專利名稱：一種實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記的微納流控芯片及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)領(lǐng)域，涉及一種實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記的微納流控芯片及方法，特別涉及一種不需要標(biāo)記產(chǎn)物的額外純化過程、結(jié)構(gòu)簡單的微納流控芯片及其方法。
背景技術(shù)：
熒光檢測(cè)靈敏度極高，可以實(shí)現(xiàn)單分子水平分析，因而在生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)，以及在探索生物分子、細(xì)胞和生物體的內(nèi)在功能等方面都有著廣泛應(yīng)用。但是，自然界中只有少部分生物分子具有熒光性質(zhì)，而大多數(shù)生物分子不能直接用熒光分析進(jìn)行檢測(cè)。因此，只有采用熒光染料標(biāo)記生物分子(抗體、蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽)后，才可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的超高靈敏分析檢測(cè)。傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記方法均在宏觀體系進(jìn)行，通常需要加入過量的熒光染料來獲得較高的標(biāo)記效率，為得到高純度的熒光標(biāo)記物，在標(biāo)記反應(yīng)后需要色譜分離純化技術(shù)以除去未反應(yīng)的染料分子以減小或消除熒光背景，步驟繁瑣，時(shí)間長，且所需樣品量多，不適合于珍貴生物樣品(如激素、配體、抗體等)的熒光標(biāo)記。因此，發(fā)展一種微型化、高效率的熒光標(biāo)記方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)納克和皮克級(jí)生物試劑的標(biāo)記，對(duì)生物分析學(xué)科的發(fā)展具有重要意義。微流控技術(shù)作為一門新興學(xué)科，由于其獨(dú)特的尺寸效應(yīng)，具有顯著的微納米限域空間結(jié)構(gòu)，以及比表面積大、樣品消耗量少、易散熱、易于實(shí)現(xiàn)高通量合成與篩選等優(yōu)點(diǎn)，在各種蛋白質(zhì)標(biāo)記中被廣泛使用。如Lee等[I. H. Lee, D. Pinto, E. A. Arriaga, Z. U.Zhang, N. J. Dovichi, Anal. Chem. , 1998, 70, 4546-4548.]構(gòu)建的以電泳為基礎(chǔ)的微全分析系統(tǒng)，可用于蛋白質(zhì)在線熒光標(biāo)記，但是還需要隨后的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離技術(shù)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。Wheeler 等[71· D. Wheeler, D. X. Zeng, A. V. Desai, B. Onal,D. B. Reichert, P. J. A. Kenis, Lab Chip, 2010, 10, 3387-33961 在微流控芯片上用放射性金屬元素對(duì)生物分子進(jìn)行標(biāo)記，與相同條件下宏觀體系本體溶液中的標(biāo)記反應(yīng)相t匕，微觀尺度下流體的高混合效率和快的熱傳遞效應(yīng)使微反應(yīng)器中的標(biāo)記反應(yīng)速率極快，標(biāo)記產(chǎn)率更高。Abdelgawad 等[麗 Abdelgawad, M. V. L. Watson, A. R. Wheeler, LabChip, 2009，9, 1046-105n將數(shù)字微液滴集成在微流控芯片上，用于標(biāo)記物質(zhì)和產(chǎn)物分離。盡管這些方法都是在微流控系統(tǒng)中進(jìn)行，但都需要標(biāo)記產(chǎn)物的額外純化過程或者設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的芯片來實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的純化。因此，需要設(shè)計(jì)一種不需要標(biāo)記產(chǎn)物的額外純化過程、結(jié)構(gòu)簡單的裝置，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行快速熒光標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記的微納流控芯片，解決目前對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記都需要標(biāo)記產(chǎn)物的額外純化過程、且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的問題。
