min ;40 個(gè)循環(huán)92 °C 15sec，60°C35sec (收集熒光)，65°C 2min ；PI3K 基因 Glu545 位點(diǎn)檢測(cè)程序?yàn)?5°C 3min ；92°C 15sec，60°C 35sec(收集熒光),65。。2min ；XRCCl 基因 SNP 位點(diǎn) Arg399Gln 檢測(cè)程序?yàn)?5 °C 3min ；92 °C 15sec，60 °C35sec (收集熒光)，75°C 2min。所述步驟3)中的結(jié)果分析具體為a)分析所述陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)參體系和檢測(cè)體系，當(dāng)內(nèi)參體系或檢測(cè)體系無信號(hào)，說明檢測(cè)體系無效，應(yīng)停止分析，更換試劑重新檢測(cè)；只有當(dāng)所述陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)參體系和檢測(cè)體系均有信號(hào)，則繼續(xù)分析結(jié)果；b)在a)的條件下，分析所述質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)參體系和檢測(cè)體系，當(dāng)檢測(cè)體系出現(xiàn)信號(hào)，說明熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶無效或存在污染，應(yīng)停止分析，更換試劑重新檢測(cè)；只有當(dāng)所述質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)體系無信號(hào)而內(nèi)參有信號(hào)時(shí)，則繼續(xù)分析結(jié)果； c)在a)和b)的條件下，當(dāng)所述樣本的內(nèi)參Ct值大于36或無信號(hào)，說明提取的DNA樣本濃度過低或存在Taq酶抑制劑，需重新進(jìn)行DNA提取；d)在a)和b)的條件下，當(dāng)所述樣本的內(nèi)參Ct值小于質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品Ct值，所述樣本檢測(cè)體系有信號(hào)時(shí)，可能由于提取的DNA超出檢測(cè)范圍導(dǎo)致熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶的酶切不完全而引起的非特異性擴(kuò)增所致，則需稀釋所述樣本重新檢測(cè)；只有當(dāng)所述樣本檢測(cè)體系無信號(hào)，判斷為陰性結(jié)果；e)在a)和b)的條件下，當(dāng)所述樣本內(nèi)參Ct值大于所述質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品Ct值并且小于36，所述樣本檢測(cè)體系無信號(hào)時(shí)，則判斷為陰性結(jié)果；當(dāng)所述樣本檢測(cè)體系有信號(hào)時(shí)，則判斷為陽性結(jié)果。本發(fā)明通過在擴(kuò)增引物中通過錯(cuò)配堿基方式引入一個(gè)內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中對(duì)野生型基因進(jìn)行實(shí)時(shí)酶切，以使突變型基因得到選擇性擴(kuò)增從而實(shí)現(xiàn)對(duì)突變基因和SNP位點(diǎn)的檢測(cè)。本方法適用于常見的堿基變異類型，包括體細(xì)胞點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變和遺傳性SNP位點(diǎn)分析，從而為臨床提供一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的基因突變和SNP位點(diǎn)分析方法。


圖I為使用本發(fā)明的方法檢測(cè)EGFR基因Thr790Met突變的陰性樣本有無高溫內(nèi)切酶的比較結(jié)果的圖。圖2為使用本發(fā)明的方法檢測(cè)EGFR基因Thr790Met突變的陽性樣本有無高溫內(nèi)切酶的比較結(jié)果的圖。圖3為使用本發(fā)明的方法檢測(cè)K-ras基因Glyl2Arg突變的陰性樣本有無高溫內(nèi)切酶的比較結(jié)果的圖。圖4為使用本發(fā)明的方法檢測(cè)K-ras基因Glyl2Arg突變的陽性樣本有無高溫內(nèi)切酶的比較結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。以下實(shí)施例中，熱穩(wěn)定性限制性內(nèi)切酶BstUI、PspGI、PhoI、MwoI, TspRI購(gòu)自英國(guó)NEB公司，2XPremix Ex Taq購(gòu)自Takara公司(此Mix已包括PCR緩沖液、dNTP、Mg2+，均由供應(yīng)商提供)，所用引物及探針由上海生工合成，Tiangen組織樣本基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天跟生物科技有限公司。2 X Rox校正液購(gòu)自日本TakaRa公司，人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)SIGMA-ALDRICH。EGFR基因Thr79Met突變型標(biāo)準(zhǔn)品、EGFR基因Leu858Arg突變型標(biāo)準(zhǔn)品、EGFR基因2235_2249 del 15突變型標(biāo)準(zhǔn)品、K_ras基因Glyl2Arg突變型標(biāo)準(zhǔn)品、K_ras基因Glyl3Asp突變型標(biāo)準(zhǔn)品、B-raf基因Val600Glu突變型標(biāo)準(zhǔn)品、PI3K基因Glu542Lys突變型標(biāo)準(zhǔn)品、PI3K基因Glu545Lys突變型標(biāo)準(zhǔn)品、K_ras基因Arg399Gln型標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)生物制品藥品鑒定所。