專利名稱：用于診斷胃病或胃癌的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外診斷的試劑盒，尤其涉及一種通過測定受試者胃蛋白酶原I及胃蛋白酶原II的濃度并與設(shè)定的cut-off值比較來診斷胃病或早期胃癌的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，本發(fā)明還涉及該試劑盒的制備方法及應(yīng)用，屬于胃病或胃癌的診斷或檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胃蛋白酶原(PG)是一種門冬氨酸蛋白酶前體，是分子質(zhì)量為42kDa的單鏈多肽，包括3個(gè)二巰鍵，等電點(diǎn)為3. 7。人類PG依其電泳遷移率可以分為7個(gè)組分，較快移向陽性的1-5組分的免疫原性近似，稱為胃蛋白酶原I (PG I)，主要由胃腺的主細(xì)胞和黏液頸細(xì)胞分泌；組分6-7被稱為胃蛋白酶原II (PG II)，除由胃體和胃底黏膜的泌酸腺的主細(xì)胞分泌外，泌酸腺的黏液頸細(xì)胞、賁門腺和胃竇的幽門腺的黏液細(xì)胞以及十二指腸上段的Brunner腺也能產(chǎn)生PG II。胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II的基因位點(diǎn)、免疫反應(yīng)性及生化特性上均存在一定差異。不同種的PG的產(chǎn)生似乎與以下幾種因素相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的數(shù)量、個(gè)體等位基因的差異以及翻譯后的修飾。胃蛋白酶原無活性，在胃內(nèi)鹽酸作用下，或在酸性條件下，通過自身催化，從N端水解42個(gè)氨基酸殘基后而轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘奈傅鞍酌浮Ｎ傅鞍酌笧閮?nèi)切酶，可分解大部分蛋白質(zhì)為標(biāo)和胨，產(chǎn)生的多肽或氨基酸較少。在PG轉(zhuǎn)變成胃蛋白酶的過程中，分子量由42kDa降為35kDa，等電點(diǎn)由3. 7降為-I，主細(xì)胞中的PG貯存在細(xì)胞頂部的分泌顆粒中，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，通過胞吐作用大部分釋入腺腔，只有1%進(jìn)入血液循環(huán)。在正常人血清中的PG I濃度是PGII的6倍。由于胃幾乎是PG的唯一來源，并且在分泌階段的分泌量會(huì)發(fā)生變化，因此，血清PG I和PGII不僅反映了胃黏膜腺體和細(xì)胞的數(shù)量，也間接反映了胃黏膜不同部位的分泌功能。胃酸分泌過多的淺表性胃炎和H pylori感染的胃炎，PG I和PG II的分泌會(huì)增加；而在慢性嚴(yán)重萎縮性胃炎，當(dāng)主細(xì)胞減少時(shí)PG I含量下降；當(dāng)萎縮性胃炎伴有腸化、胃竇腺假幽門腺化生，PG II含量會(huì)隨之增高。當(dāng)腸上皮化生(intestinal metaplasia, IM)、不典型增生時(shí)，PG I分泌會(huì)減少，PG I/PG II也會(huì)發(fā)生變化，因此，血清PG可作為監(jiān)測胃粘膜變化的一個(gè)可靠的標(biāo)志物。高濃度的PG I還作為十二指腸潰瘍及其并發(fā)癥的危險(xiǎn)性的一個(gè)亞臨床指征，也可以作為觀察H pylori感染根除治療療效的一個(gè)指標(biāo)。胃粘膜萎縮和腸上皮化生(特別是不完全型結(jié)腸化生)及異型增生是胃癌的癌前病變，對CAG患者尤其是伴有腸化和異型增生者進(jìn)行病情監(jiān)測，對于早期胃癌的發(fā)現(xiàn)意義重大。日本和中國胃癌患者的總數(shù)幾乎占到全球胃癌患者總數(shù)的一半。胃癌的篩查工作始于60年代胃癌高發(fā)的日本，當(dāng)時(shí)采用胃腸雙重對比造影-胃鏡-病理檢查階梯式的篩查方法，人力物力花費(fèi)較大。自1991年開始，日本先后以血清PGI < 50ng/ml并PGI/GPII比值
