專利名稱：用于檢測白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相對表達量的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生命科學和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種基因檢測試劑盒，采用探針實時熒光定量PCR技術(shù)，能夠?qū)θ祟惵粤＜毎籽?CML)、急性淋巴細胞白血病(ALL)以及少數(shù)的急性粒細胞白血病(AML)患者體內(nèi)BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因表達水平進行檢測，可有效的節(jié)約檢測時間，提聞檢測精度。
背景技術(shù)：
白血病是一類造血干細胞異常的克隆性惡性疾病。其克隆中的白血病細胞失去進一步分化成熟的能力而停滯在細胞發(fā)育的不同階段。在骨髓和其他造血組織中白血病細胞大量增生積聚并浸潤其他器官和組織，同時使正常造血受抑制，臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感·染及各器官浸潤癥狀。根據(jù)白血病細胞的成熟程度和自然病程，白血病可分為急性和慢性兩大類。急性白血病病情進展迅速，自然病程僅有數(shù)周至數(shù)月。一般可根據(jù)白血病細胞系列歸屬分為急性髓系白血病(AML)和急性淋巴細胞白血病(ALL)兩大類。而慢性白血病的發(fā)生是由于有功能的已分化成熟細胞過度增生，因此慢性白血病是一種由于信號傳導不良或細胞增殖失控所至的疾患，而非成熟障礙所至。慢性白血病常見有慢性粒細胞性白血病(CML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。由于白血病類型不同，治療方案及預(yù)后亦不盡相同，因此診斷成立后，應(yīng)進一步分型。關(guān)于人類白血病的病因與發(fā)病機理，至今仍未完全明了。已知病因有感染因素、電離輻射、化學物質(zhì)，遺傳因素及免疫功能異常等。目前認為白血病病因是以上各種因素相互作用的結(jié)果。人類abl基因位于9號染色體長臂，有l(wèi)b、Ia和2 11共12個外顯子。轉(zhuǎn)錄始自Ib或Ia,形成的兩種mRNA長度分別為7kb和6kb,合成的兩種蛋白質(zhì)分子量均約為145,前者定位于細胞膜，而后者主要在細胞核內(nèi)。bcr基因位于22號染色體長臂，有23個外顯子。蛋白產(chǎn)物分子量均為160。bcr蛋白第I 63個氨基酸是二聚體化結(jié)構(gòu)，參與bcr蛋白多聚體的形成。bcr蛋白參與細胞周期調(diào)節(jié)，但詳細過程還不十分明確。bcr基因斷裂點集中在三個區(qū)域主要(major bcr,M_bcr)、次要(minor bcr,m_bcr)和 u ( u -bcr)區(qū)域。abl基因斷裂位于第I或第2內(nèi)含子。因斷裂點不一，bcr/abl融合基因及其mRNA和蛋白產(chǎn)物呈多樣性。慢性粒細胞白血病的bcr基因斷裂點常位于M-bcr，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量為210kb。在實際應(yīng)用中，用于檢測BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因表達水平的方法主要為熒光原位雜交，盡管該法較為直觀，但是試驗過程過于繁瑣，需要的試劑種類繁多，費時費力，且試驗結(jié)果需要經(jīng)驗豐富的專家來判讀，結(jié)果判讀存在較大的主觀性，因而一定程度上限制了該法的應(yīng)用。實時熒光定量PCR法具有較高的靈敏度和特異性，而且能對PCR進行實時檢測，可準確反映患者體內(nèi)BCR/ABL(b3a2，b2a2)的表達情況，節(jié)約了大量的檢測時間，還避免了殘留污染的發(fā)生。常見的方法有SYBR GreenI染料法，雙探針雜交法以及Taqman技術(shù)等。其中SYBR GreenI由于是非飽和染料,特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法,必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。因此本研究采用實時熒光PCR技術(shù)結(jié)合Taqman探針法應(yīng)用于BCR/ABL(b3a2，b2a2)的基因檢測。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)中檢測BCR/ABL(b3a2，b2a2)的不足，本發(fā)明設(shè)計了檢測內(nèi)參/目的基因用引物、探針序列，用熒光定量PCR技術(shù)檢測白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相對表達量。通過調(diào)整兩個基因的引物探針濃度及比例，優(yōu)化PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，開發(fā)了一種用于檢測白血病BCR/ABL融合基因相對表達量的試劑盒。