所用儀器為美國(guó)ABI公司ABI7300熒光定量PCR儀。實(shí)施例I引物和探針設(shè)計(jì)引物與探針序列設(shè)計(jì)I、引物設(shè)計(jì) 分別設(shè)計(jì)可擴(kuò)增一段70-150bp的引物，相關(guān)參數(shù)為Tm值58. (TC -60. 0°C，GC值40.0% -65. 0%，引物大小20±3bp。并在引物中通過錯(cuò)配堿基方式引入酶切位點(diǎn)，使野生型的PCR產(chǎn)物可被內(nèi)切酶酶切。EGFR基因Thr790位點(diǎn)在下游引物3’末端第三個(gè)堿基通過c/A錯(cuò)配，引入熱穩(wěn)定內(nèi)切酶Bstn酶切位點(diǎn)CGCG。EGFR基因Leu858位點(diǎn)在上游引物3’末端第二個(gè)堿基通過c/C錯(cuò)配，引入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI酶切位點(diǎn)CCWGG (W = A或者T)。EGFR基因19號(hào)外顯子22352249區(qū)域15種缺失突變，在下游引物3’末端第三個(gè)堿基通過c/C錯(cuò)配，引入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶MwoI酶切位點(diǎn)GCNNNNNNNGC (N = A或者T或者G或者C)。K-ras Gly 12位點(diǎn)在上游引物3’末端第三個(gè)堿基通過c/C錯(cuò)配,引入熱穩(wěn)定內(nèi)切酶PspGI酶切位點(diǎn)CCWGG(W = A或者T)。K-ras Glyl3位點(diǎn)在下游引物3’末端第二個(gè)堿基通過g/G錯(cuò)配，引入熱穩(wěn)定內(nèi)切酶PhoI酶切位點(diǎn)GGCC。B-raf基因Val600位點(diǎn)，具有天然的熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI酶切位點(diǎn)CASTG (S = C或者G)，無需引入酶切位點(diǎn)，即可直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。PI3K基因Glu542位點(diǎn)，在上游引物3’末端第三個(gè)堿基通過a/A錯(cuò)配，引入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI酶切位點(diǎn)CASTG(S = C或者G)。PI3K基因Glu545位點(diǎn)，具有天然的熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI酶切位點(diǎn)CASTG (S = C或者G)，無需引入酶切位點(diǎn)，即可直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。XRCCl基因SNP位點(diǎn)Arg399Gln，在下游引物3’末端第二個(gè)堿基通過c/A錯(cuò)配，引入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI酶切位點(diǎn)CCWGG(W = A或者T)。所設(shè)計(jì)的引物序列如下EGFR Thr790 上游引物:5，-ACGTGTGCCGCCTGCT-3’ (SEQ ID No. I)EGFR Thr790 下游引物(引入酶切位點(diǎn)):5，-CCGAAGGGCATGAGCcGC-3’ (SEQIDNo. 2)EGFR Leu858 上游引物(引入酶切位點(diǎn))5’ -GTCAAGATCACAGATTTTGGcC-3J (SEQID No. 4)EGFR Leu858 下游引物5’ -GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3’ (SEQ ID No. 5)EGFR 19del 上游引物5，-GTCATAGGGACTCTGGATCCC-3’ (SEQ ID No. 7)EGFR 19del 下游引物(引入酶切位點(diǎn)):5，-AITTCCTTGITGGCnTCGcAG-3，(SEQIDNo. 8)K-ras Glyl2 上游引物(引入酶切位點(diǎn))5’-TAAACTTGTGGTAGTTGGAcCT-3’ (SEQID No. 10)K-ras Glyl2 下游引物:5，-TGGTCCTGCACCAGTAATATGC-3，(SEQ ID No. 11)K-ras Glyl3 上游引物5’ -GCCTGCTGAAAATGACTGAA-3’ (SEQ ID No. 13)K-ras Glyl3 下游引物(引入酶切位點(diǎn))5’-GTCAAGGCACTCTTGCCTAgG-3’ (SEQIDNo. 14)Val600 上游引物5，-ACCCACTCCATCGAGATTTC-3’ (SEQ ID No. 16)。Val600 下游引物5’ -AACTCTTCATAATGCTTGCTCTGA-3’ (SEQ ID No. 17)Glu542 上游引物(引入酶切位點(diǎn)):5，-TTTCTACACGAGATCCTCTCaCT-3’ (SEQIDNo. 19) Glu542 下游引物5’-GCTGAGATCAGCCAAAITCAGT-3’ (SEQ ID No. 20)Glu545 上游引物5’-GAGATCCTCTCTCTGAAATCACT-3’ (SEQ ID No. 22)Glu545 下游引物同 SEQ ID No. 20Arg399 上游引物5’-TTGCCAACACCCCCAAGTAC-3’ (SEQ ID No. 23)Arg399 下游引物(引入酶切位點(diǎn)):5’-GGCGTGTGAGGCCTTACCcC-3’ (SEQ IDNo.24)。