<3.0和PGI < 70ng/ml并PGI/PGII比值< 3. 0作為胃癌篩查的初篩指標(biāo)，歷經(jīng)5年共檢測血清樣本25415例，檢出胃癌43例(0. 17% )，其中早癌32例(74%)。另以血清GPI、<70ng/ml并GPI/GPII比值< 3. O為胃癌篩檢的Cut-off值，其靈敏度84. 6 %，特異度73. 5%，陽性預(yù)測值0. 81%，陰性預(yù)測值99. 9%。繼后十年中已有13萬余人接受了血清PG法胃癌篩查，檢出胃癌患者123人，檢出率0. 13%。中國專家組于1997-1999年在中國胃癌高發(fā)區(qū)采用兩輪篩選法進(jìn)行胃癌篩查，以胃鏡病理組織學(xué)診斷為標(biāo)準(zhǔn)比較評價(jià)了兩種初篩方法鋇劑-X線雙對比照影和血清胃蛋白酶原I/II含量檢測。結(jié)果顯示，在接受血清胃蛋白酶原I/II(PGI/PGII)檢測的1750人中，分別以 PGI ( 50+PGI/PGII 彡 3 和 PGI ( 70+PGI/GPII 比值彡 3 為初篩 Cut-off 值，后者篩出應(yīng)胃鏡精查者近400人，符合胃癌診斷者17例，檢測敏感度約為53%。特異度達(dá)到78%，第二輪胃鏡精查在這組人群中檢出胃癌32例。據(jù)此，血清胃蛋白酶原I/II(PGI/PGII)含量檢測優(yōu)于雙對比照影，血清PGI含量和PGI/GPII值相結(jié)合更適合于作為中國人胃癌初篩和胃部重大疾病普查標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種敏感度高、特異性強(qiáng)和準(zhǔn)確性好的診斷胃病或胃癌，特別是早期胃癌的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備上述膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒的方法；本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述試劑盒在診斷胃病或胃癌中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的一種用于診斷胃病或胃癌的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，其特征在于包括稀釋液、含有胃蛋白酶原I的抗體或胃蛋白酶原II的抗體的膠乳試劑及空白液；其中所述的膠乳試劑中含有已耦聯(lián)了胃蛋白酶原I的抗體或胃蛋白酶原II的抗體的不同粒徑的聚苯乙烯納米微球。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的稀釋液為含有反應(yīng)增強(qiáng)劑的緩沖液，所述的緩沖液為Tris/HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、HE PES緩沖液、甘氨酸緩沖液、巴比妥緩沖液、MOPSO緩沖液、DIPSO緩沖液或HEPPS緩沖液中的任一種，更優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液；所述的反應(yīng)增強(qiáng)劑為PEG-300、PEG2000或PEG6000中的任一種或幾種，優(yōu)選為PEG6000 ;最優(yōu)選的所述的稀釋液中還含有2mol/L的氯化鈉。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的膠乳試劑中含有已耦聯(lián)了胃蛋白酶原I的抗體或胃蛋白酶原II的抗體的粒徑為60-90nm和粒徑為160_200nm的聚苯乙烯納米微球。所述的膠乳試劑可以按照以下方法制備得到(I)膠乳前處理取Iml未標(biāo)記的聚苯乙烯納米微球加入IOml 0. 02M pH7. 4磷酸緩沖液中，離心機(jī)IOOOOrpm離心20min,去掉上清液、再用IOml 0. 02M pH7. 4磷酸緩沖液重懸顆粒，離心機(jī)IOOOOrpm離心20min，去掉上清并用5ml 0. 02M pH7. 4磷酸緩沖液重懸、4°C保存待用；(2)膠乳顆粒標(biāo)記將步驟⑴處理后膠乳用0. 02M pH6. IMES緩沖液將膠乳顆粒稀釋成10mg/ml濃度，然后加入Img EDC,混勻活化15分鐘，離心8000rpm棄去上清，并用0. 02MPH7. 4磷酸緩沖液重懸，加入Img胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II的抗體于10mg/ml2ml膠乳液體，室溫混勻2-4小時(shí)，離心機(jī)SOOOrpm離心15分鐘，將上清分離到另外的容器中備用，顆粒使用封閉液重懸，并室溫混勻I小時(shí)，離心機(jī)8000rpm離心15min，沉淀復(fù)溶于分散液，將標(biāo)記完成的膠乳顆粒分裝成Iml/支，4°C保存；(3)使用上述步驟分別對粒徑60-90nm和160_200nm的膠乳進(jìn)行分別標(biāo)記，標(biāo)記結(jié)束后將所述60-90nm膠乳和所述160_200nm膠乳進(jìn)行混合，按質(zhì)量體積百分比計(jì)，使60-90nm 膠乳的濃度為 0. 673-0. 720% (w/v)，使 160_200nm 膠乳的濃度為 0. 147-0. 