本發(fā)明的另一目的是提供一種利用微納流控芯片實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記的方法。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一、一種實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記的微納流控芯片，包括基片和蓋片，基片和蓋片可逆鍵合；所述的蓋片上有微通道、熒光探針儲(chǔ)蓄池、蛋白質(zhì)儲(chǔ)蓄池和緩沖液儲(chǔ)蓄池，熒光探針儲(chǔ)蓄池、蛋白質(zhì)儲(chǔ)蓄池和緩沖液儲(chǔ)蓄池分別和微通道相通；所述的基片上有納米通道，微通道分別和納米通道的兩端相通，納米通道的真實(shí)深度小于蛋白質(zhì)分子尺寸，而大于熒光探針分子尺寸；緩沖液儲(chǔ)蓄池為三個(gè)，分別是第一緩沖液儲(chǔ)蓄池、第二緩沖液儲(chǔ)蓄池、第三緩沖液儲(chǔ)蓄池，其中，熒光探針儲(chǔ)蓄池、蛋白質(zhì)儲(chǔ)蓄池、第一緩沖液儲(chǔ)蓄池和第二緩沖液儲(chǔ)蓄池位于納米通道的上游，第三緩沖液儲(chǔ)蓄池則位于納米通道的下游，第二緩沖液儲(chǔ)蓄池位于熒光探針儲(chǔ)蓄池、蛋白質(zhì)儲(chǔ)蓄池、第一緩沖液儲(chǔ)蓄池的下游，且與第二緩沖液儲(chǔ)蓄池相通的微通道位于納米通道的入口處。還包括第四緩沖液儲(chǔ)蓄池，與第四緩沖液儲(chǔ)蓄池相通的微通道位于納米通道的出口處。
還包括激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)點(diǎn)，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)點(diǎn)位于與第二緩沖液儲(chǔ)蓄池相通的微通道上。所述的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)點(diǎn)距離微通道和納米通道結(jié)合處28 mm。二、一種利用微納流控芯片實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記的方法，該方法包括以下步驟
(1)在電滲流的作用下，驅(qū)使蛋白質(zhì)通過微通道，在納米通道的入口處實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的
富集；
(2)在電滲流的作用下，驅(qū)使熒光探針通過微通道，熒光探針對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記后通過納米通道；
(3)在電滲流的作用下，驅(qū)使緩沖液通過微通道，對(duì)標(biāo)記后的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化；
(4)在與納米通道入口處相通的微通道上對(duì)標(biāo)記后的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)，在第二緩沖液儲(chǔ)蓄池(6)中進(jìn)行產(chǎn)物的收集。采用上述技術(shù)方案的積極效果與現(xiàn)有蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
(1)微納流控芯片系統(tǒng)的高效富集能力，可實(shí)現(xiàn)對(duì)超低濃度生物試劑的預(yù)富集；
(2)微納流控芯片系統(tǒng)獨(dú)特的物質(zhì)傳輸性質(zhì)和微納米限域空間效應(yīng)，使整個(gè)熒光標(biāo)記反應(yīng)的速度大大加快，標(biāo)記效率顯著提高；
(3)微納流控芯片可以以微型化和連續(xù)方式實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的預(yù)富集、標(biāo)記和純化，不需要額外的純化過程和色譜分離來除去過量的未反應(yīng)染料分子，操作簡單、方便；
(4)該法是一種簡單、快速、高效的熒光標(biāo)記方法，特別適用于對(duì)微克和納克級(jí)蛋白質(zhì)、核酸以及其他珍貴生物分子的微型化標(biāo)記。


