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一種快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件及其制成的檢測卡組件和制備方法

文檔序號:5947317閱讀:140來源:國知局
專利名稱:一種快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件及其制成的檢測卡組件和制備方法
技術領域
本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗領域,具體涉及ー種快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件及其制備方法。
背景技術
血清白蛋白部分可由腎小球通過,但幾乎皆被腎小管重吸收,當腎小球病變時其濾過量增多,以致超過腎小管的重吸收而從尿中排出,便形成尿微量白蛋白(MA)。尿微量白蛋白是指尿中白蛋白的排泄率每分鐘超過20g或24h超過30mg,濃度為30_200mg/L,用常 規(guī)方法無法檢出。大量研究已證明尿微量白蛋白陽性是腎損傷尤其是腎小球損傷的早期標志,其排出量的多少與腎小球基底膜損傷的程度呈正相關,與I型糖尿病、2型糖尿病的預后有密切關系。近年來的大量研究表明,MA同時也是高血壓、冠心病、自身免疫性疾病等造成腎損傷的早期診斷指標,在臨床上受到越來越廣泛的重視。糖尿病(DM)患病率逐年増加,早期發(fā)病多隱匿無癥狀,晩期因嚴重并發(fā)癥而危及人的健康和生命,因此,其早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療至關重要。對糖尿病患者尿分別用于化學試紙法進行蛋白定性及免疫透射比濁法進行尿微量白蛋白定量檢測,結果發(fā)現(xiàn),尿蛋白定性試驗的陽性率僅為8. 46%,而尿微量白蛋白的陽性率為53.7%,說明MA的檢測更能及早地提示糖尿病性腎損傷。近年來,有關原發(fā)性高血壓的研究越來越深入,特別是高血壓造成的靶器官損害已成為中老年人致死致殘的主要因素,業(yè)已證明,高血壓也是加重腎功能惡化的重要因素之一,25%的終末期腎病與高血壓有夫。原發(fā)性高血壓引起的小動脈病變常累及腎血管,使腎小球濾過膜損害,造成尿MA的排出量増加。高血壓患者伴有MA較為普遍,且隨著年齡、病程和高血壓的嚴重程度而升高。有報道在正常高值血壓人群和高血壓人群,MAU的發(fā)生率分別為15. 0%和26. 2%,明顯高于正常血壓者的6. 5%。因此,對高血壓病人的前瞻性研究中MAU被認為是一個預測心血管發(fā)病率和死亡率的較好的早期標志。ー些研究表明微量白蛋白尿可作為ー項評價內皮功能不全以及動脈粥樣硬化的可靠指標,它的出現(xiàn)提示發(fā)生冠心病的危險性將明顯増加。測定非糖尿病的冠心病患者尿中自蛋白的含量,發(fā)現(xiàn)其MA水平明顯高于對照組患者,并且隨著冠狀動脈病變數(shù)量和程度的増加,MA的陽性率均進行性升高,提示MA與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展和病變程度關系密切,MA可能是冠狀動脈粥樣硬化的標志。因此,MA的檢測不僅對腎臟疾病的診斷有重要價值,而且與非腎源性疾病如糖尿病、心血管疾病等有著密切的聯(lián)系,因此,將MA作為ー項常規(guī)檢測,對這些疾病的早期診斷、病情發(fā)展、預后以及臨床指導用藥等有著重要的臨床意義。臨床實驗室常采用放射免疫測定法(RIA)、免疫比濁法(IT)、熒光免疫測定(FIA)、酶免疫測定(EIA)、時間分辨熒光免疫測定法(TRFIA)、間接膠乳凝集試驗、Micral-Test和溴酚藍(BPB)染料結合法測定尿MA,這些方法的參考值范圍變動很大,從5mg/L到超過200mg/L。隨著人們對于低水平MA與心血管疾病關系的認識,這些測定方法的靈敏度遠遠不能滿足要求。疾病的早期診斷和及時治療是至關重要的。但目前的檢測方法,要么需要昂貴的儀器設備和試劑,要么只是半定量的手工方法,操作規(guī)范性差。金屬卟啉是自然界中廣泛存在的一類大環(huán)化合物,如血紅素、葉綠素、VB12等,它們在生命體的新陳代謝以及很多基本生物過程中都起著不可忽視的作用。卟啉分子由4個吡咯環(huán)通過次甲基連結,形成一四配位卟啉核。卟啉環(huán)非常穩(wěn)定,可與直徑為3. 7埃的金屬發(fā)生配位;它與過渡態(tài)金屬形成的絡合物尤其穩(wěn)定,比如,Zn四苯基卟啉(ZnTPP),其穩(wěn)定常數(shù)為1029。大部分金屬都與卟啉形成I : I的絡合物,只有Na、K、Li絡合物的配合比為2 1,兩個金屬原子分別位于卟啉環(huán)平面的上方和下方。卟啉的電子吸收光譜主要有Soret帶(又名B帶)和Q帶。Soret帶位于400 450nm之間,摩爾吸光系數(shù)高(2 5X 105mol-l. L. cm-1)。