323%(w/v)，混合后進(jìn)行保存，優(yōu)選的使用上述流程分別對粒徑60-80nm和160_180nm的膠乳進(jìn)行分別標(biāo)記，標(biāo)記結(jié)束后將所述60-80nm膠乳和所述160_180nm膠乳進(jìn)行混合，按質(zhì)量體積百分比計(jì)，使60-80nm膠乳濃度為0. 673-0. 708% (w/v)，使160_180nm膠乳濃度為0. 147-0. 235% (w/v)，混合后進(jìn)行保存；所述的封閉液為含有5g/L BSA的0. 02M PH7. 4的磷酸緩沖液；所述的分散液由BSA，吐溫-20、PVP-K30以及生物防腐劑通過0. 02M PH7. 4的磷酸緩沖液配制而成，其中BSA濃度為lg/L，吐溫-20濃度為0. 05% (v/v)，PVP-K30濃度為2g/L，生物防腐劑濃度為0.05% (v/v)，在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中所述的生物防腐劑為PC-300,購自sigma公司。為了達(dá)到更好的檢測效果，所述的胃蛋白原I或蛋白酶原II是從人胃粘膜組織中提取的天然蛋白；其提取方法可以是離子交換及凝膠過濾層析法等方法。作為參考，一種從人胃粘膜組織中提取胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II的方法，包括(I)收集外科手術(shù)切除的胃組織，用磷酸鹽緩沖液漂洗，分離胃粘膜，吸干，稱重，加入磷酸鹽緩沖液，搗碎勻漿，離心，收集上清，沉淀磷酸鹽緩沖液重懸，再次離心，合并上清液，得到胃蛋白酶原粗提液；(2)將胃蛋白酶原粗提液加入已經(jīng)平衡的DEAE-52層析柱中，用PBS緩沖液洗脫層析柱至洗脫液在280nm處的吸光值為0，繼續(xù)用PBS緩沖液洗脫層析柱，合并洗脫峰，得到含有活性的胃蛋白酶原；(3)取活性蛋白酶原峰,上樣于凝膠層析柱中，用50mmol含0. 05mol/LNa2S04的PBS洗脫，流速3. Oml/min，壓力為8Kpa，洗脫曲線為顯示4個(gè)蛋白洗脫峰，第三個(gè)蛋白峰即為胃蛋白酶原I，第四個(gè)蛋白峰為胃蛋白酶抗原I及胃蛋白酶原II的混合物；(4)采用Q-2陰離子交換層析柱分離胃蛋白酶原I和胃蛋白酶抗原II的混合物，凝膠層析后的第四個(gè)洗脫峰先用0. 05mol/L Tris-HCL,pH7. O透折后上樣陰離子層析柱，用濃度為0-0. 5mol/L NaCL梯度洗脫，流速為lmL/min ;出現(xiàn)三個(gè)蛋白峰，其中第I個(gè)，2個(gè)峰為胃蛋白酶原I，第三峰為胃蛋白酶原II。經(jīng)過上述方法純化獲得的胃蛋白酶原I的純度> 98%，比活性為13. 6U/mg ;胃蛋白酶原II的純度彡96. 8%，比活性為19. 7U/mg。將所制備的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II免疫小鼠制備融合細(xì)胞就可進(jìn)一步得到分泌抗胃蛋白酶抗原I或胃蛋白酶抗原II的單克隆抗體，優(yōu)選的，所述的單克隆抗體為針對胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II表面的不同抗原決定簇的單克隆抗體的混合物。
作為參考，所述胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II單克隆抗體的制備方法，包括(I)融合細(xì)胞的制備用50-100 ii g人胃蛋白酶原I或人胃蛋白酶原II與福氏完全佐劑等體積混合皮下注射免疫8周齡的雌性BALB/C小鼠，間隔2-3周后，用同樣劑量的抗原加強(qiáng)免疫2-3次，末次免疫后后3-4天取尾靜脈血檢測，當(dāng)效價(jià)達(dá)到4000以上時(shí)，即準(zhǔn)備融合；將經(jīng)免疫的小鼠處死后，局部消毒剖腹，無菌條件下取脾，制備成脾細(xì)胞懸液；融合前2-3天，將每瓶Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞傳至4瓶細(xì)胞，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于融合；將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞分別計(jì)數(shù)后，按7 I的比例加入50ml離心管中混合均勻，離心10分鐘，倒盡上清液，使兩種細(xì)胞混勻成糊狀，加入37°C預(yù)溫的50% PEG 4000，邊滴加邊攪拌完成細(xì)胞融合。