專利名稱：一種無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)胰蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)胰蛋白酶的方法，屬于材料、生物、和分析化學(xué)交叉學(xué)科的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種基于超分子組裝體在酶催化水解作用下解組裝來(lái)實(shí)現(xiàn)胰蛋白酶檢測(cè)的方法的技術(shù)方案。
背景技術(shù)：
胰蛋白酶是蛋白質(zhì)分解中最重要的消化酶之一，胰蛋白酶原的分泌、活化、抑制以及循環(huán)的不平衡會(huì)導(dǎo)致急性或慢性的胰腺疾病，嚴(yán)重的例如胰腺癌。胰腺癌是惡性度最高、預(yù)后最差的一種腫瘤，患者的5年生存率一般不到5%，大約每年有35000例胰腺癌是由于絲氨酸蛋白酶尤其是胰蛋白酶的不平衡引起的。此外胰蛋白酶不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。目前發(fā)展起來(lái)的測(cè)定胰蛋白酶的方法主要有紫外分光光度法、比色法、熒光法、免疫法、放射性元素標(biāo)記法、質(zhì)譜法(MS)、液相色譜法(HPLC)、電泳法等。紫外法和比色法操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低，重現(xiàn)性差。免疫法靈敏度高，如專利201020245770. X所述，但由于單克隆抗體的使用使得成本也高，且需要一定的操作技術(shù)。放射性元素標(biāo)記法需要對(duì)底物進(jìn)行標(biāo)記，制備復(fù)雜并且有一定的安全性問(wèn)題等等。質(zhì)譜儀器昂貴，對(duì)樣品的純度要求高，色譜以及電泳法需要比較復(fù)雜的操作和較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間。相比這些方法，熒光法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，具有臨床應(yīng)用的潛在可能。但一般的熒光法需要熒光標(biāo)記底物，制備復(fù)雜且提高了成本，使其應(yīng)用受到限制，近年來(lái)無(wú)標(biāo)記的方法受到關(guān)注。目前報(bào)道的無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)的方法主要是應(yīng)用水溶性熒光共軛聚合物以及新型的聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子，這些分子的合成與分離仍然比較復(fù)雜。因而建立試劑易得，制備簡(jiǎn)單的熒光檢測(cè)方法具有重要的意義。通過(guò)檢索，未見(jiàn)無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)胰蛋白酶的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一種無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)胰蛋白酶的方法的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、無(wú)須有機(jī)合成的無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)胰蛋白酶方法。本發(fā)明一種無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)胰蛋白酶的方法，其特征在于是一種基于超分子組裝體在酶催化水解作用下解組裝來(lái)實(shí)現(xiàn)胰蛋白酶檢測(cè)的方法，其具體步驟為
I配制熒光探針的有機(jī)溶液
以疏水染料為熒光探針，將疏水染料溶解到市售光譜純丙酮、氯仿或甲醇的有機(jī)溶劑中，配制濃度為10_3 10_6mol L—1熒光探針的有機(jī)溶液；
II測(cè)定表面活性劑的臨界膠束濃度CMC:
將表面活性劑溶解于濃度為10 mM,pH 8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，配制濃度范圍為ImolL—卜KTmol L—1的梯度溶液，用微量進(jìn)樣器移取步驟I配制的熒光探針有機(jī)溶液，加入到梯 度溶液中，使梯度溶液中探針的終濃度為10_8 10_6 mo I L—1，以4(Tl00kHz敞口超聲波處理1(T60分鐘，靜置0. 5^12小時(shí)后進(jìn)行熒光光譜檢測(cè)，測(cè)定表面活性劑的臨界膠束濃度CMC ；