用于檢測白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液、TRIZoI、氯仿、無水乙醇、ReverTraAce qPCRRT Kit、檢測體系PCR反應(yīng)液、陽性對照品和陰性對照品，其特征在于檢測體系PCR反應(yīng)液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、檢測目的基因用上下游引物 b3a2-F, b2a2-F, b3a2/b2a2_R，探針 b3a2/b2a2_Probe，檢測內(nèi)參基因 Abl 用引物 abl_F，abl-R,探針 abl-Probe ;其中，b3a2-F GATTTAAGCAGAGTTCAb2a2-F TGTGTGAAACTCCAGACTGT
b3a2/b2a2-R TCCTTGGAGTTCCAACGAb3a2/b2a2-Probe FAM-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-TAMRAabl-F GCCGTGAAGACCTTGAAGGAGabl-R ATGATATAGAACGGGGGCTCabl-Probe :FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG_TAMRA。所述陽性對照品分別為含有b3a2、b2a2基因的溶液；所述陰性對照品為無b3a2和b2a2基因的溶液。其中的ReverTraAce qPCRRT Kit為T0Y0B0公司生產(chǎn)的qPCR用cDNA試劑盒產(chǎn)品。THUNDERBIRD qPCR MIX為T0Y0B0公司生產(chǎn)的定量PCR試劑，產(chǎn)品規(guī)格為QPS-101。使用本發(fā)明的試劑盒，將實時熒光PCR技術(shù)結(jié)合采用Tapman探針，可以對BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因的表達水平進行檢測，檢測精度高，而且操作簡單，可降低檢測成本，節(jié)約檢測時間。采用雙標準曲線法，通過構(gòu)建BCR/ABL(b3a2，b2a2)和內(nèi)參基因abl的標準定量曲線，精確定量樣本的內(nèi)參基因拷貝數(shù)和BCR/ABL(b3a2，b2a2)拷貝數(shù)，相比于以往的免疫組化方法和現(xiàn)今的ACT法，該試劑盒具有精度高，結(jié)果便于判讀等優(yōu)點。加之該試劑盒將反應(yīng)體系所需的引物、探針進行合理配比和優(yōu)化，使實驗條件達到最佳，從而省去了繁瑣的條件摸索環(huán)節(jié)，大大提升了實驗效率。該試劑盒經(jīng)測試特異性好，靈敏度高，操作簡便?？捎糜谳o助臨床上慢性粒細胞白血病(CML)、急性淋巴細胞白血病(ALL)以及少數(shù)的急性粒細胞白血病(AML)的早期診斷、早期預(yù)防及高危人群的篩選。


圖I :b2a2陽性結(jié)果示意圖。圖2 :b2a2陰性結(jié)果示意圖。
圖3 :b3a2陽性結(jié)果示意圖。圖4 :b3a2陰性結(jié)果示意圖。
具體實施例方式實施例I本發(fā)明的用于檢測白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液；TRIzol ；氯仿；無水乙醇；ReverTra Ace qPCR RT Kit(T0Y0B0 公司);檢測體系PCR 反應(yīng)液THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (2X)、b3a2/b2a2 上、下游引物各 0. 8uM、b3a2/b2a2-probe (探針)0. 4uM ；abl 上、下游引物各 0. 8uM、abl-probe (探針)0. 4uM;其中b3a2-F GATTTAAGCAGAGTTCA ；b2a2-F TGTGTGAAACTCCAGACTGT ；b3a2/b2a2-R TCCTTGGAGTTCCAACGA ；b3a2/b2a2-Probe FAM-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-TAMRA ；abl-F GCCG TGAAGACC TTGAAGGAG ；abl-R ATGATATAGAACGGGGGCTC ；abl-Probe FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA陽性對照品分別含BCR/ABL (b3a2，b2a2)基因組溶液；陰性對照品不含BCR/ABL(b3a2，b2a2)基因組溶液。實施例2本發(fā)明試劑盒的使用方法(I)抽提血液中的組織RNA :在潔凈的I. 5ml的離心管中加入Iml紅細胞裂解液，取抗凝血0. 5ml混勻。室溫靜置IOmin ；5000rpm離心5min,棄上清,收集底部的細胞；再次加入0. 5ml紅細胞裂解液，5000rpm離心5min，棄上清，收集底部的細胞；向細胞中加入ImlTRIzol，反復(fù)吹打直至沉淀完全溶解，室溫靜止5min ;加入0. 