圖I是微納流控芯片不意 圖中1熒光探針儲(chǔ)蓄池，2蛋白質(zhì)儲(chǔ)蓄池，3第一緩沖液儲(chǔ)蓄池，4第四緩沖液儲(chǔ)蓄池，5第三緩沖液儲(chǔ)蓄池，6第二緩沖液儲(chǔ)蓄池，7激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)點(diǎn)。圖2中A是基于微納流控芯片系統(tǒng)的蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記原理示意圖，以牛血清蛋白(BSA)和異硫氰酸熒光素(FITC)為模型體系出是蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記產(chǎn)物(FITC-BSA)的激光誘導(dǎo)熒光光譜圖。
圖3是基于納米通道獨(dú)特性質(zhì)的蛋白質(zhì)富集，標(biāo)記和純化原理示意圖。圖4是6 μ g^mr1 FITC和100 μFITC-BSA在具有不同深度納米通道的微納流控芯片中的富集照片(a-e，對(duì)應(yīng)的納米通道紫外光照時(shí)間分別為80，70，50，40,30 min)，富集時(shí)間和電壓分別為300 s，400 V。圖5是為微納流控芯片上熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)產(chǎn)物FITC-BSA的純化過程照片，照片拍攝時(shí)間分別為緩沖液取代FITC溶液通入納米通道后30 s、60 s、70 s、90 S。圖6是微納流控芯片上熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)產(chǎn)物FITC-BSA的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)光譜圖，其中蛋白質(zhì)富集時(shí)間為300 s，F(xiàn)ITC通入時(shí)間為600 S，純化時(shí)間為90 S，分離電壓為1000 V。圖7是微納流控芯片上不同標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間下獲得的純化產(chǎn)物FITC-BSA熒光光譜圖，標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間(從下到上)分別為120 s、240 s、360 s、480 s、600 s、720 s ；BSA (100Kg/mL)富集時(shí)間為300 s，其它實(shí)驗(yàn)條件為溶液pH 9.0，溫度25 °C，分離電壓1000 V ;插圖是產(chǎn)物FITC-BSA的熒光強(qiáng)度與FITC通過時(shí)間(反應(yīng)時(shí)間)的關(guān)系圖。圖8是蛋白質(zhì)濃度的自然對(duì)數(shù)(InC)與反應(yīng)時(shí)間關(guān)系圖。圖9是微納流控芯片上免疫球蛋白的FITC熒光標(biāo)記光譜圖，從下到上依次為純化產(chǎn)物FITC-IgG、FITC、和未純化的反應(yīng)產(chǎn)物(包括FITC-IgG和未反應(yīng)的FITC)。圖10是微納流控芯片上異硫氰酸羅丹明標(biāo)記的牛血清白蛋白熒光照片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明
圖I是微納流控芯片示意圖，如圖所示，一種實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記的微納流控芯片，包括基片和蓋片，基片和蓋片可逆鍵合。圖中箭頭所示為納米通道所在位置，由于納米通道的深度遠(yuǎn)小于微通道，在圖中用空白所示。蓋片上有微通道、熒光探針儲(chǔ)蓄池I、蛋白質(zhì)儲(chǔ)蓄池2和緩沖液儲(chǔ)蓄池，熒光探針儲(chǔ)蓄池I、蛋白質(zhì)儲(chǔ)蓄池2和緩沖液儲(chǔ)蓄池分別和微通道相通。基片上有納米通道，微通道分別和納米通道的兩端相通，納米通道的直徑可調(diào)，在蛋白質(zhì)標(biāo)記過程中，調(diào)整納米通道的真實(shí)深度小于蛋白質(zhì)的分子直徑，而大于熒光探針的分子直徑。納米通道的作用主要是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行攔截，使得蛋白質(zhì)發(fā)生富集，但是熒光探針可以自由通過。納米通道的直徑可以根據(jù)需要攔截的蛋白質(zhì)的分子大小進(jìn)行設(shè)計(jì)。緩沖液儲(chǔ)蓄池為三個(gè)，分別是第一緩沖液儲(chǔ)蓄池3、第二緩沖液儲(chǔ)蓄池6、第三緩沖液儲(chǔ)蓄池5，其中，熒光探針儲(chǔ)蓄池I、蛋白質(zhì)儲(chǔ)蓄池2、第一緩沖液儲(chǔ)蓄池3和第二緩沖液儲(chǔ)蓄池6位于納米通道的上游，第三緩沖液儲(chǔ)蓄池5則位于納米通道的下游，第二緩沖液儲(chǔ)蓄池6位于熒光探針儲(chǔ)蓄池I、蛋白質(zhì)儲(chǔ)蓄池2、第一緩沖液儲(chǔ)蓄池3的下游，且與第二緩沖液儲(chǔ)蓄池6相通的微通道位于納米通道的入口處。