III配制超分子組裝體溶液
根據(jù)步驟II得到的表面活性劑的臨界膠束濃度CMC，確定表面活性劑濃度為
0.f I. 6CMC，將帶相反電荷的聚電解質(zhì)溶解于濃度為10 mM,pH 8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中制成聚電解質(zhì)溶液；按照聚電解質(zhì)與表面活性劑電荷比為1:1，在表面活性劑的溶液中加入等體積的聚電解質(zhì)溶液，表面活性劑與帶相反電荷的聚電解質(zhì)通過(guò)疏水與靜電作用形成超分子組裝體，混合均勻，靜置1(T15分鐘，得到超分子組裝體溶液，該超分子組裝體溶液的重量百分濃度為0. OfO. 2%；
IV配制檢測(cè)液 再次用微量進(jìn)樣器移取步驟I配制的熒光探針有機(jī)溶液，分別加入到III所得到的超分子組裝體溶液中，使該超分子組裝體溶液中探針的終濃度為10_8 IO-6Hi0I L—1，以4(Tl00kHz敞口超聲波處理10飛0分鐘，靜置0. 5^12小時(shí)后得到檢測(cè)液；
V測(cè)定催化水解時(shí)間
步驟IV得到的檢測(cè)液在35 37°C下培養(yǎng)10 15分鐘，將胰蛋白酶溶解于濃度為10 mM,pH 8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，在檢測(cè)液中分別加入相同體積的胰蛋白酶緩沖溶液，以只加入緩沖溶液作為空白對(duì)照，胰蛋白酶終濃度范圍為0.0廣100 mL—1，在35 37°C下進(jìn)行熒光光譜跟蹤檢測(cè)，以熒光發(fā)射峰強(qiáng)度下降的比率對(duì)時(shí)間作圖，得到不同濃度胰蛋白酶催化水解條件下熒光發(fā)射峰強(qiáng)度線性下降的時(shí)間范圍；
VI測(cè)定胰蛋白酶活性
根據(jù)步驟V得到的時(shí)間范圍，取各濃度條件下共同線性時(shí)間范圍的最大值，以熒光發(fā)射峰強(qiáng)度下降的比率對(duì)加入胰蛋白酶濃度作圖，得到檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。上述一種無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的疏水染料為市售純度高于98%的芘、尼羅紅、香豆素481、蘇丹紅或氟硼熒染料B0DIPY，氟硼熒染料BODIPY是指 BODIPY FL,BODIPY R6G、BODIPY TMR,BODIPY 581/591、BODIPY TR 或BODIPY 630/650。上述一種無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的表面活性劑為帶負(fù)電荷的烷基硫酸鹽或烷基磺酸鹽，烷基硫酸鹽為市售分析純十二烷基硫酸鈉、十四烷基硫酸鈉或十六烷基硫酸鈉；烷基磺酸鹽為市售分析純十二烷基磺酸鈉、十四烷基磺酸鈉或十TK燒基橫酸納。上述一種無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的聚電解質(zhì)是可以被胰蛋白酶催化水解的多肽，多肽為市售純度高于99%的，長(zhǎng)度為1(T16的帶正電荷的精氨酸序列 Arg10 Arg16O本發(fā)明一種無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)胰蛋白酶活性的方法與現(xiàn)技術(shù)相比具有的有益效果:
1)通過(guò)超分子組裝體解組裝的方式進(jìn)行檢測(cè)，不需要復(fù)雜的有機(jī)合成和固定過(guò)程，制備簡(jiǎn)單、成本低、無(wú)污染；
2)在超分子組裝體內(nèi)部包埋熒光染料，通過(guò)熒光方法進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短，容易實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)。


圖I是表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)的臨界膠束濃度測(cè)定曲線；
圖2是表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)分別與不同長(zhǎng)度的多肽(Argltl與Arg6)組裝行為的差異。