而金屬卩卜啉的Soret帶吸收較弱,當環(huán)側有親電子基團時,Soret帶將向長波方向移動。卟啉的Q帶一般在450 650nm之間,有4個相關峰;當吡咯環(huán)氮上的氫被金屬離子取代形成金屬卟啉后,4個相關峰減弱或消失。卟啉和金屬卟啉由于具有18電子大π離域結構,所以,以其B帶或Q帶作為激發(fā)波長,均在600 700nm間(或更長的波長范圍)有不同程度的突光發(fā)射;一般情況下,金屬口卜啉的突光強度要弱于口卜啉。室溫下,葉啉本身不發(fā)磷光,當與某些金屬形成絡合物并與有序介質(如表面活性剤、蛋白質和核酸等生物大分子)共存時才在近紅外區(qū)發(fā)射磷光;但只有極少數(shù)的金屬卟啉發(fā)磷光,最常見的為鈀卟啉和鉬卟啉。鈀/鉬卟啉具有極強的磷光,其特點是長壽命(ms),長波長(600 IOOOnm)。最常見的有水溶性meso-四(4-橫酸苯基)P卜琳(H2TSPP4-)和meso-四(4-N-三甲氨基苯基)卟啉(H2TMAP4+)的鈀/鉬絡合物,以及非水溶性的八こ基卟啉(OEP)和四苯基-四苯并卟啉(Ph4TBP)的鈀/鉬絡合物等。600 IOOOnm的近紅外區(qū)是研究生物物質發(fā)光探針和光化學傳感器的一個極為有用的區(qū)域。所以,具有特殊磷光特性的鈀/鉬卟啉便成為生物分析方面非常有效的探針分子,結合一些簡單的檢測儀器便可提供很高的靈敏度和選擇性。這種以鉬為基礎的卟啉在外界激發(fā)下,在650nm發(fā)出強磷光,持續(xù)時間100-微秒(吸收波范圍390-410nm),在670nm發(fā)出強磷光持續(xù)時間500-微秒(吸收波范圍400-420nm)。這些卟啉粒子也有很大的stokes位移(均為280nm)。與其它發(fā)光材料相比絞,鉬卟啉的優(yōu)勢在于極微的光漂白,使用便宜的強光源,如發(fā)光二極管就能有效激發(fā)了。此外,生物樣本和硝酸纖維素膜的背景熒光在390-420nm激發(fā)比在365nm時都低。盡管390-420nm光透過硝酸纖維素膜也不盡理想,但優(yōu)于365nm光,更適合于透射式測量。鉬卟啉還可共價標記抗體,為檢測各種樣本提供了一個靈敏的快速檢測技木。目前,免疫層析技術中所使用的標記物通常是酶、膠體金以及各種彩色微球標記物,這些標記物應用于免疫層析技術中有相同的特點物理吸附方式標記和通過顏色判斷檢測結果。其中物理吸附方式標記(即疏水性和靜電吸附原理)的特點使得其容易形成非特異性干擾,需要在生產エ藝配方中添加非特異性干擾消除試劑,如吐溫20等表面活性劑等,但使用這類試劑的同時,也容易造成基于這類標記物的假陽性或假陰性的結果。另外通過顏色判讀結果在使用時必然受觀察者主觀影響大,尤其是弱陽性結果,且只能做出定性判斷,而無法實現(xiàn)精確的定量判定。這些缺點大大限制了免疫層析技術在臨床檢測中的應用范圍。
因此,建立ー種檢測時間盡量縮短,并且檢測除了能在實驗室進行外,還要求能夠進行床旁檢測,同時能定量測定MA方法,從而為臨床提供準確的診斷依據(jù),是十分必要的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術的不足,提供ー種快速、簡單、靈敏度高、可靠穩(wěn)定且可以定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件及其制成的檢測卡組件和制備方法。本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的ー種快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件,其包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體,試紙條包括底襯、依次接合在底襯上的吸水墊、包被分析膜及樣品墊,該包被分析膜上設有檢測線和質控線,檢測線包被的特異抗體為 抗微量白蛋白單克隆抗體,質控線包被的特異抗體為兔IgG抗體;鉬卟啉標記特異抗體為抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體。優(yōu)選地,所述試紙條的所述底襯一面涂覆黏膠或雙面膠,用于固定所述吸水墊、包被分析膜及樣品墊,其中所述包被分析膜粘附在所述底襯的中間,所述底襯的兩側分別與所述吸水墊和樣品墊連接。優(yōu)選地,所述試紙條的所述吸水墊為ー種濾紙,該濾紙為吸水紙或濾油紙;所述吸水墊粘附在所述底襯上,同時所述吸水墊與所述包被分析膜重疊l_2mm連接。優(yōu)選地,所述包被分析膜由硝酸纖維素膜組成,所述包被分析膜上噴涂抗微量白蛋白單克隆抗體和兔IgG抗體。優(yōu)選地,所述樣品墊為磷酸鹽緩沖液緩浸泡過的玻璃纖維膜,所述樣品墊與所述包被分析膜重疊l_2mm連接。優(yōu)選地,所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體為抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體,并分別用含如下組分的O. 