3、探針設(shè)計(jì)分別在ARMS引物擴(kuò)增片段內(nèi)設(shè)計(jì)探針，相關(guān)參數(shù)為Tm值68. (TC -70. 0°C，GC值40. 0% -70. 0%,對(duì)探針進(jìn)行5’端FAM標(biāo)記，3’端TAMRA標(biāo)記，其序列如下EGFR Thr790 探針5，-FAM-CATCTGCCTCACCTCCACCGTGC-BHQ2-3，(SEQ IDNo. 3)EGFR Leu858 探針5’ -FAM-TTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGT-BHQ2-3’ (SEQ IDNo. 6)EGFR 19del 探針5， -FAM-CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAG-BHQ2-3， (SEQIDN0. 9)K-ras Glyl2 探針5， -FAM-AGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCA-BHQ2-3， (SEQIDNo. 12)。K-ras Glyl3 探針5， -FAM-TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGT-BHQ2-3， (SEQIDNo.15)。Val600探針5’-FAM-ACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTC-BHQ2_3’ (SEQ IDNo. 18)Glu542探針5’-FAM-ATGGAGTCACAGGTAAGTGCTAAAATGGAG-BHQ2_3’ (SEQ IDNo. 21)Glu545 探針同 SEQ ID No. 21Arg399 探針5’-FAM-AGGCCGCATCGTGCGTAAGGAG-BHQ2-3’ (SEQ ID No. 25)。實(shí)施例2利用本方法檢測(cè)基因突變和SNP位點(diǎn)本發(fā)明的檢測(cè)方法是在擴(kuò)增引物中通過錯(cuò)配堿基方式引入一個(gè)內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中對(duì)野生型基因進(jìn)行實(shí)時(shí)酶切，使突變型基因得到選擇性擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)突變基因和SNP位點(diǎn)的檢測(cè)。因此，本發(fā)明的突變富集ARMS熒光定量PCR的檢測(cè)方法整合了酶切富集PCR技術(shù)和ARMS熒光定量PCR技術(shù)，即在一個(gè)反應(yīng)體系中對(duì)樣品分別進(jìn)行酶切、PCR富集和ARMS熒光定量PCR鑒定。具體過程為I、樣本制備采用Tiangen組織樣本基因組DNA提取試劑盒提取樣本基因組DNA。2、檢測(cè)方法EGFR基因Thr790位點(diǎn)的檢測(cè)下游引物3’末端的第三個(gè)堿基引入c/A錯(cuò)配后，在60°C經(jīng)Taq酶PCR擴(kuò)增后，其產(chǎn)物在野生型Thr790位點(diǎn)產(chǎn)生熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶BstM酶切位點(diǎn)CGCG，同時(shí)Bstn酶在60°C時(shí)具有最大酶切活性。因此，在60°C 2min時(shí)，Taq酶PCR擴(kuò)增后，BstUI酶對(duì)擴(kuò)增出的野生型Thr790進(jìn)行酶切，使其野生型基因不能作為模板進(jìn)行下一輪PCR指數(shù)級(jí)擴(kuò)增；而當(dāng)Thr790位點(diǎn)發(fā)生Thr790Met突變后，PCR產(chǎn)物無Bstn酶的CGCG酶切位點(diǎn)，因此，突變型的Thr790位點(diǎn)可進(jìn)行PCR指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，產(chǎn)生熒光信號(hào)。EGFR Thr790位點(diǎn)突變檢測(cè)體系如表I所示。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C 3min ；92°C 15sec，60°C 2min(收集熒光)，共40個(gè)循環(huán)。表I
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)基因突變和SNP位點(diǎn)的試劑盒，其中，所述試劑盒包含酶切野生型基因的熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包含擴(kuò)增引物，在所述擴(kuò)增引物中通過錯(cuò)配堿基的方式引入所述熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，從而使所述熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶在PCR反應(yīng)的同時(shí)酶切野生型PCR產(chǎn)物。