具體實(shí)施例方式以疏水染料作為熒光探針，首先測(cè)定了表面活性劑的臨界膠束濃度，然后在表面活性劑臨界膠束濃度以下，表面活性劑與帶相反電荷的聚電解質(zhì)通過(guò)疏水與靜電作用形成超分子組裝體，疏水染料包埋于組裝體內(nèi)腔，最后加入對(duì)聚電解質(zhì)有水解作用的酶，將高分子量的聚電解質(zhì)催化水解為低分子量的聚電解質(zhì)，誘導(dǎo)組裝體解組裝，使組裝體內(nèi)腔包埋的熒光探針釋放，通過(guò)熒光強(qiáng)度的降低來(lái)實(shí)現(xiàn)酶活性的檢測(cè)。下面的實(shí)施方式是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施方式I:
I配制熒光探針的有機(jī)溶液
以芘為熒光探針，將芘溶解到丙酮中，在10 HiL容量瓶中配制濃度為10_2 mo I L—1芘的丙酮溶液，進(jìn)一步用丙酮稀釋到10_5 mol L-1 ；
II測(cè)定表面活性劑的臨界膠束濃度CMC:
將十二烷基硫酸鈉SDS溶解于濃度為10 mM, pH 8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，在10 mL容量瓶中配制10_2 mol L—1的溶液，進(jìn)一步用緩沖液做倍比稀釋，得到濃度范圍為ImolL-1 10_7mOl L-1的梯度溶液；
用微量進(jìn)樣器移取步驟I配制得到的熒光探針的有機(jī)溶液，分別加入到配制的梯度溶液中，使梯度溶液中熒光探針的終濃度為5 X KTmol L—1。以IOOkHz敞口超聲波處理10分鐘，靜置0. 5小時(shí)后檢測(cè)熒光激發(fā)光譜。以熒光激發(fā)光譜1338/1333的比值對(duì)表面活性劑濃度的對(duì)數(shù)值作圖，擬合得到s型曲線，曲線的第一個(gè)突變點(diǎn)對(duì)應(yīng)濃度即為表面活性劑的臨界膠束濃度。熒光光譜測(cè)定得到表面活性劑的臨界膠束濃度。III配制超分子組裝體溶液
確定表面活性劑濃度為0. 6 CMC，將Argltl溶解于濃度為10 mM, pH 8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，按照聚電解質(zhì)與表面活性劑電荷比為1:1加入等體積的Argltl的緩沖溶液，表面活性劑與帶相反電荷的聚電解質(zhì)通過(guò)疏水與靜電作用構(gòu)建超分子組裝體，混合均勻，靜置10分鐘，得到組裝體溶液，組裝體溶液的重量百分濃度為0. 075% ；
IV配制檢測(cè)液
再次用微量進(jìn)樣器移取步驟I配制的熒光探針有機(jī)溶液，分別加入到III所得到的組裝體溶液中，使組裝體溶液中熒光探針的終濃度為5X 10_7mol L'以IOOkHz敞口超聲波處理10分鐘，靜置0. 5小時(shí)后得到檢測(cè)液；
V測(cè)定催化水解時(shí)間
步驟IV得到的檢測(cè)液中在35°C下培養(yǎng)10分鐘，將胰蛋白酶溶解于濃度為10 mM, pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，在檢測(cè)液中分別加入相同體積不同濃度的胰蛋白酶，以加入緩沖溶液作為空白對(duì)照，濃度范圍從0.01到100呢mL—1，在35°C下進(jìn)行熒光光譜跟蹤檢測(cè)，以熒光發(fā)射峰強(qiáng)度下降的比率對(duì)時(shí)間作圖，得到不同濃度胰蛋白酶催化水解條件下熒光發(fā)射峰強(qiáng)度線性下降的時(shí)間范圍；
VI測(cè)定胰蛋白酶活性
根據(jù)步驟V得到的時(shí)間范圍，取各濃度條件下共同線性時(shí)間范圍的最大值，以熒光發(fā)射峰強(qiáng)度下降的比率對(duì)加入胰蛋白酶濃度作圖，得到檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光強(qiáng)度下降的比率為(I-Iq)Aq XlOO %，I。代表只加緩沖溶液的空白對(duì)照熒光發(fā)射峰處熒光強(qiáng)度，I代表加入不同濃度胰蛋白酶后發(fā)射峰處熒光強(qiáng)度。熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明發(fā)射峰位置熒光強(qiáng)度下降比率與胰蛋白酶濃度有很好的線性關(guān)系。