01-0. IM磷酸鹽緩沖液稀釋后用塑料瓶密封而得5% -20%甘油、1% -5%牛血清白蛋白、O. 1-2%甘氨酸和O. 01% -O. 05%表面活性剤。優(yōu)選地,所述獨立包裝的鉬卟啉標的激發(fā)光光源波長范圍為390_420nm,發(fā)射光波長范圍為600nm-700nm。一種制備上述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件的方法,其包括以下步驟I)抗體的制備選用純化的基因工程表達的抗微量白蛋白單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG抗體;2)包被分析膜的制備采用噴膜機分別在ー硝酸纖維膜上劃檢測線和質控線,劃線細致均勻,檢測線與質控線間隔5mm ;用檢測線包被緩沖液稀釋抗微量白蛋白單克隆抗體至濃度為5_20ug/ml,采用噴膜機將抗微量白蛋白單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線上;用質控線包被緩沖液稀釋純化的兔IgG抗體至濃度為5_20ug/ml,采用噴膜機將純化的兔IgG抗體噴印在硝酸纖維膜的質控線上;
將噴膜后的硝酸纖維膜放入30_50°C的真空干燥箱內,干燥后取出密封備用;3)樣品墊的制備用含O. 01%-O. 5%聚こニ醇、I % -5%牛血清白蛋白、O. 01%-O. 05%表面活性劑的O. 01-0. IM磷酸鹽緩沖液浸泡,緩沖液PH為7. 2-7. 6,浸泡處理后,將樣品墊放入65°C的真空干燥箱內,干燥40-60分鐘后取出密封備用;4)免疫熒光試紙條的制備先將包被分析膜粘附在底襯中間位置上,在包被分析膜一端粘附吸水墊,二者重疊l_2mm ;在包被分析膜另一端粘附樣品墊,二者重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜、吸水墊和樣品墊的底襯裁切成細條;5)鉬卟啉標記特異抗體的制備將抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體,分別用O. 05-0. 2M、pH9. 5-11. O碳酸氫鈉溶液稀釋至l_2mg/ml,分別加入30_50mg的鉬卟啉溶解液,攪勻,室溫孵育1-2小時,孵育過程中每隔15-20分鐘分別混勻一次,最后分別用規(guī)格型號為G25的凝膠柱過柱分離純化,分別收集鉬卟啉標記好的抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體,各自用O. 01-0. 1Μ、ρΗ7. 2-7. 6磷酸鹽緩沖液稀釋混勻后于_20°C保存;6)獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體工作液的制備按照需要確定適當濃度的鉬卟啉標記的抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體,采用含5% -20%甘油、1% -5%牛血清白蛋白、O. 1-2%甘氨酸、O. 01% -O. 05%表面活性劑的O. 01-0. IM磷酸鹽緩沖液一井稀釋,分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋,其中每個塑料試劑瓶的分裝量為O. 3-3ml,在2-8°C下保存。優(yōu)選地,所述檢測線包被緩沖液的制備方法用20mM、pH7. 6的磷酸鹽緩沖液稀釋,使含甲醇I. 0%、蔗糖I. 5%、牛血清白蛋白O. 6%的抗微量白蛋白單克隆抗體的濃度至lmg/ml ;質控線包被緩沖液的制備方法用50mM、pH7. 6的聚丁烯緩沖液稀釋,使含甲醇O. 7 %、牛血清白蛋白O. 5%的兔IgG抗體的濃度至O. 5mg/ml ;包被分析膜的制備調試噴膜機,膜液量為25ul/40cm,機器劃線,檢測線與質控線間隔5mm,劃線細致均勻,放置250C -37°C真空干燥箱處理I. 5小時,裝袋密封備用。優(yōu)選地,標記抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體的鉬卟啉標記的鉬卟啉溶解液為30-50mg。優(yōu)選地,樣品墊的制備中,用含O. 4%聚こニ醇、I. 5%牛血清白蛋白、O. 02%表面活性劑的O. 02M磷酸鹽緩沖液浸泡,將浸泡后的所述樣品墊放入65°C真空干燥箱內,干燥40-60分鐘后取出密封備用。