2ml氯仿，震蕩均勻；14000rpm4°C離心lOmin，吸取上清層轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；加入等體積的異丙醇，上下充分混勻，室溫靜置IOmin ；14000rpm 4°C離心IOmin,棄上清,加入75%乙醇Iml,輕輕上下顛倒洗漆管壁；14000rpm 4°C離心5min,棄乙醇；室溫干燥10_15min,加入20ulRNase-free水溶解沉淀。(2)參考T0Y0B0公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)為 cDNA。(3)試劑配置按檢測人份數(shù)配置檢測體系PCR反應(yīng)液各X ul，每人份23ul分裝X = 23ul反應(yīng)液X (8份內(nèi)參(標準曲線)+8份目的基因(標準曲線)+n份標本+1份陽性對照+1份陰性對照+1份空白對照)；(4)加樣加入檢測體系PCR反應(yīng)液中2ulcDNA ；陽性對照和陰性對照直接加2ul陽性對照品和陰性對照品；空白對照加2ul生理鹽水或不加任何物質(zhì)。(5)檢測檢測在實時熒光PCR儀上進行，可用儀器包括ABI7300，7500(美國Applied Biosystems 公司)等。反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 Imin ；95°C 15s, 58°C 35sec 40 個循環(huán)，突光信號于58°C 35sec時米集。(6)結(jié)果判斷將閾值線調(diào)整至背景信號及陰性擴增線以上，系統(tǒng)根據(jù)標準曲線和CT值自動計算出拷貝數(shù)。I)內(nèi)參陽性時，檢測結(jié)果才認為有效；2)陽性判斷標準，Ct < 36，為陽性；35 ^ Ct ^ 38，為疑似陽性，需要再次驗證；Ct > 38，為陰性。實施例3采用本發(fā)明核酸檢測試劑盒檢測臨床標本取送檢的慢性粒細胞白血病(CML)、急性淋巴細胞白血病(ALL)以及少數(shù)的急性粒細胞白血病(AML)患者抗凝血標本20例,按實施例2所述方法提取基因組RNA、配制試劑并檢測。每份標本加入檢測體系PCR反應(yīng)液中2ul。同時做陽性，陰性，空白對照，內(nèi)參基因/目的基因的標準曲線各一份。一臺96孔的熒光PCR儀可同時檢測38份樣品，每個樣本2次重復(fù)，一份陽性對照，一份陰性對照和一份空白對照。檢測時間僅為100分鐘。實驗結(jié)果與特檢實驗室的報告結(jié)果相比較，確定樣品檢測的準確率。部分陽性結(jié)果如下表權(quán)利要求
1.用于檢測白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、檢測體系PCR反應(yīng)液、陽性對照品和陰性對照品，其特征在于 檢測體系PCR反應(yīng)液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、檢測目的基因用上下游引物b3a2-F, b2a2-F, b3a2/ b2a2_R，探針 b3a2/b2a2_Probe，檢測內(nèi)參基因 Abl 用引物為 abl_F，abl-R,探針 abl-Probe ;其中，b3a2-F: GATTTAAGCAGAGTTCAb2a2-F: TGTGTGAAACTCCAGACTGTb3a2/b2a2-R: TCCTTGGAGTTCCAACGAb3a2/b2a2-Probe: FAM-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-TAMRAabI-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAGabl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTCabl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述陽性對照品分別為含有b3a2、b2a2基因的溶液；所述陰性對照品為無b3a2和b2a2基因的溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測白血病BCR/ABL融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKit、檢測體系PCR反應(yīng)液、陽性對照品和陰性對照品，其特征在于檢測體系PCR反應(yīng)液包括THUNDERBIRDqPCRMIX、檢測目的基因用上下游引物b3a2-F，b2a2-F，b3a2/b2a2-R，探針b3a2/b2a2-Probe，檢測內(nèi)參基因Abl用引物為abl-F，abl-R，探針abl-Probe。
文檔編號G01N21/64GK102758006SQ20121012666
公開日2012年10月31日 申請日期2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月25日
發(fā)明者周曉犢, 徐建成, 方國偉, 王淑一 申請人:武漢艾迪康醫(yī)學檢驗所有限公司