特異性實(shí)驗(yàn)在相同測(cè)試條件下，在組裝體溶液中分別加入相同濃度的堿性磷酸酶、溶菌酶、葡萄糖氧化酶、胰蛋白酶，37°C下培養(yǎng)半小時(shí)后進(jìn)行熒光光譜檢測(cè)。熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明組裝體系對(duì)胰蛋白酶檢測(cè)有很好的特異性，其他蛋白不會(huì)影響檢測(cè)。實(shí)施方式2
I配制熒光探針的有機(jī)溶液
以尼羅紅為熒光探針，將尼羅紅溶解到甲醇中，在10 mL容量瓶中配制濃度為KT1 molL—1尼羅紅的甲醇溶液，進(jìn)一步用甲醇稀釋到10_3 mol L-1 ；
II測(cè)定表面活性劑的臨界膠束濃度CMC:
將十四烷基硫酸鈉溶解于濃度為10 mM,pH 8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，在10 mL容量瓶中配制10_2 mol L—1的溶液，進(jìn)一步用緩沖液做倍比稀釋，得到濃度范圍為lmol d0_7mOlL-1的梯度溶液；
用微量進(jìn)樣器移取步驟I配制得到的熒光探針的有機(jī)溶液，分別加入到配制的梯度溶液中，使梯度溶液中熒光探針的終濃度為10_6 mol L'以70 kHz敞口超聲波處理30分鐘，靜置I小時(shí)后檢測(cè)熒光激發(fā)光譜。以熒光發(fā)射光譜發(fā)射峰強(qiáng)度對(duì)表面活性劑濃度對(duì)數(shù)值作圖，擬合得到s型曲線，曲線的第一個(gè)突變點(diǎn)對(duì)應(yīng)濃度即為表面活性劑的臨界膠束濃度。熒光光譜測(cè)定得到表面活性劑的臨界膠束濃度。III配制超分子組裝體溶液
固定表面活性劑濃度為0. 1CMC，將Arg16溶解于濃度為10 mM, pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，按照聚電解質(zhì)與表面活性劑電荷比為1:1加入等體積的Arg16的緩沖溶液，表面活性劑與帶相反電荷的聚電解質(zhì)通過(guò)疏水與靜電作用構(gòu)建超分子組裝體，混合均勻，靜置15分鐘，得到組裝體溶液，組裝體溶液的重量百分濃度為0. 01% ；
IV配制檢測(cè)液
再次用微量進(jìn)樣器移取步驟I配制的熒光探針有機(jī)溶液，分別加入到III所得到的組裝體溶液中，使組裝體溶液中探針的終濃度為10_6 mol L'以70kHz敞口超聲波處理30分鐘，靜置I小時(shí)后得到檢測(cè)液；
V測(cè)定催化水解時(shí)間
步驟IV得到的檢測(cè)液中在37°C下培養(yǎng)15分鐘，將胰蛋白酶溶解于濃度為10 mM, pH8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，在檢測(cè)液中分別加入相同體積不同濃度的胰蛋白酶，以加入緩沖溶液作為空白對(duì)照，濃度范圍從0. 01到100呢mL—1，在37°C下進(jìn)行熒光光譜跟蹤檢測(cè)，以熒光發(fā)射峰強(qiáng)度下降的比率對(duì)時(shí)間作圖，得到不同濃度胰蛋白酶催化水解條件下熒光發(fā)射峰強(qiáng)度線性下降的時(shí)間范圍；
VI測(cè)定胰蛋白酶活性
根據(jù)步驟V得到的時(shí)間范圍，取各濃度條件下共同線性時(shí)間范圍的最大值，以熒光發(fā)射峰強(qiáng)度下降的比率對(duì)加入胰蛋白酶濃度作圖，得到檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光強(qiáng)度下降的比率為(I-Iq)Aq XlOO %，I。代表只加緩沖溶液的空白對(duì)照熒光發(fā)射峰處熒光強(qiáng)度，I代表加入不同濃度胰蛋白酶后發(fā)射峰處熒光強(qiáng)度。熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明發(fā)射峰位置熒光強(qiáng)度下降比率與胰蛋白酶濃度有很好的線性關(guān)系。特異性實(shí)驗(yàn)在相同測(cè)試條件下，在組裝體溶液中分別加入相同濃度的堿性磷酸酶、溶菌酶、葡萄糖氧化酶、胰蛋白酶，37°C下培養(yǎng)半小時(shí)后進(jìn)行熒光光譜檢測(cè)。 熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明組裝體系對(duì)胰蛋白酶檢測(cè)有很好的特異性，其他蛋白不會(huì)影響檢測(cè)。實(shí)施方式3
I配制熒光探針的有機(jī)溶液
以蘇丹紅為熒光探針，將蘇丹紅溶解到氯仿中，在10 mL容量瓶中配制濃度為KT1moIL—1蘇丹紅的氯仿溶液，進(jìn)一步用氯仿稀釋到10_3 mol L-1 ；