ー種由上述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件制成的檢測卡組件,其包括試紙條、由用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的蓋板和用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的背板組成的卡盒以及獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體,所述背板包括放置試紙條的卡槽和用干與蓋板結合的卡齒,所述蓋板包括可觀測檢測結果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔和用干與背板的卡齒結合的固定孔,所述試紙條通過所述卡齒與所述固定孔結合而嵌合在所述背板和所述蓋板之間,其中,所述包被分析膜正對所述檢測窗,所述樣品墊正對所述加樣孔;另外,獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。 一種制備上述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件制成的檢測卡組件的方法,其包括以下步驟I)制成背板和蓋板用聚苯こ烯或聚氯こ烯等塑料材質制成背板和蓋板,所述背板包括放置所述試紙條的卡槽和用干與所述蓋板結合的卡齒,所述蓋板包括可觀測結果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔以及用干與所述背板的卡齒結合的固定孔;2)組裝將試紙條放在所述背板的所述卡槽內,通過所述背板的卡齒與所述蓋板的固定孔結合,將試紙條嵌合在背板和蓋板之間,其中,包被分析膜正對所述檢測窗,樣品墊正對所述加樣孔。3)包裝
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將I人份的檢測卡與一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內,并配備I瓶獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體,將多組所述鋁箔塑料袋和所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體裝入一個包裝盒,在2°C _8°C環(huán)境下避光不凍存的進行保存。本發(fā)明提供的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件,利用熒光的高靈敏特點,樣品與鉬卟啉標記抗體反應后再加入檢測卡,使得樣品與鉬卟啉標記抗體在液相中全面接觸、反應充分,這樣的檢測成本低廉,操作簡單、快速、靈敏度高、可靠穩(wěn)定且特異性好,只需要配套專用熒光檢測儀,即可定量測定微量白蛋白,其對于腎臟疾病、心腦血管事件發(fā)生的預防有極為重要的意義,因此可廣泛應用于各級醫(yī)療檢驗場所。


下面結合附圖中的實施例對本發(fā)明作進ー步的詳細說明,但并不構成對本發(fā)明的任何限制。圖I是本發(fā)明試紙條的結構示意圖。圖2是本發(fā)明檢測卡的結構示意圖。圖3是鉬卟啉發(fā)光材料的發(fā)射光譜曲線。圖4為本發(fā)明的反應方式示意圖。圖5為本發(fā)明的檢測結果示意圖。圖6為本發(fā)明的微量白蛋白檢測標準工作曲線。圖7為本發(fā)明的微量白蛋白檢測結果相關性分析曲線。圖中底襯I、吸水墊2、包被分析膜3、檢測線4、質控線5、樣品墊6、加樣孔7、檢測窗8、項目名稱9、固定孔10、蓋板11、卡槽12、背板13、卡齒14、鉬卟啉標記特異抗體15、微量白蛋白16、檢測線抗微量白蛋白單克隆抗體17、質控線兔IgG抗體18。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發(fā)明作進ー步說明。實施例I :參閱圖I所示,本發(fā)明的ー種基于鉬卟啉發(fā)光技術的快速定量檢測微量白蛋白(MA)的免疫熒光試紙條組件,其包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體15。試紙條包括底襯I、粘附在底襯I中間位置的包被分析膜3、位于包被分析膜3兩端且與其重疊l_2mm連接的吸水墊2及樣品墊6。該包被分析膜3上設有通過噴膜機噴印形成的檢測線4和質控線5,檢測線4包被的特異抗體為抗微量白蛋白單克隆抗體,質控線5包被的特異抗體為兔IgG抗體。鉬卟啉標記特異抗體為抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體。試紙條的底襯I 一面涂覆黏膠或雙面膠,用于固定吸水墊2、包被分析膜3及樣品墊6 ;吸水墊2為ー種濾紙,該濾紙為吸水紙或濾油紙;包被分析膜3由硝酸纖維素膜組成,包被分析膜上噴涂抗微量白蛋白單克隆抗體和兔IgG抗體;樣品墊為磷酸鹽緩沖液緩浸泡過的玻璃纖維膜。獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體15為抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體,用含5% -20%甘油、1% -5%牛血清白蛋白、O. 1-2%甘氨酸、O. 01%-O. 05%表面活性劑的 O. 01-0. IM磷酸鹽緩沖液稀釋,用塑料試劑瓶密封包裝。