由于納米通道的直徑小于蛋白質(zhì)的分子直徑，而大于熒光探針的分子直徑，因此，可以根據(jù)蛋白質(zhì)和熒光探針的尺寸差別，使熒光探針能夠順利通過納米通道，而蛋白質(zhì)則在納米通道的入口處發(fā)生富集，本發(fā)明正是基于上述原理來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明還包括第四緩沖液儲(chǔ)蓄池4，與第四緩沖液儲(chǔ)蓄池4相通的微通道位于納米通道的出口處。由于第四緩沖液儲(chǔ)蓄池4與第三緩沖液儲(chǔ)蓄池5之間為微米通道，在第四緩沖液儲(chǔ)蓄池4中裝入緩沖液，在負(fù)壓作用下，使第四緩沖液儲(chǔ)蓄池4中的緩沖液經(jīng)過微、米通道，流入第三緩沖液儲(chǔ)蓄池5。將高壓電源的正負(fù)極分別放在第一緩沖液儲(chǔ)蓄池3和第三緩沖液儲(chǔ)蓄池5中，施加電壓，微納米通道中液體即可在電滲流驅(qū)動(dòng)下順利流動(dòng)。為了對(duì)標(biāo)記后的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明還包括激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)點(diǎn)7，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)點(diǎn)7位于與第二緩沖液儲(chǔ)蓄池6相通的微通道上。這是因?yàn)闃?biāo)記后的蛋白質(zhì)從第二緩沖液儲(chǔ)蓄池6中收集，將激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)點(diǎn)7設(shè)于此處便于對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)點(diǎn)7距離微通道和納米通道結(jié)合處28 mm。圖2的A是基于微納流控芯片系統(tǒng)的蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記原理示意圖，以牛血清蛋白(BSA)和異硫氰酸熒光素(FITC)為模型體系；圖2的B是蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記產(chǎn)物(FITC-BSA)的激光誘導(dǎo)熒光光譜圖；圖3是基 于納米通道獨(dú)特性質(zhì)的蛋白質(zhì)富集，標(biāo)記和純化原理示意圖，結(jié)合圖2、圖3所示，蛋白質(zhì)由于分子較大，能夠通過微通道，卻不能通過納米通道，因此，在電流的作用下，蛋白質(zhì)會(huì)在納米通道的入口處發(fā)生富集，當(dāng)熒光探針流過的時(shí)候，會(huì)對(duì)富集的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。熒光探針的分子由于直徑小，能夠順利通過納米通道，此時(shí)，熒光探針與蛋白質(zhì)相比，熒光探針處于過量的狀態(tài)。標(biāo)記完畢后，在電流的作用下，標(biāo)記后的蛋白質(zhì)從與第二緩沖液儲(chǔ)蓄池6相通的微通道流出。當(dāng)通過與第二緩沖液儲(chǔ)蓄池6相通的微通道上的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)點(diǎn)7時(shí)，對(duì)標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，如圖3所示，根據(jù)激光誘導(dǎo)熒光光譜圖的峰面積或峰高即可實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)的定量分析和標(biāo)記反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究。如圖3所示，納通道中的物質(zhì)傳輸可以分為靜電作用區(qū)域和自由傳輸區(qū)域。由于納通道表面帶負(fù)電，陽離子可以通過納通道；陰離子由于靜電排斥會(huì)富集在納通道前端。這種離子選擇性“排斥-富集效應(yīng)”簡稱為“電荷效應(yīng)”。另一方面，如果分子尺寸比自由傳輸區(qū)域小，那么物質(zhì)在自由傳輸區(qū)域中的傳輸行為可認(rèn)為和在本體溶液中相同。否則，物質(zhì)會(huì)由于空間阻礙作用而不能通過。這種效應(yīng)稱為“尺寸效應(yīng)”。當(dāng)溶液PH和緩沖液組成保持不變時(shí)，可以認(rèn)為雙電層(EDL)厚度是一個(gè)常數(shù)。所以，納通道中的物質(zhì)傳輸由自由傳輸區(qū)域的納通道的尺寸決定。