II測(cè)定表面活性劑的臨界膠束濃度CMC:
將十六烷基硫酸鈉溶解于濃度為10 mM,pH 8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，在10 mL容量瓶中配制10_2 mol L—1的溶液，進(jìn)一步用緩沖液做倍比稀釋，得到濃度范圍為lmol d0_7mOlL-1的梯度溶液；
用微量進(jìn)樣器移取步驟I配制得到的熒光探針的有機(jī)溶液，分別加入到配制的梯度溶液中，使梯度溶液中熒光探針的終濃度為10_6 mol L'以40 kHz敞口超聲波處理60分鐘，靜置12小時(shí)后檢測(cè)熒光激發(fā)光譜。以熒光發(fā)射光譜發(fā)射峰強(qiáng)度對(duì)表面活性劑濃度對(duì)數(shù)值作圖，擬合得到s型曲線，曲線的第一個(gè)突變點(diǎn)對(duì)應(yīng)濃度即為表面活性劑的臨界膠束濃度。熒光光譜測(cè)定得到表面活性劑的臨界膠束濃度。III配制超分子組裝體溶液
固定表面活性劑濃度為0. 8 CMC，將Arg12溶解于濃度為10 mM, pH 8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，按照聚電解質(zhì)與表面活性劑電荷比為1:1加入等體積的Arg16的緩沖溶液，表面活性劑與帶相反電荷的聚電解質(zhì)通過(guò)疏水與靜電作用構(gòu)建超分子組裝體，混合均勻，靜置10分鐘，得到組裝體溶液，組裝體溶液的重量百分濃度為0. 12% ；
IV配制檢測(cè)液
再次用微量進(jìn)樣器移取步驟I配制的熒光探針有機(jī)溶液，分別加入到III所得到的混合溶液中，使混合溶液中探針的終濃度為10_6 mol L'以40kHz敞口超聲波處理60分鐘，靜置12小時(shí)后得到檢測(cè)液；
V測(cè)定催化水解時(shí)間
步驟IV得到的檢測(cè)液中在37°C下培養(yǎng)10分鐘，將胰蛋白酶溶解于濃度為10 mM, pH
8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，在檢測(cè)液中分別加入相同體積不同濃度的胰蛋白酶，以加入緩沖溶液作為空白對(duì)照，濃度范圍從0. 01到100呢mL—1，在37°C下進(jìn)行熒光光譜跟蹤檢測(cè)，以熒光發(fā)射峰強(qiáng)度下降的比率對(duì)時(shí)間作圖，得到不同濃度胰蛋白酶催化水解條件下熒光發(fā)射峰強(qiáng)度線性下降的時(shí)間范圍；
VI測(cè)定胰蛋白酶活性
根據(jù)步驟V得到的時(shí)間范圍，取各濃度條件下共同線性時(shí)間范圍的最大值，以熒光發(fā)射峰強(qiáng)度下降的比率對(duì)加入胰蛋白酶濃度作圖，得到檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
熒光強(qiáng)度下降的比率為(I-Ici)Atl Xioo %，Itl代表只加緩沖溶液的空白對(duì)照熒光發(fā)射峰處熒光強(qiáng)度，I代表加入不同濃度胰蛋白酶后發(fā)射峰處熒光強(qiáng)度。熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明發(fā)射峰位置熒光強(qiáng)度下降比率與胰蛋白酶濃度有很好的線性關(guān)系。 特異性實(shí)驗(yàn)在相同測(cè)試條件下，在組裝體溶液中分別加入相同濃度的堿性磷酸酶、溶菌酶、葡萄糖氧化酶、胰蛋白酶，37°C下培養(yǎng)半小時(shí)后進(jìn)行熒光光譜檢測(cè)。熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明組裝體系對(duì)胰蛋白酶檢測(cè)有很好的特異性，其他蛋白不會(huì)影響檢測(cè)。實(shí)施方式4
I配制熒光探針的有機(jī)溶液
除所用熒光探針為香豆素481，其他同實(shí)施方式2 ；
II測(cè)定表面活性劑的臨界膠束濃度CMC:
除所用表面活性劑為十二烷基磺酸鈉，其他同實(shí)施方式2 ；
熒光光譜測(cè)定得到表面活性劑的臨界膠束濃度。III配制超分子組裝體溶液
除表面活性劑濃度為I. 6CMC，所用聚電解質(zhì)為Arg14，組裝體溶液的重量百分濃度為2%，其他同實(shí)施方式I ;
IV配制檢測(cè)液同實(shí)施方式2;
V測(cè)定催化水解時(shí)間同實(shí)施方式2 ；
VI測(cè)定胰蛋白酶活性同實(shí)施方式I ;
熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明發(fā)射峰位置熒光強(qiáng)度下降比率與胰蛋白酶濃度有很好的線性關(guān)系。特異性實(shí)驗(yàn)
熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明組裝體系對(duì)胰蛋白酶檢測(cè)有很好的特異性，其他蛋白不會(huì)影響檢測(cè)。實(shí)施方式5
I配制熒光探針的有機(jī)溶液
除所用熒光探針為BODIPY FL，濃度為10_5mol L—1，其他同實(shí)施方式2 ；
II測(cè)定表面活性劑的臨界膠束濃度CMC
除所用表面活性劑為十四烷基磺酸鈉，熒光探針的終濃度為10_8 mol L—1，其他同實(shí)施方式2 ；
熒光光譜測(cè)定得到表面活性劑的臨界膠束濃度。III配制超分子組裝體溶液
除表面活性劑濃度為0. 6CMC，所用聚電解質(zhì)為Arg13，組裝體溶液的重量百分濃度為0.08%，其他同實(shí)施方式I ;
IV配制檢測(cè)液同實(shí)施方式2;
V測(cè)定催化水解時(shí)間同實(shí)施方式2 ；
VI測(cè)定胰蛋白酶活性同實(shí)施方式I ;
熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明發(fā)射峰位置熒光強(qiáng)度下降比率與胰蛋白酶濃度有很好的線性關(guān)系。特異性實(shí)驗(yàn)
熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明組裝體系對(duì)胰蛋白酶檢測(cè)有很好的特異性，其他蛋白不會(huì)影響檢測(cè)。實(shí)施方式6
I配制熒光探針的有機(jī)溶液
除所用熒光探針為BODIPY R6G，其他同實(shí)施方式5 ；
II測(cè)定表面活性劑的臨界膠束濃度CMC
除所用表面活性劑為十六烷基磺酸鈉，其他同實(shí)施方式5 ；
熒光光譜測(cè)定得到表面活性劑的臨界膠束濃度。III配制超分子組裝體溶液
除表面活性劑濃度為0. 5CMC，所用聚電解質(zhì)為Arg15，組裝體溶液的重量百分濃度為
0.07%，其他同實(shí)施方式I ;
IV配制檢測(cè)液同實(shí)施方式2;
V測(cè)定催化水解時(shí)間同實(shí)施方式2 ；
VI測(cè)定胰蛋白酶活性同實(shí)施方式I ;
熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明發(fā)射峰位置熒光強(qiáng)度下降比率與胰蛋白酶濃度有很好的線性關(guān)系。特異性實(shí)驗(yàn)
熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明組裝體系對(duì)胰蛋白酶檢測(cè)有很好的特異性，其他蛋白不會(huì)影響檢測(cè)。實(shí)施方式7
I配制熒光探針的有機(jī)溶液
除所用熒光探針為BODIPY TMR，其他同實(shí)施方式5 ；
II測(cè)定表面活性劑的臨界膠束濃度CMC
除熒光探針的終濃度為10_7 mol L—1，其他同實(shí)施方式2 熒光光譜測(cè)定得到表面活性劑的臨界膠束濃度。III配制超分子組裝體溶液
除表面活性劑濃度為0. 9CMC，所用聚電解質(zhì)為Arg11,組裝體溶液的重量百分濃度為
0.12 %，其他同實(shí)施方式I ;
IV配制檢測(cè)液同實(shí)施方式2;
V測(cè)定催化水解時(shí)間同實(shí)施方式2 ；
VI測(cè)定胰蛋白酶活性同實(shí)施方式I ;
熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明發(fā)射峰位置熒光強(qiáng)度下降比率與胰蛋白酶濃度有很好的線性關(guān)系。特異性實(shí)驗(yàn)
熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明組裝體系對(duì)胰蛋白酶檢測(cè)有很好的特異性，其他蛋白不會(huì)影響檢測(cè)。實(shí)施方式8 I配制熒光探針的有機(jī)溶液
除所用熒光探針為BODIPY 581/591，其他同實(shí)施方式5 ；
II測(cè)定表面活性劑的臨界膠束濃度CMC
除熒光探針的終濃度為10_7 mol L—1，其他同實(shí)施方式3 ；
熒光光譜測(cè)定得到表面活性劑的臨界膠束濃度。III配制超分子組裝體溶液