本發(fā)明還提供一種制備所述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件的方法,其包括以下步驟I)抗體的制備選用純化的基因工程表達的抗微量白蛋白單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG抗體;2)包被分析膜3的制備采用噴膜機分別在ー硝酸纖維膜上劃檢測線和質控線,劃線細致均勻,檢測線與質控線間隔5mm ;用檢測線包被緩沖液稀釋抗微量白蛋白單克隆抗體至濃度為5_20ug/ml,采用噴膜機將抗微量白蛋白單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線上;用質控線包被緩沖液稀釋純化的兔IgG抗體至濃度為5_20ug/ml,采用噴膜機將純化的兔IgG抗體噴印在硝酸纖維膜的質控線上; 將噴膜后的硝酸纖維膜放入30_50°C的真空干燥箱內,干燥后取出密封備用;;3)樣品墊的制備用含O. 01%-O. 5%聚こニ醇、I % -5%牛血清白蛋白、O. 01%-O. 05%表面活性劑的O. 01-0. IM磷酸鹽緩沖液浸泡,緩沖液PH為7. 2-7. 6,浸泡處理后,將樣品墊放入65°C的真空干燥箱內,干燥40-60分鐘后取出密封備用;4)免疫熒光試紙條的制備先將包被分析膜粘附在底襯中間位置上,在包被分析膜一端粘附吸水墊,二者重疊l_2mm ;在包被分析膜另一端粘附樣品墊,二者重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜、吸水墊和樣品墊的底襯裁切成4mm寬的細條;5)鉬卟啉標記特異抗體15的制備將抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體,分別用O. 05-0. 2M、pH9. 5_11. O碳酸氫鈉溶液稀釋至l_2mg/ml,分別加入適量的鉬卟啉溶解液,攪勻,室溫孵育1_2小時,孵育過程中每隔15-20分鐘分別混勻一次,最后分別用規(guī)格型號為G25的凝膠柱過柱分離純化,分別收集鉬卟啉標記好的抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體,各自用0.01-0. 1M、PH7. 2-7. 6磷酸鹽緩沖液稀釋混勻后于_20°C保存;6)獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體15工作液的制備
按照需要確定適當濃度的鉬卟啉標記的抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體,采用含5% -20%甘油、1% -5%牛血清白蛋白、O. 1-2%甘氨酸、O. 01% -O. 05%表面活性劑的O. 01-0. IM磷酸鹽緩沖液一井稀釋,分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋,其中每個塑料試劑瓶的分裝量為O. 3-3ml,在2-8°C下保存。參閱圖2所示,ー種由快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件制成的檢測卡組件,其包括試紙條、由用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的蓋板11和用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的背板13組成的卡盒以及獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體15。所述背板13包括放置試紙條的卡槽12和用干與蓋板結合的卡齒14 ;所述蓋板11包括可觀測檢測結果的檢測窗8、可滴加樣品的加樣孔7和用干與背板13的卡齒14結合的固定孔10。所述試紙條通過所述卡齒14與所述固定孔10結合而嵌合在所述背板13和所述蓋板11之間,即形成了檢測卡。其中,所述包被分析膜3正對所述檢測窗8,所述樣品墊6正對所述加樣孔7 ;另夕卜,獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體15分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。 本發(fā)明提供一種制備快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件制成的檢測卡組件的方法,其包括以下步驟I)制成背板和蓋板用聚苯こ烯或聚氯こ烯等塑料材質制成背板13和蓋板11,所述背板包括放置所述試紙條組件的卡槽12和用干與所述蓋板結合的卡齒14,所述蓋板11包括可觀測結果的檢測窗8、可滴加樣品的加樣孔7以及用干與所述背板的卡齒結合的固定孔10 ;2)組裝將試紙條放在所述背板13的所述卡槽12內,通過所述背板13的卡齒14與所述蓋板11的固定孔10結合,將試紙條組件嵌合在背板13和蓋板11之間,其中,包被分析膜3正對所述檢測窗8,樣品墊6正對所述加樣孔7。