3.—種檢測(cè)基因突變和SNP位點(diǎn)的試劑盒，其中，所述基因突變選自EGFR基因突變、K-ras基因突變、B-raf基因突變和PI3K基因突變中，以及所述SNP位點(diǎn)為XRCCl基因SNP位點(diǎn)， 其中，所述EGFR基因突變選自EGFR基因Thr790Met點(diǎn)突變、Leu858Arg點(diǎn)突變，和EGFR基因 19 號(hào)外顯子 2235_2249 區(qū)域的 2235_2249 del 15、2236_2250 del 15、2236_2253del 18、2237_2251 del 15、2237_2254 del 18、2239_2247 del 9、2239_2253 del 15、2240_2251 del 12、2240_2254 del 15、2235_2252 > AAT、2237_2250 > T、2238_2248 >GC、2238_2252 > GCA、2239_2248TTAAGAGAAG > C、2239_2251 > C 的 15 種缺失突變中，所述 K-ras 基因突變選自 K-ras 基因 Glyl2Arg> Glyl2Cys> Glyl2Ser> Glyl2Ala> Glyl2Asp>Glyl2Val、Glyl3Asp 和 Glyl3Val 點(diǎn)突變中，所述 B_raf 基因突變?yōu)?B_raf 基因 Val600Glu點(diǎn)突變，所述PI3K基因突變選自PI3K基因Glu542Lys和Glu545Lys點(diǎn)突變中，以及所述XRCCl 基因 SNP 位點(diǎn)為 Arg399Gln， 其中，所述試劑盒包括以下組分 (1)檢測(cè)EGFR基因Thr790Met突變的組合體 a)Thr790 Mix :包括Thr790上游引物(SEQ ID No. I)、Thr790下游引物(SEQ IDNo. 2)、Thr790 探針(SEQ ID No. 3)； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶BstUI;和/或 (2)檢測(cè)EGFR基因Leu858Arg突變的組合體 a)Leu858 Mix :包括Leu858上游引物(SEQ ID No. 4)、Leu858下游引物(SEQ IDNo. 5)、Leu858 探針(SEQ ID No. 6)； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI;和/或 (3)檢測(cè)EGFR基因19號(hào)外顯子15種缺失突變的組合體a)19del Mix :包括 19del 上游引物(SEQ ID No. 7)、19del 下游引物(SEQ ID No. 8),19del 探針(SEQ ID No. 9)； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶MwoI;和/或 (4)檢測(cè)K-ras基因Glyl2位點(diǎn)突變的組合體a)Glyl2Mix :包括 Glyl2 上游引物(SEQ ID No. 10)、Glyl2 下游引物(SEQ IDNo. 11)、Glyl2 探針(SEQ ID No. 12)； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI和/或 (5)檢測(cè)K-ras基因Glyl3位點(diǎn)突變的組合體a)Glyl3Mix :包括 Glyl3 上游引物(SEQ ID No. 13)、Glyl3 下游引物(SEQ IDNo. 14)、Glyl3 探針(SEQ ID No. 15)； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PhoI;和/或 (6)檢測(cè)B-raf基因Val600Glu突變的組合體a)Val600Mix 包括 Val600 上游引物(SEQ ID No. 16)、Val600 下游引物(SEQIDNo. 17)、Val600 探針(SEQ ID No. 18)； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI;和/或 (7)檢測(cè)PI3K基因Glu542Lys突變的組合體 a)Glu542Mix 包括 Glu542 上游引物(SEQ IDNo. 19)、Glu542 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu542 探針(SEQ ID No. 21)； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI;和/或 (8)檢測(cè)PI3K基因Glu545Lys突變的組合體 a)Glu545Mix 包括 Glu545 上游引物(SEQ ID No. 22)、Glu545 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu545 探針(SEQ ID No. 21)； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI;和/或 (9)檢測(cè)XRCCl基因SNP位點(diǎn)Arg399Gln的組合體 a)Arg399Mix 包括 Arg399 上游引物(SEQ ID No. 23)、Arg399 下游引物(SEQIDNo. 24)、Arg399 探針(SEQ ID No. 25)； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包括以下組分 (1)檢測(cè)EGFR基因Thr790Met突變的組合體 a)Thr790 Mix :包括Thr790上游引物(SEQ ID No. I)、Thr790下游引物(SEQ IDNo. 2)、Thr790 探針(SEQ ID No. 3)、Rox 校正液、純水； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶BstUI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品； e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和EGFR基因Thr790Met突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或 (2)檢測(cè)EGFR基因Leu858Arg突變的組合體 a)Leu858 