專利名稱：一種檢測(cè)雞組織中脫氫乙酸殘留量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)雞組織(肌肉、肝臟和腎臟)中脫氫乙酸殘留量的方法。
背景技術(shù)：
脫氫乙酸作為一種防腐劑，在食品行業(yè)中應(yīng)用較廣，現(xiàn)也作為飼料添加劑用于防霉。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于脫氫乙酸含量檢測(cè)的報(bào)道，多是針對(duì)飲料、烘焙糕點(diǎn)及淹菜等食品，檢測(cè)方法主要有紫外分光光度度法、氣相色譜一氫火焰離子化檢測(cè)法、高效液相色譜一紫外檢測(cè)法。但有關(guān)動(dòng)物性組織中脫氫乙酸測(cè)定的方法未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了能檢測(cè)雞組織中脫氫乙酸殘留量，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)雞組織(肌肉、肝臟和腎臟)中脫氫乙酸殘留量的方法，能檢測(cè)雞組織中脫氫乙酸的殘留量。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種檢測(cè)雞組織中脫氫乙酸殘留量的方法，是將雞組織樣品經(jīng)過(guò)提取、凈化后，以甲醇-O. 02%乙酸銨溶液為流動(dòng)相，高效液相色譜-紫外檢測(cè)法(HPLC-UVD)檢測(cè)；液相色譜條件為色譜柱，Eclipse Plus C18, 5 μ m, 250mmX 4. 6mm
1.d.;流動(dòng)相，甲醇-O. 02%乙酸銨溶液(20/80，V/V);流速1. OmL .mirT1 ;檢測(cè)波長(zhǎng)290nm ；柱溫30°C ;進(jìn)樣體積20 μ L0本發(fā)明中雞組織樣品中脫氫乙酸的提取和凈化推薦使用乙腈超聲波提取，正己烷及PAX固相萃取柱凈化。具體操作是將雞組織絞碎后稱量，加乙腈IOmL勻漿并用乙腈洗漆勻衆(zhòng)機(jī)刀片。乙腈勻衆(zhòng)液超聲波提取IOmin后4000rpm離心IOmin,收集上清液,殘洛用乙腈IOmL重復(fù)提取，合并上清液并加入正丙醇3mL后于40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入乙腈
2.OmL漩渦振蕩溶解殘?jiān)?。若為肌肉樣品，殘?jiān)芙獾囊译嬉褐胈20°C冰凍15min，4000rpm離心lOmin，上清液過(guò)O. 22 μ m有機(jī)濾膜，供HPLC檢測(cè)用。若為腎臟樣品，則加入正己烷4mL潤(rùn)旋混合5min,4000rpm離心IOmin,棄去正己燒，并用正己燒重復(fù)凈化三次后，乙腈相過(guò)
O.22 μ m有機(jī)濾膜，供HPLC檢測(cè)用。若為肝臟樣品，加入正己烷4mL渦旋混合5min，4000rpm離心IOmin,棄去正己燒，乙腈相加至已分別經(jīng)甲醇5mL和1%氨水溶液5mL活化、平衡后的PAX小柱，自然流出。依次用3%氨水溶液5mL和甲醇5mL淋洗小柱,然后用5%乙酸甲醇溶液5mL洗脫，收集洗脫液并用氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)靡译?. OmL溶解后，過(guò)O. 22 μ m有機(jī)濾膜，供HPLC檢測(cè)用。本發(fā)明方法所測(cè)得雞組織中脫氫乙酸的LOD為O. 05mg · kg—1 ；L0Q為O. 2mg · kg_S能夠滿足關(guān)于動(dòng)物性食品中脫氫乙酸藥物殘留分析的要求。


圖I是Img · Γ1脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。圖2是肌肉組織添加脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖；A:空白肌肉；B:空白肌肉+O.5mg · kg-1脫氫乙酸。圖3是腎臟添加脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖；C :空白腎臟；D :空白腎臟+ Img-kg-1脫氫乙酸。圖4是肝臟添加脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖；E :空白肝臟；F :空白肝臟+ Img -kg-1
脫氫乙酸。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。本發(fā)明中所涉及到的溶液百分濃度，除特別說(shuō)明外均為體積百分濃度。I.實(shí)驗(yàn)雞的飼養(yǎng)和樣品采集隨機(jī)選取30日齡黃羽肉雞6只，體重I. 25±O. 40kg，連續(xù)7d飼喂不含任何抗菌藥物的全價(jià)飼料，自由飲水。雞于第8d處死，分別采集肌肉、肝臟和腎臟組織作為空白對(duì)照樣品，-20°C保存。2.