3)包裝將I人份的檢測卡與一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內,并配備I瓶獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體15,將多組所述鋁箔塑料袋和所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體15裝入ー個包裝盒,在2°C _8°C環(huán)境下避光不凍存的進行保存。檢測原理參閱圖3所示,鉬卟啉發(fā)光材料的發(fā)射光譜曲線進行分析,發(fā)現(xiàn)鉬卟啉所具有的特征光譜的激發(fā)光光源波長范圍為390-420nm,發(fā)射光波長范圍為600_700nm。由于鉬卟啉發(fā)光標記物的特點,使得以其作為標記物的免疫熒光試紙條可與儀器結合,使得基于鉬卟啉發(fā)光技術的免疫層析試紙條可進行靈敏度極高的多重分析、且對目標被檢測物進行靈敏度極高的精確定量檢測。本發(fā)明采用免疫熒光快速檢測技術,利用熒光的高靈敏特點,待測樣品與鉬卟啉標記先在試劑瓶內反應,由于待測樣品與鉬卟啉標記在液相中全面接觸,反應充分,因此可大幅度提高反應靈敏度,同時增加了待測樣品的稀釋倍數(shù),去除了待測樣品的基質效應,使定量結果有很好的可重復性,而且此方法省略了直接加樣步驟,提高了定量結果的精密度和準確度,可滿足同時檢測高值和低值的臨床診斷要求,鉬卟啉標記特異抗體與待測樣品中充分結合形成一復合物;然后復合物轉加到檢測卡的加樣孔7的樣品墊6上,如圖4所示,在吸水墊2的吸力下該復合物流經到檢測卡中的包被分析膜3上,如果該復合物具有微量白蛋白,其能被檢測線4上的抗微量白蛋白單克隆抗體捕獲17,在緑色光照射下以紅外光光信號的形式表現(xiàn)出來,所發(fā)出的熒光可用專用儀器定量測定,熒光強度與樣品中微量白蛋白的濃度成正比;如果復合物中微量白蛋白低于最低檢測標準,則檢測線4不會發(fā)出熒光;試紙條有效的情況下,質控線5上的兔IgG抗體18均會與復合物反應發(fā)出熒光。請參閱圖5中的a、b、c所示,即檢測線4與質控線5均發(fā)光,試紙條檢測結果呈陽性;只有質控線5發(fā)光,試紙條檢測結果呈陰性;兩條線均未發(fā)光,試紙條檢測結果無效。本發(fā)明將鉬卟啉發(fā)光材料與免疫層析技術相結合,為傳統(tǒng)的免疫層析技術帶來了突破性的變革一、鉬卟啉發(fā)光標記物的特點,使得以其作為標記物的免疫層析試紙條可與儀器結合,對目標被檢測物進行靈敏度極高的精確定量檢測;ニ、鉬卟啉所具有的特征光譜(激發(fā)光譜和發(fā)射光譜),使得基于鉬卟啉發(fā)光技術的免疫層析試紙條可進行靈敏度極高的多重分析,即一次性對生物樣品中的多個目標被檢測物進行檢測;三、鉬卟啉獨特的大Stock位移的發(fā)光現(xiàn)象,使其作為標記物的檢測過程排除了由于目標被檢測物自發(fā)熒光造成干擾的可能,提高了信噪比,從而提高了檢測的靈敏度和特異性;四、通過共價方式交聯(lián)生物活性分子,在保證檢測靈敏度的前提下提高了檢測系統(tǒng)的可靠性和穩(wěn)定性。本發(fā)明標準工作曲線首先,將提純的微量白蛋白標準品用I : 10稀釋的正常人血清(采用pH7. 20. 02MPB緩沖液稀釋)作為稀釋液配制系列濃度標準品,濃度為0ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的6份樣品。其次,姆個樣品分別用10個MA試紙條檢測10次,10次檢測儀器判讀的樣品檢測T值和對照C值分別取平均值,最終根據(jù)二者的比值得出每個濃度對應的T/C結果,列于表I。表I、不同濃度下的T/C值
權利要求
1.ー種快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件,其特征在于包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體,試紙條包括底襯、依次接合在底襯上的吸水墊、包被分析膜及樣品墊,該包被分析膜上設有檢測線和質控線,檢測線包被的特異抗體為抗微量白蛋白單克隆抗體,質控線包被的特異抗體為兔IgG抗體;鉬卟啉標記特異抗體為抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體。
2.根據(jù)權利要求I所述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件,其特征在于所述試紙條的所述底襯一面涂覆黏膠或雙面膠,用于固定所述吸水墊、包被分析膜及樣品墊,其中所述包被分析膜粘附在所述底襯的中間,所述底襯的兩側分別與所述吸水墊和樣品墊連接。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件,其特征在于所述試紙條的所述吸水墊為ー種濾紙,該濾紙為吸水紙或濾油紙;所述吸水墊粘附在所述底襯上,同時所述吸水墊與所述包被分析膜重疊l_2mm連接。