圖4是6 μ g^mr1 FITC和100 μ g πιΓ1 FITC-BSA在具有不同深度納米通道的微納流控芯片中的富集照片(a-e，對(duì)應(yīng)的紫外光照時(shí)間分別為80，70，50，40，30 min),富集時(shí)間和電壓分別為300 s,400 V，本發(fā)明中的納米通道的深度可以根據(jù)所要標(biāo)記的蛋白質(zhì)的尺寸任意調(diào)節(jié)，只要是小于蛋白質(zhì)的分子尺寸，而大于熒光探針的分子尺寸均可。由于本發(fā)明中以牛血清蛋白(BSA)為例進(jìn)行說明，經(jīng)過圖4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，納米通道的深度越小，蛋白質(zhì)的富集效果越好。圖5是為微納流控芯片上熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)產(chǎn)物FITC-BSA的純化過程照片，照片拍攝時(shí)間分別為緩沖液取代FITC溶液通入納米通道后30 s、60 s、70 s、90 s，可見，當(dāng)純化時(shí)間為90 s時(shí)，蛋白質(zhì)的熒光照片純化效果最好。圖6是微納流控芯片上熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)產(chǎn)物FITC-BSA的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)光譜圖，其中蛋白質(zhì)富集時(shí)間為300 s, FITC通入時(shí)間為600 S，純化時(shí)間為90 S，分離電壓為1000 V。圖7是微納流控芯片上不同標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間下獲得的純化產(chǎn)物FITC-BSA熒光光譜圖，標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間(從下到上)分別為120 s、240 s、360 s、480 s、600 s、720 s ；BSA (100Kg/mL)富集時(shí)間為300 s，其它實(shí)驗(yàn)條件為溶液pH 9.0，溫度25 °C分離電壓1000 V，如圖所示，隨著標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間的延長，標(biāo)記后蛋白質(zhì)的含量也在增加，但是出現(xiàn)波峰的位置是不變的，插圖是產(chǎn)物FITC-BSA的熒光強(qiáng)度與FITC通過時(shí)間(反應(yīng)時(shí)間)的關(guān)系圖，可以看出，F(xiàn)ITC通過時(shí)間越長，產(chǎn)物FITC-BSA的熒光強(qiáng)度也隨之加大。圖8是蛋白質(zhì)濃度的自然對(duì)數(shù)(InC)與反應(yīng)時(shí)間關(guān)系圖，從圖中可以看出，反應(yīng)時(shí)間越長，剩余蛋白質(zhì)的濃度呈對(duì)數(shù)降低。
一種利用微納流控芯片實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記的方法，其特征在于該方法包括以下步驟
(1)在電滲流的作用下，驅(qū)使蛋白質(zhì)通過微通道，在納米通道的入口處實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的
富集；
(2)在電滲流的作用下，驅(qū)使熒光探針通過微通道，熒光探針對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記后通過納米通道；
(3)在電滲流的作用下，驅(qū)使緩沖液通過微通道，對(duì)標(biāo)記后的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化；
(4)在與納米通道入口處相通的微通道上對(duì)標(biāo)記后的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)，在第二緩沖液儲(chǔ)蓄池6中進(jìn)行產(chǎn)物的收集。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制
實(shí)施例I異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記牛血清蛋白(BSA)