(2)融合后的細(xì)胞用含20%小牛血清的HAT培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液，分劃于192孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行選擇培養(yǎng)；在選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)4天后，其它細(xì)胞逐漸消失，只有融合的雜交瘤成簇生長，形成小的細(xì)胞集落，8天后，停止使用HAT培養(yǎng)液，改用HT培養(yǎng)液，一周后換用含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；待雜交瘤細(xì)胞長滿培養(yǎng)孔底部的1/3時(shí)，這時(shí)吸取培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選。用間接酶聯(lián)吸附法(ELISA)進(jìn)行特異性抗體檢測，有分泌抗ALB抗原抗體的雜交瘤細(xì)胞；(3)以人胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II為包被抗原，用間接ELISA方法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，以免疫小鼠的血清為陽性對照，以Sp2/0細(xì)胞培養(yǎng)的上清液為空白對照，以細(xì)胞培養(yǎng)板中未長出克隆的培養(yǎng)上清為陰性對照；選取對胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II抗原陽性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞集落，以有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，選擇抗體效價(jià)高，呈單個(gè)克隆生長，形態(tài)良好的細(xì)胞孔，繼續(xù)按有限稀釋法進(jìn)行2次克隆和擴(kuò)大培養(yǎng)，得到分泌特異抗體的雜交瘤細(xì)胞株；(4)在同系的6周齡BALB/c腹腔注射液體石蠟，約第8天將克隆后分泌特異單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞注入腹腔(1-2 X IO6細(xì)胞/鼠)，待小鼠腹部開始增大后，收集腹水；一只小鼠收集腹水2-3次后，殺死小鼠一次性取腹水，腹水取出后，無菌過濾后，小包裝分裝后于-20°C凍存，亦可取部分進(jìn)一步進(jìn)行純化；(5)離心除去腹水中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，加入等體積的飽和硫酸銨到上清液中，將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6小時(shí)，使蛋白質(zhì)充分沉淀，將沉淀物溶于少量的PBS中，用10mmol/LPBS(pH7. 4)在4°C透析24小時(shí)。然后通過DEAE-S印hadexA52層析柱，收集并合并洗脫液中含蛋白的部分，即得到純化的抗胃蛋白酶原I或抗胃蛋白酶原II單克隆抗體。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II單克隆抗體除了可通過雜交瘤細(xì)胞的方式產(chǎn)生外，還可直接通過商業(yè)途徑購買得到，在本發(fā)明另一個(gè)具體實(shí)施例中所述的胃蛋白酶原I的單克隆抗體為針對胃蛋白酶原I表面的不同抗原決定簇的單克隆抗體PGI-8003和PGI-8015(Medix，批號為0021636)的混合物，胃蛋白酶原II的單克隆抗體為針對胃蛋白酶原II表面的不同抗原決定簇的單克隆抗體PGII-8103和PGII-8101(Medix，批號為0023880)的混合物。胃蛋白酶原I單克隆抗體及胃蛋白酶原II單克隆抗體還可購買自Applichem公司或Abcam公司，胃蛋白酶原I抗體批號分別為M5537及A1476 ;胃蛋白酶原II抗體批號分別為M5538及A1483，同樣可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。本發(fā)明的試劑盒中還可含有標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品。優(yōu)選的，所述的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液為Tris/HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、HE PES緩沖液、甘 氨酸緩沖液、巴比妥緩沖液、MOPSO緩沖液、DIPSO緩沖液或HEPPS緩沖液中的任一種，優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選的，所述校準(zhǔn)品和質(zhì)控品中含有從人胃粘膜分離的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II。