除表面活性劑濃度為CMC，所用聚電解質(zhì)為Arg16，其他同實(shí)施方式1，組裝體溶液的重量百分濃度為0. 15%，；
IV配制檢測(cè)液同實(shí)施方式2;
V測(cè)定催化水解時(shí)間同實(shí)施方式2;
VI測(cè)定胰蛋白酶活性同實(shí)施方式I ;
熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明發(fā)射峰位置熒光強(qiáng)度下降比率與胰蛋白酶濃度有很好的線性關(guān)系。特異性實(shí)驗(yàn)
熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明組裝體系對(duì)胰蛋白酶檢測(cè)有很好的特異性，其他蛋白不會(huì)影響檢測(cè)。實(shí)施方式9
I配制熒光探針的有機(jī)溶液
除所用熒光探針為BODIPY TR，其他同實(shí)施方式5 ；
II測(cè)定表面活性劑的臨界膠束濃度CMC
除熒光探針的終濃度為10_7 mol L—1，其他同實(shí)施方式4 ;
熒光光譜測(cè)定得到表面活性劑的臨界膠束濃度。III配制超分子組裝體溶液
除表面活性劑濃度為I. 2CMC，所用聚電解質(zhì)為Arg14，其他同實(shí)施方式1，組裝體溶液的重量百分濃度為0. 15%，；
IV配制檢測(cè)液同實(shí)施方式2;
V測(cè)定催化水解時(shí)間同實(shí)施方式2 ；
VI測(cè)定胰蛋白酶活性同實(shí)施方式I ;
熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明發(fā)射峰位置熒光強(qiáng)度下降比率與胰蛋白酶濃度有很好的線性關(guān)系。特異性實(shí)驗(yàn)
熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明組裝體系對(duì)胰蛋白酶檢測(cè)有很好的特異性，其他蛋白不會(huì)影響檢測(cè)。實(shí)施方式10I配制熒光探針的有機(jī)溶液
除所用熒光探針為BODIPY 630/650，其他同實(shí)施方式5 ；
II測(cè)定表面活性劑的臨界膠束濃度CMC :同實(shí)施方式5 ；
熒光光譜測(cè)定得到表面活性劑的臨界膠束濃度。III配制超分子組裝體溶液
除表面活性劑濃度為0. 4CMC，所用聚電解質(zhì)為Arg12，組裝體溶液的重量百分濃度為0. 05%，其他同實(shí)施方式I ;
IV配制檢測(cè)液同實(shí)施方式2;
V測(cè)定催化水解時(shí)間同實(shí)施方式2 ；
VI測(cè)定胰蛋白酶活性同實(shí)施方式I ;
熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明發(fā)射峰位置熒光強(qiáng)度下降比率與胰蛋白酶濃度有很好的線性關(guān)系。特異性實(shí)驗(yàn)
熒光光譜檢測(cè)結(jié)果表明組裝體系對(duì)胰蛋白酶檢測(cè)有很好的特異性，其他蛋白不會(huì)影響檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)胰蛋白酶的方法，其特征在于是一種基于超分子組裝體在酶催化水解作用下解組裝來(lái)實(shí)現(xiàn)胰蛋白酶檢測(cè)的方法，其具體步驟為 I配制熒光探針的有機(jī)溶液 以疏水染料為熒光探針，將疏水染料溶解到市售光譜純丙酮、氯仿或甲醇的有機(jī)溶劑中，配制濃度為10_3 10_6mol L—1熒光探針的有機(jī)溶液； II測(cè)定表面活性劑的臨界膠束濃度CMC: 將表面活性劑溶解于濃度為10 mM,pH 8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，配制濃度范圍為ImolL—卜KTmol L—1的梯度溶液，用微量進(jìn)樣器移取步驟I配制的熒光探針有機(jī)溶液，加入到梯度溶液中，使梯度溶液中探針的終濃度為10_8 10_6 mo I L—1，以4(Tl00kHz敞口超聲波處理10^60分鐘，靜置0. 5^12小時(shí)后進(jìn)行熒光光譜檢測(cè)，測(cè)定表面活性劑的臨界膠束濃度CMC ； III配制超分子組裝體溶液 根據(jù)步驟II得到的表面活性劑的臨界膠束濃度CMC，確定表面活性劑濃度為0. f I. 6CMC，將帶相反電荷的聚電解質(zhì)溶解于濃度為10 mM,pH 8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中制成聚電解質(zhì)溶液；按照聚電解質(zhì)與表面活性劑電荷比為1:1，在表面活性劑的溶液中加入等體積的聚電解質(zhì)溶液，表面活性劑與帶相反電荷的聚電解質(zhì)通過(guò)疏水與靜電作用形成超分子組裝體，混合均勻，靜置1(T15分鐘，得到超分子組裝體溶液，該超分子組裝體溶液的重量百分濃度為0.0廣0. 