(I)微納流控芯片的制作。微納流控芯片的整體構(gòu)型如圖I所示，包括單納米管道的制備；微米管道的制備；微、納米管道的可逆鍵合。單納米管道的制作采用紫外剝離法(具體操作方法參見c. Wang, J. Ouyang, H. L. Gao, H. ff. Chen, J. J. Xu, X. H. Xia,Η. Y. Chen, Talanta, 2011, 85，298-303)，納米管道的深度通過紫外光照時(shí)間和強(qiáng)度調(diào)控；PDMS微管道制作方法采用模板法(具體操作方法參見C. Wang, J. Ouyang, H. L.Gao, H. ff. Chen, J. J. Xu, X. H. Xia, Η. Y. Chen, Talanta, 2011，85，298-303 ；以及 C. Wang, S. J. Li, Z. Q. ffu, J. J. Xu, Η. Y. Chen, X. H. Xia, Lab Chip,2010，10，639-646);最后，將帶有微通道的PDMS蓋片和帶有納通道的基片可逆鍵合，制作微納流控芯片。熒光探針儲(chǔ)蓄池I加熒光探針溶液，蛋白質(zhì)儲(chǔ)蓄池2加蛋白質(zhì)溶液(BSA，20mM碳酸鹽緩沖液配制，pH=9.0)，第一緩沖液儲(chǔ)蓄池3、第二緩沖液儲(chǔ)蓄池6、第三緩沖液儲(chǔ)蓄池5、第四緩沖液儲(chǔ)蓄池4加緩沖液。(2)微納流控芯片上蛋白質(zhì)的富集、熒光標(biāo)記和純化。加入緩沖液后，通過輕輕擠壓管道使溶液充滿管道。然后，將蛋白質(zhì)溶液加入到儲(chǔ)液池中，在儲(chǔ)液池中插入Pt電極。首先在蛋白質(zhì)儲(chǔ)蓄池2和第三緩沖液儲(chǔ)蓄池5之間加400V電壓，在電流驅(qū)使下，BSA開始在微通道中流動(dòng)，當(dāng)流動(dòng)到納米通道的入口處時(shí)，由于蛋白質(zhì)分子較大，無法通過納米通道，因此會(huì)在納米通道的入口處發(fā)生富集。接著，將電壓切換至熒光探針儲(chǔ)蓄池I和第三緩沖液儲(chǔ)蓄池5之間，讓熒光探針FITC通過微通道，進(jìn)而通過富集的蛋白質(zhì)，進(jìn)行熒光標(biāo)記反應(yīng)。由于熒光探針的分子較小，因此，標(biāo)記完成的多余的熒光探針可以通過納米通道，熒光探針與蛋白質(zhì)相比，始終處于過量的狀態(tài)。反應(yīng)一段時(shí)間后，將電壓切換到第一緩沖液儲(chǔ)蓄池3和第三緩沖液儲(chǔ)蓄池5之間，讓緩沖液取代熒光探針通過納米通道進(jìn)行產(chǎn)物的純化，沖走多余的熒光探針。純化完畢以后，在第一緩沖液儲(chǔ)蓄池3和第二緩沖液儲(chǔ)蓄池6之間施加電壓，由于與第二緩沖液儲(chǔ)蓄池6相通的微通道位于納米通道的入口處，因此，標(biāo)記后的FITC-BSA會(huì)進(jìn)入與第二緩沖液儲(chǔ)蓄池6相通的微通道中。與第二緩沖液儲(chǔ)蓄池6相通的微通道上有激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)點(diǎn)7，在這個(gè)通道中，F(xiàn)ITC-BSA被檢測(cè)和收集。實(shí)施例2異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記免疫球蛋白IgG本實(shí)施例制備方法同實(shí)施例1，其中步驟2中蛋白質(zhì)由牛血清白蛋白換為免疫球蛋白IgG，在其它條件不變情況下，同樣得到熒光標(biāo)記產(chǎn)物FITC-IgG。如圖9，圖9是微納流控芯片上免疫球蛋白的FITC熒光標(biāo)記光譜圖，從下到上依次為純化產(chǎn)物FITC-IgG、FITC、和未純化的反應(yīng)產(chǎn)物(包括FITC-IgG和未反應(yīng)的FITC)，可以看出，這種微/納芯片上標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法可以成功用于標(biāo)記其他蛋白質(zhì)。實(shí)施例3異硫氰酸羅丹明(RBITC)標(biāo)記牛血清蛋白(BSA)
本實(shí)施例制備方法同實(shí)施例1，其中步驟2中 的熒光探針換為正電荷的異硫氰酸羅丹明(RBITC)，在其它條件不變情況下，同樣得到熒光標(biāo)記產(chǎn)物RBITC - BSA0如圖10，圖10是微納流控芯片上異硫氰酸羅丹明標(biāo)記的牛血清白蛋白熒光照片，a圖為純化前的照片，b為純化后的照片，可以看出，微納流控芯片對(duì)牛血清蛋白(BSA)的標(biāo)記效果較好。
權(quán)利要求