以上任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備診斷胃病或胃癌。特別是早期胃癌試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明采用了從人胃粘膜分離的胃蛋白酶原I及胃蛋白酶原II作為免疫小鼠制備單克隆抗體的免疫原，所用到標(biāo)準(zhǔn)品也是采用從人胃粘膜分離的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II，彌補(bǔ)了采用動(dòng)物胃蛋白酶原與人的胃蛋白酶原結(jié)構(gòu)不同帶來的缺陷，提高了產(chǎn)品診斷的敏感度、特異性和準(zhǔn)確性。本試劑盒采用免疫比濁法，以乳膠增強(qiáng)免疫比濁法為測定原理。樣品中的PG I或PGII與標(biāo)記了抗PG I抗體或抗PGII抗體的乳膠顆粒發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物，從而引起吸光度的變化。此吸光度的變化與樣品中的PG I或PGII濃度呈正比。用已知濃度的PG I或PGII標(biāo)準(zhǔn)品制作工作曲線，從該曲線上即可計(jì)算出樣品中的PG I或PGII含量。
本發(fā)明通過測定分析物的胃蛋白酶原I (PGI)、胃蛋白酶原II(PGII)來評估受試者胃粘膜狀況，特別適用于診斷粘膜胃變化，例如萎縮性胃炎，并可診斷早期胃癌，所述方法包括從所述受試者的樣品中測量胃蛋白酶原I和胃蛋白酶II的濃度值；將分析物濃度測量值與該分析物的預(yù)定臨界值進(jìn)行比較，得到受試者特定的比較結(jié)果的組合。分析物測量值是否大于、等于或小于各自的臨界值，及兩個(gè)分析物的比值來評估受試者胃粘膜狀況，進(jìn)而得出受試者患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生的該信息是關(guān)于由所得的比較結(jié)果作出診斷意見或?qū)χ委熁蜻M(jìn)一步觀察和/或檢測提出建議，并提示受試者患早期胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。


圖I為采用PG I標(biāo)準(zhǔn)品濃度做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測的流程示意圖。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)驗(yàn)并結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明實(shí)施例所涉及主要材料及試劑的購買來源Q-2陰離子交換層析柱、DEAE-Sephadex A52 (DEAE-52)層析柱購買自美國GE公司；8周齡的雌性BALB/C小鼠購買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；弗氏完全佐劑，生物防腐劑PC-300、2_(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)購買自SIGMA ；10% (w/w)聚苯乙烯納米微球溶液購買自美國Bangs ;胃蛋白酶原I抗體PGI-8003和PGI-8015購買自Medix批號0021636，胃蛋白酶原II抗體PGII-8103和PGII-8101購買自Medix批號0023880PVP-K30 (PoIyvinylpyrroI idone)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀PFG-6000、EDC (I- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、吐溫_20等購自國藥集團(tuán)；牛血清白蛋白(BSA)購自元亨金馬。實(shí)施例I胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原11的提取純化(I)收集外科手術(shù)切除的胃組織，用磷酸鹽緩沖液漂洗，分離胃粘膜，吸干，稱重，加入磷酸鹽緩沖液，搗碎勻漿，離心，收集上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，再次離心，合并上清液，得到胃蛋白酶原粗提液；(2)將胃蛋白酶原粗提液加入已經(jīng)平衡的DEAE-52層析柱中，用PBS緩沖液洗脫層析柱至在280nm處，吸光值為0，繼續(xù)用PBS緩沖液洗脫層析柱，合并洗脫峰，得到含有活性 的胃蛋白酶原；(3)取活性蛋白酶原峰,上樣于凝膠層析柱中，用50mmol含0. 