Mix :包括Leu858上游引物(SEQ ID No. 4)、Leu858下游引物(SEQ IDNo. 5),Leu858 探針(SEQ ID No. 6)、Rox 校正液、純水； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品； e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和EGFR基因Leu858Arg突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或 (3)檢測(cè)EGFR基因19號(hào)外顯子15種缺失突變的組合體 a)19del Mix :包括 19del 上游引物(SEQ ID No. 7)、19del 下游引物(SEQ ID No. 8),19del 探針(SEQ ID No. 9)、Rox 校正液、純水； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶MwoI； c)、TaqMix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品；e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和EGFR基因2235_2249del 15突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或 (4)檢測(cè)K-ras基因Glyl2位點(diǎn)突變的組合體 a)Glyl2Mix :包括 Glyl2 上游引物(SEQ ID No. 10)、Glyl2 下游引物(SEQ IDNo. 11)、Gly 12 探針(SEQ ID No. 12)、Rox 校正液、純水； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品； e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和K-ras基因Glyl2Arg突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或 (5)檢測(cè)K-ras基因Glyl3位點(diǎn)突變的組合體 a)Glyl3Mix :包括 Glyl3 上游引物(SEQ ID No. 13)、Glyl3 下游引物(SEQ IDNo. 14)、Gly 13 探針(SEQ ID No. 15)、Rox 校正液、純水； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PhoI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品； e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和K-ras基因Glyl3Asp突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或 (6)檢測(cè)B-raf基因Val600Glu突變的組合體 a)Val600 Mix 包括 Val600 上游引物(SEQ ID No. 16)、Val600 下游引物(SEQIDNo. 17)、Val600 探針(SEQ ID No. 18)、Rox 校正液、純水； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品； e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和B-raf基因Val600Glu突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或 (7)檢測(cè)PI3K基因Glu542Lys突變的組合體 a)Glu542Mix 包括 Glu542 上游引物(SEQ IDNo. 19)、Glu542 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu542 探針(SEQ ID No. 21)、Rox 校正液、純水； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品； e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和PI3K基因Glu542Lys突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或 (8)檢測(cè)PI3K基因Glu545Lys突變的組合體 a)Glu545Mix 包括 Glu545 上游引物(SEQ ID No. 22)、Glu545 下游引物(SEQIDNo. 20)、Glu545 探針(SEQ ID No. 21)、Rox 校正液、純水； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品；e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和PI3K基因Glu545Lys突變型標(biāo)準(zhǔn)品；和/或 (9)檢測(cè)XRCCl基因SNP位點(diǎn)Arg399Gln的組合體 a)Arg399Mix 包括 Arg399 上游引物(SEQ ID No. 23)、Arg399 下游引物(SEQIDNo. 24)、Arg399 探針(SEQ ID No. 25)、Rox 校正液、純水； b)熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI； c)Taq Mix :包括Taq酶、Taq酶反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+、無菌純水； d)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品； e)陽性標(biāo)準(zhǔn)品包括人基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和K-ras基因Arg399Gln型標(biāo)準(zhǔn)品。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于，所述組合體中，引物和探針的比例為I : I 5 2，優(yōu)選為5 4。