4.根據(jù)權利要求I或2所述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件,其特征在于所述包被分析膜由硝酸纖維素膜組成,所述包被分析膜上噴涂抗微量白蛋白單克隆抗體和兔IgG抗體。
5.根據(jù)權利要求I或2所述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件,其特征在于所述樣品墊為磷酸鹽緩沖液浸泡過的玻璃纖維膜,所述樣品墊與所述包被分析膜重疊l-2mm連接。
6.根據(jù)權利要求I或2所述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件,其特征在于所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體為抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體,并用含如下組分的O. 01-0. IM磷酸鹽緩沖液稀釋后用塑料瓶密封而得5% -20%甘油、1% -5%牛血清白蛋白、O. 1-2%甘氨酸和O. 01% -O. 05%表面活性剤。
7.根據(jù)權利要求I所述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件,其特征在于所述獨立包裝的鉬卟啉標記的激發(fā)光光源波長范圍為390-420nm,發(fā)射光波長范圍為600nm-700nmo
8.ー種制備權利要求I所述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件的方法,其特征在于它包括以下步驟 1)抗體的制備 選用純化的基因工程表達的抗微量白蛋白單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG抗體; 2)包被分析膜的制備 采用噴膜機分別在ー硝酸纖維膜上劃檢測線和質控線,劃線細致均勻,檢測線與質控線間_ 5mm ; 用檢測線包被緩沖液稀釋抗微量白蛋白單克隆抗體至濃度為5-20ug/ml,采用噴膜機將抗微量白蛋白單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線上; 用質控線包被緩沖液稀釋純化的兔IgG抗體至濃度為5-20ug/ml,采用噴膜機將純化的兔IgG抗體噴印在硝酸纖維膜的質控線上; 將噴膜后的硝酸纖維膜放入30-50°C的真空干燥箱內,干燥后取出密封備用; 3)樣品墊的制備用含O. 01% -O. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白、O. 01% -O. 05%表面活性劑的O. 01-0. IM磷酸鹽緩沖液浸泡,緩沖液PH為7. 2-7. 6,浸泡處理后,將樣品墊放入65°C的真空干燥箱內,干燥40-60分鐘后取出密封備用; 4)免疫熒光試紙條的制備 先將包被分析膜粘附在底襯中間位置上,在包被分析膜一端粘附吸水墊,二者重疊I-2mm ;在包被分析膜另一端粘附樣品墊,二者重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜、吸水墊和樣品墊的底襯裁切成細條; 5)鉬卟啉標記特異抗體的制備 將抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體,分別用O. 05-0. 2M、pH9. 5-11. O碳酸氫鈉溶液稀釋至l_2mg/ml,分別加入適量的鉬卟啉溶解液,攪勻,室溫孵育1_2小時,孵育過程中每隔15-20分鐘分別混勻一次,最后分別用規(guī)格型號為G25的凝膠柱過柱分離純化,分別收集鉬卟啉標記好的抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體,各自用0.01-0. 1M、PH7. 2-7. 6磷酸鹽緩沖液稀釋混勻后于_20°C保存; 6)獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體工作液的制備 按照需要確定適當濃度的鉬卟啉標記的抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體,采用含5% -20%甘油、1% -5%牛血清白蛋白、O. 1-2%甘氨酸、O. 01%-O. 05%表面活性劑的O. 01-0. IM磷酸鹽緩沖液一并稀釋,分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋,其中每個塑料試劑瓶的分裝量為O. 3-3ml,在2-8°C下保存。