05mol/LNa2S04的PBS洗脫，流速3. Oml/min，壓力為8Kpa，洗脫曲線為顯示4個(gè)蛋白洗脫峰，第三個(gè)蛋白峰即為胃蛋白酶原I，第四個(gè)蛋白峰為胃蛋白酶抗原I及胃蛋白酶原II的混合物；(4)采用Q-2陰離子交換層析柱分離胃蛋白酶原I和胃蛋白酶抗原II的混合物，凝膠層析后的第四個(gè)洗脫峰先用0. 05mol/L Tris-HCL,pH7. O透析后上樣陰離子層析柱，用濃度為0. 4mol/L NaCL梯度洗脫，流速為lmL/min ;出現(xiàn)三個(gè)蛋白峰，其中第I個(gè)，2個(gè)峰為胃蛋白酶原I，第三峰為胃蛋白酶原II。經(jīng)過上述方法純化獲得的胃蛋白酶原I的純度> 98%，比活性為13. 6U/mg ;胃蛋白酶原II的純度彡96. 8%，比活性為19. 7U/mg。實(shí)施例2抗胃蛋白酶原I或抗胃蛋白酶原II單克隆抗體的制備(I)融合細(xì)胞的制備用實(shí)施例I制備得到的50-100 ii g人胃蛋白酶原I或人胃蛋白酶原II與弗氏完全佐劑等體積混合皮下注射免疫8周齡的雌性BALB/C小鼠，間隔2-3周后，用同樣劑量的抗原加強(qiáng)免疫2-3次，末次免疫后后3-4天取尾靜脈血檢測，當(dāng)效價(jià)達(dá)到4000以上時(shí)，即準(zhǔn)備融合；將經(jīng)免疫的小鼠處死后，局部消毒剖腹，無菌條件下取脾，制備成脾細(xì)胞懸液；融合前2-3天，將每瓶Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞傳至4瓶細(xì)胞，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于融合；將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞分別計(jì)數(shù)后，按7 I的比例加入50ml離心管中混合均勻，離心10分鐘，倒盡上清液，使兩種細(xì)胞混勻成糊狀，加入37°C預(yù)溫的50% PEG4000，邊滴加邊攪拌完成細(xì)胞融合。(2)融合后的細(xì)胞用含20%小牛血清的HAT培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液，分劃于192孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行選擇培養(yǎng)；在選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)4天后，其它細(xì)胞逐漸消失，只有融合的雜交瘤成簇生長，形成小的細(xì)胞集落，8天后，停止使用HAT培養(yǎng)液，改用HT培養(yǎng)液，一周后換用含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；待雜交瘤細(xì)胞長滿培養(yǎng)孔底部的1/3時(shí)，這時(shí)吸取培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選。用間接酶聯(lián)吸附法(ELISA)進(jìn)行特異性抗體檢測，有分泌抗ALB抗原抗體的雜交瘤細(xì)胞；(3)以人胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II為包被抗原，用間接ELISA方法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，以免疫小鼠的血清為陽性對照，以Sp2/0細(xì)胞培養(yǎng)的上清液為空白對照，以細(xì)胞培養(yǎng)板中未長出克隆的培養(yǎng)上清為陰性對照；選取對胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II抗原陽性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞集落，以有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，選擇抗體效價(jià)高，呈單個(gè)克隆生長，形態(tài)良好的細(xì)胞孔，繼續(xù)按有限稀釋法進(jìn)行2次克隆和擴(kuò)大培養(yǎng)，得到分泌特異抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