6.一種檢測(cè)基因突變和SNP位點(diǎn)的方法，其特征在于，在一個(gè)反應(yīng)體系中采用熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶在PCR反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行酶切野生型PCR產(chǎn)物的反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括在擴(kuò)增引物中通過錯(cuò)配堿基的方式引入所述熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶在95°C的半衰期為20_120min。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述基因突變選自EGFR基因突變、K-ras基因突變、B-raf基因突變和PI3K基因突變中，以及所述SNP位點(diǎn)為XRCCl基因SNP位點(diǎn)， 其中，所述EGFR基因突變選自EGFR基因Thr790Met點(diǎn)突變、Leu858Arg點(diǎn)突變，和EGFR基因 19 號(hào)外顯子 2235_2249 區(qū)域的 2235_2249 del 15、2236_2250 del 15、2236_2253 del18、2237_2251 del 15、2237_2254 del 18、2239_2247del 9、2239_2253 del 15、2240_2251del 12、2240_2254 del 15、2235_2252 > AAT、2237_2250 > T、2238_2248 > GC、2238_2252> GCA、2239_2248TTAAGAGAAG > C、2239_2251 > C 的 15 種缺失突變中，所述 K_ras 基因突變選自 K-ras 基因 Glyl2Arg、Glyl2Cys、Glyl2Ser、Glyl2Ala、Glyl2Asp、Glyl2Val、Glyl3Asp和Glyl3Val點(diǎn)突變中，所述B_raf基因突變?yōu)锽_raf基因Val600Glu點(diǎn)突變，所述PI3K基因突變選自PI3K基因Glu542Lys和Glu545Lys點(diǎn)突變中，以及所述XRCCl基因SNP 位點(diǎn)為 Arg399Gln， 所述方法進(jìn)ー步包括以下步驟 1)制備檢測(cè)樣本； 2)在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行邊擴(kuò)增邊酶切反應(yīng)，其中，在引物中通過錯(cuò)配堿基方式引入酶切位點(diǎn)，使野生型的PCR產(chǎn)物被內(nèi)切酶酶切，其中 ①檢測(cè)EGFR基因Thr790Met突變的引物和探針的制備 EGFR基因Thr790位點(diǎn)在下游引物3’末端第三個(gè)堿基通過c/A錯(cuò)配，引入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶Bstn酶切位點(diǎn)CGCG，引物及探針序列如下EGFR Thr790 上游引物:5，-ACGTGTGCCGCCTGCT-3’ (SEQ ID No. I)EGFR Thr790 下游引物5’ -CCGAAGGGCATGAGCcGC-3 ’ (SEQ ID No. 2)EGFR Thr790 探針5，-FAM-CATCTGCCTCACCTCCACCGTGC-BHQ2-3，(SEQ IDNo. 3)； ②檢測(cè)EGFR基因Leu858Arg突變的引物和探針的制備EGFR基因Leu858位點(diǎn)在上游引物3’末端第二個(gè)堿基通過c/C錯(cuò)配，引入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI酶切位點(diǎn)CCWGG，W = A或者T，引物及探針序列如下EGFR Leu858 上游引物5’ -GTCAAGATCACAGATTTTGGcC_3 ’ (SEQ ID No. 4)EGFR Leu858 下游引物5，-GGAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3 ’ (SEQ ID No. 5)EGFR Leu858 探針5，-FAM-TTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGT-BHQ2-3，(SEQID No. 6)； ③檢測(cè)EGFR基因19號(hào)外顯子15種缺失突變的引物和探針的制備 EGFR基因19號(hào)外顯子的缺失突變，在下游引物3’末端第三個(gè)堿基通過c/C錯(cuò)配，引入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶MwoI酶切位點(diǎn)GCNNNNNNNGC，N = A、T、G或者C，引物及探針序列如下 EGFR 19del 上游引物:5，-GTCATAGGGACTCTGGATCCC-3，(SEQ ID No. 7)EGFR 19del 下游引物5’ -ATTTCCTTGTTGGCTTTCGcAG-3’ (SEQ ID No. 8) EGFR 19del 探針5’ -FAM-CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAG-BHQ2-3’ (SEQIDNo.9)； ④檢測(cè)K-ras基因Glyl2位點(diǎn)突變的引物和探針的制備 K-ras基因Gly 12位點(diǎn)在上游引物3’末端第三個(gè)堿基通過c/C錯(cuò)配,引入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI酶切位點(diǎn)CCWGG，W = A或者T，引物及探針序列如下 K-ras Glyl2 上游引物:5，-TAAACTTGTGGTAGTTGGAcCT-3，(SEQ ID No. 10) K-ras Glyl2 下游引物:5，-TGGTCCTGCACCAGTAATATGC-3，(SEQ ID No. 11) K-ras Glyl2 探針5， -FAM-AGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCA-BHQ2-3， (SEQ IDNo. 12)； ⑤檢測(cè)K-ras基因Glyl3位點(diǎn)突變的引物和探針的制備 K-ras基因Glyl3位點(diǎn)在下游引物3’末端第二個(gè)堿基通過g/G錯(cuò)配,引入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PhoI酶切位點(diǎn)GGCC，引物及探針序列如下K-ras Glyl3 上游引物5，-GCCTGCTGAAAATGACTGAA-3’ (SEQ ID No. 13)K-ras Glyl3 下游引物5，-GTCAAGGCACTCTTGCCTAgG-3’ (SEQ ID No. 14)K-ras Glyl3 探針5，-FAM-TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGT-BHQ2-3，(SEQ IDNo. 15)； ⑥檢測(cè)B-raf基因Val600Glu突變的引物和探針的制備 B-raf基因Val600位點(diǎn)，具有天然的熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI酶切位點(diǎn)CASTG，S = C或者G，無需引入酶切位點(diǎn)，即可直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，引物及探針序列如下Val600 上游引物:5，-ACCCACTCCATCGAGATTTC-3’ (SEQ ID No. 16)Val600 下游引物5’ -AACTCTTCATAATGCTTGCTCTGA-3’ (SEQ ID No. 17)Val600 探針5’ -FAM-ACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTC-BHQ2-3’ (SEQID No. 18)； ⑦檢測(cè)PI3K基因Glu542Lys突變的引物和探針的制備 PI3K基因Glu542位點(diǎn)，在上游引物3’末端第三個(gè)堿基通過a/A錯(cuò)配，弓丨入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI酶切位點(diǎn)CASTG，S = C或者G，引物及探針序列如下Glu542 上游引物:5，-TTTCTACACGAGATCCTCTCaCT-3’ (SEQ ID No. 19)Glu542 下游引物5’ -GCTGAGATCAGCCAAATTCAGT-3’ (SEQ ID No. 20)Glu542 探針5’-FAM-ATGGAGTCACAGGTAAGTGCTAAAATGGAG-BHQ2-3’ (SEQ ID No. 21)； ⑧檢測(cè)PI3K基因Glu545Lys突變的引物和探針的制備 PI3K基因Glu545位點(diǎn)，具有天然的熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI酶切位點(diǎn)CASTG，S = C或者G，無需引入酶切位點(diǎn)，即可直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，引物及探針序列如下Glu545 上游引物5’ -GAGATCCTCTCTCTGAAATCACT-3’ (SEQ ID No. 22) Glu545 下游引物同 SEQ ID No. 20 Glu545 探針同 SEQ ID No. 21 ； ⑨檢測(cè)XRCCl基因SNP位點(diǎn)Arg399Gln的引物和探針的制備 XRCCl基因SNP位點(diǎn)Arg399Gln，在下游引物3’末端第二個(gè)堿基通過c/A錯(cuò)配，引入熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI酶切位點(diǎn)CCWGG，W = A或者T，引物及探針序列如下Arg399 上游引物5’ -TTGCCAACACCCCCAAGTAC-3’ (SEQ ID No. 23)Arg399 下游引物5’ -GGCGTGTGAGGCCTTACCcC-3 ’ (SEQ ID No. 24)Arg399 探針5’-FAM-AGGCCGCATCGTGCGTAAGGAG-BHQ2-3’ (SEQ ID No. 25)； 以及，使用選自上述制備引物和探針中的一種或多種分別進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)； 3)結(jié)果分析。