9.如權利要求8所述的制備權利要求I所述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件的方法,其特征在于檢測線包被緩沖液的制備方法為用20mM、pH7. 6的磷酸鹽緩沖液稀釋,使含甲醇I. 0%、蔗糖I. 5%、牛血清白蛋白O. 6%的抗微量白蛋白單克隆抗體的濃度至lmg/ml ;質控線包被緩沖液的制備方法用50mM、pH7. 6的聚丁烯緩沖液稀釋,使含甲醇0.7%、牛血清白蛋白O. 5%的兔IgG抗體的濃度至O. 5mg/ml ;包被分析膜的制備調試噴膜機,膜液量為25ul/40cm,機器劃線,檢測線與質控線間隔5mm,劃線細致均勻,放置25°C -37°C真空干燥箱處理I. 5小時,裝袋密封備用。
10.如權利要求8所述的制備權利要求I所述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件的方法,其特征在于鉬卟啉標記特異抗體的制備中的標記抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體的鉬卟啉標記的鉬卟啉溶解液為30-50mg。
11.如權利要求8所述的制備權利要求I所述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件的方法,其特征在于樣品墊的制備中,用含O. 4%聚こニ醇、I. 5%牛血清白蛋白、O. 02%表面活性劑的O. 02M磷酸鹽緩沖液浸泡,將浸泡后的所述樣品墊放入65°C真空干燥箱內,干燥40-60分鐘后取出密封備用。
12.—種由權利要求I所述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件制成的檢測卡組件,其特征在于包括試紙條、由用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的蓋板和用聚苯こ烯或聚氯こ烯制成的背板組成的卡盒以及獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體,所述背板包括放置試紙條的卡槽和用干與蓋板結合的卡齒,所述蓋板包括可觀測檢測結果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔和用干與背板的卡齒結合的固定孔,所述試紙條通過所述卡齒與所述固定孔結合而嵌合在所述背板和所述蓋板之間,其中,所述包被分析膜正對所述檢測窗,所述樣品墊正對所述加樣孔;另外,獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。
13.ー種制備權利要求8所述的快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件制成的檢測卡組件的方法,其特征在于包括以下步驟 1)制成背板和蓋板 用聚苯こ烯或聚氯こ烯等塑料材質制成背板和蓋板,所述背板包括放置所述試紙條的卡槽和用干與所述蓋板結合的卡齒,所述蓋板包括可觀測結果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔以及用干與所述背板的卡齒結合的固定孔; 2)組裝 將試紙條放在所述背板的所述卡槽內,通過所述背板的卡齒與所述蓋板的固定孔結合,將試紙條嵌合在背板和蓋板之間,其中,包被分析膜正對所述檢測窗,樣品墊正對所述加樣孔,另外,獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中并密封瓶蓋。
3)包裝 將I人份的檢測卡與一包干燥劑封裝在鋁箔塑料袋內,并配備I瓶獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體,將多組所述鋁箔塑料袋和所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體裝入ー個包裝盒,在2°C _8°C環(huán)境下避光不凍存的進行保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速定量檢測微量白蛋白的免疫熒光試紙條組件及其制成的檢測卡組件及制備方法,試紙條組件包括試紙條和獨立包裝的鉑卟啉標記特異抗體,試紙條包括底襯、吸水墊、包被分析膜及樣品墊,該包被分析膜上設有檢測線和質控線,檢測線包被的特異抗體為抗微量白蛋白單克隆抗體,質控線包被的特異抗體為兔IgG抗體;鉑卟啉標記特異抗體為抗微量白蛋白單克隆抗體和抗兔IgG抗體;檢測卡組件包括試紙條、由蓋板和背板組成的卡盒以及獨立包裝的鉑卟啉標記特異抗體,本發(fā)明檢測人尿液中微量白蛋白,操作簡單、快速、靈敏和特異性好,且具有良好的臨床應用前景。
文檔編號G01N33/558GK102680704SQ201210133900
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月28日 優(yōu)先權日2012年4月28日
發(fā)明者李必松, 梁萬興, 羅琪, 謝愛武 申請人:廣州鴻琪光學儀器科技有限公司
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