(4)在同系的6周齡BALB/c腹腔注射液體石蠟，約第8天將克隆后分泌特異單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞注入腹腔(1-2 X IO6細(xì)胞/鼠)，待小鼠腹部開始增大后，收集腹水；一只小鼠收集腹水2-3次后，殺死小鼠一次性取腹水，腹水取出后，無菌過濾后，小包裝分裝后于-20°C凍存，亦可取部分進(jìn)一步進(jìn)行純化；(5)離心除去腹水中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，加入等體積的飽和硫酸銨到上清液中，將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6小時(shí)，使蛋白質(zhì)充分沉淀，將沉淀物溶于少量的PBS中，用10mmol/LPBS(pH7. 4)在4°C透析24小時(shí)。然后通過DEAE-S印hadexA52層析柱，收集并合并洗脫液中含蛋白的部分，即得到純化的抗胃蛋白酶原I或抗胃蛋白酶原II單克隆抗體。實(shí)施例3試劑盒的組裝(以PG II為例)I緩沖液配置I. I稀釋液(Rl)的配制將下表中試劑稱量好放入潔凈容器中，加純化水混勻，測定pH值為7. 4，定容IOOOml。
權(quán)利要求
1.一種用于診斷胃病或胃癌的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，其特征在于包括稀釋液、含有胃蛋白酶原I的抗體或胃蛋白酶原II的抗體的膠乳試劑及空白液； 其中所述的膠乳試劑中含有已耦聯(lián)了胃蛋白酶原I的抗體或胃蛋白酶原II的抗體的不同粒徑的聚苯乙烯納米微球。
2.按照權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的稀釋液為含有反應(yīng)增強(qiáng)劑的緩沖液，所述的緩沖液為Tris/HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、HE PES緩沖液、甘氨酸緩沖液、巴比妥緩沖液、MOPSO緩沖液、DIPSO緩沖液或HEPPS緩沖液中的任一種，優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液；所述的反應(yīng)增強(qiáng)劑為PEG-300、PEG2000或PEG6000中的任一種或幾種，優(yōu)選為PEG6000 ;更優(yōu)選的所述的稀釋液中還含有2mol/L的氯化鈉。
3.按照權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的膠乳試劑中含有已耦聯(lián)了胃蛋白酶原I的抗體或胃蛋白酶原II的抗體的粒徑為60-90nm和粒徑為160_200nm的聚苯乙烯納米微球。
4.按照權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的膠乳試劑按照以下方法制備得到 (1)膠乳前處理 取Iml未標(biāo)記的聚苯乙烯納米微球加入IOml 0. 02M pH7. 4磷酸緩沖液中，離心機(jī)IOOOOrpm離心20min,去掉上清液、再用IOml 0. 02M pH7. 4磷酸緩沖液重懸顆粒，離心機(jī)IOOOOrpm離心20min，去掉上清并用5ml 0. 02M pH7. 4磷酸緩沖液重懸、4°C保存待用； (2)膠乳顆粒標(biāo)記 將步驟(I)處理后膠乳用0. 02M pH6. IMES緩沖液將膠乳顆粒稀釋成10mg/ml濃度，然后加入Img EDC,混勻活化15分鐘，離心8000rpm棄去上清，并用0. 02MPH7. 4磷酸緩沖液重懸，加入Img胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II的抗體于10mg/ml2ml膠乳液體中，室溫混勻2-4小時(shí)，離心機(jī)8000rpm離心15分鐘，將上清分離到另外的容器中備用，顆粒使用封閉液重懸，并室溫混勻I小時(shí)，離心機(jī)8000rpm離心15min，沉淀復(fù)溶于分散液，將標(biāo)記完成的膠乳顆粒分裝成Iml/支，4°C保存； (3)使用上述步驟分別對粒徑60-90nm和160_200nm的膠乳進(jìn)行分別標(biāo)記，標(biāo)記結(jié)束后將所述60-90nm膠乳和所述160-200nm膠乳進(jìn)行混合,按質(zhì)量體積百分比計(jì)，使60_90nm膠乳的濃度為0. 673-0. 720%，使160-200nm膠乳的濃度為0. 147-0. 323%，混合后進(jìn)行保存，優(yōu)選的使用上述流程分別對粒徑60-80nm和160_180nm的膠乳進(jìn)行分別標(biāo)記，標(biāo)記結(jié)束后將所述60-80nm膠乳和所述160_180nm膠乳進(jìn)行混合,按質(zhì)量體積百分比計(jì)，使60_80nm膠乳濃度為0. 673-0. 708%，使160-180nm膠乳濃度為0. 147-0. 235%，混合后進(jìn)行保存； 所述的封閉液為含有5g/L BSA的0. 02M PH7. 4的磷酸緩沖液； 所述的分散液由BSA，吐溫-20、PVP-K30以及生物防腐劑通過0. 02M PH7. 4的磷酸緩沖液配制而成，其中BSA濃度為lg/L，吐溫-20濃度為0. 05% (v/v)，PVP-K30濃度為2g/L,生物防腐劑濃度為0. 05% (v/v)。