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中進(jìn)ー步包括 a)試劑配制 Thr790內(nèi)參體系:包括Taq Mix、Thr790 Mix、純水；Thr790檢測(cè)體系:包括Taq Mix、Thr790 Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶BstUI ； Leu858內(nèi)參體系包括Taq Mix、Leu858 Mix、純水；Leu858檢測(cè)體系包括Taq Mix、Leu858 Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI ； 19del內(nèi)參體系:包括Taq Mix、19del Mix、純水；19del檢測(cè)體系:包括Taq Mix、19delMix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶MwoI ； Glyl2內(nèi)參體系:包括Taq Mix、Glyl2 Mix、純水;Glyl2檢測(cè)體系:包括Taq Mix、Glyl2Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI ； Glyl3內(nèi)參體系:包括Taq Mix、Glyl3 Mix、純水;Glyl3檢測(cè)體系:包括Taq Mix、Glyl3Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PhoI ； Val600內(nèi)參體系包括Taq Mix、Val600 Mix、純水；Val600檢測(cè)體系包括Taq Mix、Val600 Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI ； Glu545內(nèi)參體系包括Taq Mix、Glu542 Mix、純水；Glu545檢測(cè)體系包括Taq Mix、Glu542 Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI ； Glu545內(nèi)參體系包括Taq Mix、Glu545 Mix、純水；Glu545檢測(cè)體系包括Taq Mix、Glu545 Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶TspRI ； Arg399內(nèi)參體系包括Taq Mix、Arg399 Mix、純水；Arg399檢測(cè)體系包括Taq Mix、Arg399 Mix、熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶PspGI ； b)向a)中的內(nèi)參體系及檢測(cè)體系中，加入所述步驟I)中制備的檢測(cè)樣本，以及陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品； C)、運(yùn)行程序， Thr790Met 檢測(cè)程序95°C 3min ;40 個(gè)循環(huán)92°C 15sec，60°C 2min 收集熒光；Leu858Arg 檢測(cè)程序?yàn)?5°C 3min ;40 個(gè)循環(huán)92°C 15sec，60°C 35sec 收集熒光，.75 °C 2min ； EGFR基因19號(hào)外顯子的缺失突變型檢測(cè)程序?yàn)?5°C 3min ;40個(gè)循環(huán)92°C 15sec，.60 °C 2min收集熒光； K-ras Glyl2 位點(diǎn)檢測(cè)程序95°C 3min ;40 個(gè)循環(huán)92°C 15sec，55°C 35sec 收集熒光，75。。2min ； K-ras Glyl3 位點(diǎn)檢測(cè)程序95°C 3min ;40 個(gè)循環(huán)92°C 15sec，55°C 35sec 收集熒光，75。。2min ； B-raf 基因 Val600 檢測(cè)程序?yàn)?5°C 3min ；40 個(gè)循環(huán)92°C 15sec，60°C 35sec 收集突光，65。。2min ； PI3K 基因 Glu542 位點(diǎn)檢測(cè)程序?yàn)?5°C 3min ;40 個(gè)循環(huán)92°C 15sec，60°C 35sec 收集熒光，65°C 2min ；PI3K 基因 Glu545 位點(diǎn)檢測(cè)程序?yàn)?5°C 3min ；92°C 15sec，60°C 35sec 收集熒光，.65 °C 2min ； XRCCl 基因 SNP 位點(diǎn) Arg399Gln 檢測(cè)程序?yàn)?5°C 3min ；92°C 15sec，60°C 35sec 收集突光，75。。2min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)基因突變(包括點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變)和SNP位點(diǎn)的方法和試劑盒，該方法將熱穩(wěn)定性內(nèi)切酶與Taq酶融合在一個(gè)反應(yīng)體系中，通過在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中對(duì)野生型堿基位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時(shí)酶切，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特異性堿基位點(diǎn)的檢測(cè)。本方法適用于常見的堿基變異類型，包括體細(xì)胞點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變和遺傳性SNP位點(diǎn)分析，從而為臨床提供一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的基因突變和SNP位點(diǎn)分析方法。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102660641SQ20121011510
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者劉淇, 徐磊, 李雪, 謝飛飛, 趙金銀, 陳唯軍 申請(qǐng)人:北京宏微特斯生物科技有限公司