1.一種實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記的微納流控芯片，包括基片和蓋片，基片和蓋片可逆鍵合，其特征在干所述的蓋片上有微通道、熒光探針儲(chǔ)蓄池(I )、蛋白質(zhì)儲(chǔ)蓄池(2 )和緩沖液儲(chǔ)蓄池，熒光探針儲(chǔ)蓄池(I)、蛋白質(zhì)儲(chǔ)蓄池(2)和緩沖液儲(chǔ)蓄池分別和微通道相通；所述的基片上有納米通道，微通道分別和納米通道的兩端相通，，納米通道的真實(shí)深度小于蛋白質(zhì)的分子尺寸，而大于熒光探針的分子尺寸；緩沖液儲(chǔ)蓄池為三個(gè)，分別是第一緩沖液儲(chǔ)蓄池(3)、第二緩沖液儲(chǔ)蓄池(6)、第三緩沖液儲(chǔ)蓄池(5)，其中，熒光探針儲(chǔ)蓄池(I)、蛋白質(zhì)儲(chǔ)蓄池(2)、第一緩沖液儲(chǔ)蓄池(3)和第二緩沖液儲(chǔ)蓄池(6)位于納米通道的上游，第三緩沖液儲(chǔ)蓄池(5)則位于納米通道的下游，第二緩沖液儲(chǔ)蓄池(6)位于熒光探針儲(chǔ)蓄池(I)、蛋白質(zhì)儲(chǔ)蓄池(2)、第一緩沖液儲(chǔ)蓄池(3)的下游，且與第二緩沖液儲(chǔ)蓄池(6)相通的微通道位于納米通道的入ロ處。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的所述的ー種實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記的微納流控芯片，其特征在于還包括第四緩沖液儲(chǔ)蓄池(4)，與第四緩沖液儲(chǔ)蓄池(4)相通的微通道位于納米通道的出口處。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的所述的ー種實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記的微納流控芯片，其特征在于還包括激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)點(diǎn)(7)，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)點(diǎn)(7)位干與第二緩沖液儲(chǔ)蓄池(6)相通的微通道上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的所述的ー種實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記的微納流控芯片，其特征在于所述的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)點(diǎn)(7)距離微通道和納米通道結(jié)合處28 mm。
5.ー種利用微納流控芯片實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記的方法，其特征在于該方法包括以下步驟 (1)在電滲流的作用下，驅(qū)使蛋白質(zhì)通過微通道，在納米通道的入口處實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的富集； (2)在電滲流的作用下，驅(qū)使熒光探針通過微通道，熒光探針對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記后通過納米通道； (3)在電滲流的作用下，驅(qū)使緩沖液通過微通道，對(duì)標(biāo)記后的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化； (4)在與納米通道入口處相通的微通道上對(duì)標(biāo)記后的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)，在第二緩沖液儲(chǔ)蓄池(6)中進(jìn)行產(chǎn)物的收集。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記的微納流控芯片，根據(jù)蛋白質(zhì)與熒光探針大小尺寸不同設(shè)計(jì)而成，將納米結(jié)構(gòu)單元引入微流控系統(tǒng)，構(gòu)筑微納流控芯片系統(tǒng)，通過納米通道對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行富集，通過微通道對(duì)標(biāo)記后的蛋白質(zhì)進(jìn)行收集。本發(fā)明還提供了利用微納流控芯片實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記的方法。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)快速熒光標(biāo)記，特別適用于對(duì)微克和納克級(jí)蛋白質(zhì)、核酸以及其他珍貴生物分子的微型化標(biāo)記，而且不需要額外的純化過程和色譜分離來除去過量的未反應(yīng)染料分子，操作簡單、方便。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102628870SQ20121013175
公開日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2012年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月2日
發(fā)明者夏興華, 王琛 申請(qǐng)人:南京大學(xué)