5.按照權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II是從人胃粘膜組織中提取得到的天然蛋白，優(yōu)選的，所述的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II是按照以下方法從人胃粘膜組織中提取得到 (I)收集外科手術(shù)切除的胃組織，用磷酸鹽緩沖液漂洗，分離胃粘膜，吸干，稱重，加入磷酸鹽緩沖液，搗碎勻漿，離心，收集上清，沉淀磷酸鹽緩沖液重懸，再次離心，合并上清液，得到胃蛋白酶原粗提液； (2)將胃蛋白酶原粗提液加入已經(jīng)平衡的DEAE-52層析柱中，用PBS緩沖液洗脫層析柱至洗脫液在280nm處的吸光值為O，繼續(xù)用PBS緩沖液洗脫層析柱，合并洗脫峰，得到含有活性的胃蛋白酶原；(3)取活性蛋白酶原峰，上樣于凝膠層析柱中，用50mmol含0.05mol/LNa2S04的PBS洗脫，流速3. Oml/min，壓力為8Kpa，洗脫曲線為顯示4個(gè)蛋白洗脫峰，第三個(gè)蛋白峰即為胃蛋白酶原I，第四個(gè)蛋白峰為胃蛋白酶抗原I及胃蛋白酶原II 的混合物； (4)采用Q-2陰離子交換層析柱分離胃蛋白酶原I和胃蛋白酶抗原II的混合物，凝膠層析后的第四個(gè)洗脫峰先用0. 05mol/L Tris-HCL,pH7. O透折后上樣陰離子層析柱，用濃度為0-0. 5mol/L NaCL梯度洗脫，流速為lmL/min ;出現(xiàn)三個(gè)蛋白峰，其中第I個(gè)，2個(gè)峰為胃蛋白酶原I，第三峰為胃蛋白酶原II。
6.按照權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的胃蛋白酶原I的抗體或胃蛋白酶原II的抗體為單克隆抗體，優(yōu)選的，所述的單克隆抗體為針對胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II表面的不同抗原決定簇的單克隆抗體的混合物。
7.按照權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于還含有標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品。
8.按照權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液為Tris/HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、PES緩沖液、甘氨酸緩沖液、巴比妥緩沖液、MOPSO緩沖液、DIPSO緩沖液或HEPPS緩沖液中的任一種，優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液。
9.按照權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述校準(zhǔn)品和質(zhì)控品中含有從人胃粘膜分離的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備診斷胃病或胃癌試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種診斷胃病或胃癌的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。該試劑盒的組成包括稀釋液、抗胃蛋白酶原I的抗體或抗胃蛋白酶原II的抗體的膠乳試劑和空白液，還可包括校準(zhǔn)品和質(zhì)控品。其中所述的膠乳試劑中含有已耦聯(lián)了胃蛋白酶原I的抗體或胃蛋白酶原II的抗體的不同粒徑的聚苯乙烯納米微球。單一使用粒徑低于100nm的膠乳則出現(xiàn)檢測靈敏度達(dá)不到要求，單一使用粒徑為200nm左右的膠乳則線性范圍較小，故使用單一粒徑膠乳無法同時(shí)兼顧檢測靈敏度和線性范圍，使用本發(fā)明的復(fù)合膠乳進(jìn)行標(biāo)記后，可以提高檢測靈敏度，又可拓寬檢測線性范圍，對胃病或胃癌的檢測來說具有檢測快速、敏感度高、特異性強(qiáng)和準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N33/573GK102645537SQ201210127509
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者金鑫 申請人:北京美康生物技術(shù)研究中心