2%； IV配制檢測(cè)液 再次用微量進(jìn)樣器移取步驟I配制的熒光探針有機(jī)溶液，分別加入到III所得到的超分子組裝體溶液中，使該超分子組裝體溶液中探針的終濃度為10_8 IO-6Hi0I L—1，以4(Tl00kHz敞口超聲波處理10飛0分鐘，靜置0. 5^12小時(shí)后得到檢測(cè)液； V測(cè)定催化水解時(shí)間 步驟IV得到的檢測(cè)液在35 37°C下培養(yǎng)10 15分鐘，將胰蛋白酶溶解于濃度為10 mM,pH 8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，在檢測(cè)液中分別加入相同體積的胰蛋白酶緩沖溶液，以只加入緩沖溶液作為空白對(duì)照，胰蛋白酶終濃度范圍為0. OflOO mL—1，在35 37°C下進(jìn)行熒光光譜跟蹤檢測(cè)，以熒光發(fā)射峰強(qiáng)度下降的比率對(duì)時(shí)間作圖，得到不同濃度胰蛋白酶催化水解條件下熒光發(fā)射峰強(qiáng)度線性下降的時(shí)間范圍； VI測(cè)定胰蛋白酶活性 根據(jù)步驟V得到的時(shí)間范圍，取各濃度條件下共同線性時(shí)間范圍的最大值，以熒光發(fā)射峰強(qiáng)度下降的比率對(duì)加入胰蛋白酶濃度作圖，得到檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.按照權(quán)利要求I所述一種無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的疏水染料為市售純度高于98%的芘、尼羅紅、香豆素481、蘇丹紅或氟硼熒染料B0DIPY，氟硼熒染料BODIPY是指BODIPY FL,BODIPY R6G、B0DIPY TMR、B0DIPY 581/59UB0DIPY TR或BODIPY630/650。
3.按照權(quán)利要求I所述一種無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的表面活性劑為帶負(fù)電荷的烷基硫酸鹽或烷基磺酸鹽，烷基硫酸鹽為市售分析純十二烷基硫酸鈉、十四烷基硫酸鈉或十六烷基硫酸鈉；烷基磺酸鹽為市售分析純十二烷基磺酸鈉、十四烷基磺酸鈉或十六烷基磺酸鈉。
4.按照權(quán)利要求I所述一種無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的聚電解質(zhì)是可以被胰蛋白酶催化水解的多肽，多肽為市售純度高于99%的，長(zhǎng)度為1(T16的帶正電荷的精氨酸序列Arglt T Arg16。
全文摘要
一種無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)胰蛋白酶的方法，屬于材料、生物、和分析化學(xué)交叉學(xué)科的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種基于超分子組裝體在酶催化水解作用下解組裝來(lái)實(shí)現(xiàn)胰蛋白酶檢測(cè)的方法的技術(shù)方案。其特征在于是首先測(cè)定表面活性劑的臨界膠束濃度，然后在表面活性劑臨界膠束濃度以下，由表面活性劑與帶相反電荷的聚電解質(zhì)通過(guò)疏水與靜電作用形成超分子組裝體，疏水染料作為熒光探針包埋于組裝體內(nèi)腔，最后加入對(duì)聚電解質(zhì)有水解作用的酶，誘導(dǎo)組裝體解組裝，使包埋的疏水染料釋放，通過(guò)熒光強(qiáng)度的降低來(lái)實(shí)現(xiàn)酶活性的檢測(cè)。這種方法制備簡(jiǎn)單、成本低、可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)，在生物分子的診斷與檢測(cè)、生物傳感器等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N21/75GK102680442SQ20121011607
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月19日
發(fā)明者劉曉華, 朱晶心, 賈蘭 申請(qǐng)人:太原理工大學(xué)