樣品處理本發(fā)明提取、萃取、凈化步驟⑴雞組織(肌肉、肝臟和腎臟)自然解凍后絞碎，準(zhǔn)確稱取2. Og于50mL離心管中，加乙腈IOmL勻衆(zhòng),并用乙腈5mL洗漆刀片，超聲波提取IOmin后4000rpm離心IOmin,收集上清液，殘?jiān)靡译鍵OmL重復(fù)提取，合并上清液并加入正丙醇3mL后于40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入乙腈2. OmL渦旋振蕩溶解殘?jiān)虎萍∪鈽悠?，則殘?jiān)芙獾囊译嬉恨D(zhuǎn)移至IOmL離心管中，置-20°C冰凍15min，4000rpm離心lOmin，上清液過(guò)O. 22 μ m有機(jī)濾膜，供HPLC檢測(cè)用；⑶腎臟樣品，則殘?jiān)芙獾囊译嬉恨D(zhuǎn)移至IOmL離心管中，加入正己烷4mL渦旋混合5min,4000rpm離心IOmin,棄去正己燒,并用正己燒重復(fù)凈提三次后，乙腈相過(guò)O. 22 μ m有機(jī)濾膜，供HPLC檢測(cè)用；⑷肝臟樣品，則殘?jiān)芙獾囊译嬉恨D(zhuǎn)移至IOmL離心管中，加入正己烷4mL旋渦混合5min,4000rpm離心IOmin,棄去正己燒，乙腈相加至已分別經(jīng)甲醇5mL和1%氨水溶液5mL活化、平衡后的PAX小柱，自然流出。依次用3%氨水溶液5mL和甲醇5mL淋洗小柱,然后用5%乙酸甲醇溶液5mL洗脫，收集洗脫液于IOmL試管，氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)靡译?. OmL溶解后，過(guò)O. 22 μ m有機(jī)濾膜，供HPLC檢測(cè)用。3.色譜條件及色譜分離行為色譜柱EclipsePlus C18, 5 μ m, 250mmX 4. 6mm i. d.;流動(dòng)相甲醇-0· 02% 乙酸銨溶液(20/80，V/V);流速1. OmL · min—1 ;檢測(cè)波長(zhǎng)290nm ;柱溫30°C ;進(jìn)樣體積20 μ L。在本發(fā)明條件下，雞組織中脫氫乙酸與共存物質(zhì)能夠完全分離，空白樣品及空白添加樣品色譜分離圖見圖I和圖2 — 4。
4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取空白樣品2. 0g，置50mL聚丙烯離心管中，添加不同濃度的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液各100 μ L，使在空白雞組織樣品中添加濃度分別為10. 0,5. 0,2. O, I. 0,0. 5和OJmg.kg—1，經(jīng)上述樣品提取與凈化后，取20yL進(jìn)行HPLC檢測(cè)。每個(gè)濃度5次重復(fù)。以脫氫乙酸添加濃度為自變量，脫氫乙酸平均峰面積為因變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為 y=21251x+177. 9、相關(guān)系數(shù) O. 9998、線性范圍為 O. 2 10. Omg · kg'在本發(fā)明條件下，在標(biāo)準(zhǔn)品濃度為O. 2 10. Omg *kg_1范圍內(nèi)脫氫乙酸峰面積(y) 與其濃度(X)呈線性相關(guān)，且線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)O. 9998。5.回收率及精密度的測(cè)定準(zhǔn)確稱取2. Og樣品置50mL聚丙烯離心管中，添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液各100 μ L，使在空白雞組織樣品中添加濃度分別為5. O, I. 0,0. 5和O. 2mg -kg^1,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行。經(jīng)上述樣品提取與凈化后，取20yL進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)脫氫乙酸實(shí)際測(cè)定量與理論添加量的比值計(jì)算添加回收率。在同日內(nèi)不同時(shí)間用同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線及同一臺(tái)HPLC分析，重復(fù)6次測(cè)定，求得日內(nèi)(批內(nèi))精密度。在一周內(nèi)不同日以不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線及同一臺(tái)HPLC分析，重復(fù)6次測(cè)定，求得日間(批間)精密度。本發(fā)明方法中測(cè)定雞組織中脫氫乙酸的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的結(jié)果見表I。在O. 5 5. Omg ·kg—1范圍內(nèi)，肌肉樣品回收率在88. 21% 93. 87% ;肝臟樣品回收率在83. 83% 86. 64% ;腎臟樣品回收率在83. 78% 89. 84%。表I雞組織中脫氫乙酸的添加回收率(n=6)
、長(zhǎng)—hn^肌肉肝臟腎臟
添加值
(呢.^g1) ^an ± RSD (%)Μθ"η 土 RSD (%) ^an ± RSD (%)
O UO U
0.5 88. 21 土 _ I.83.83士 ___ 83.78 土
5.68b 144.45” 5.076.冊(cè)
U士 ^89518± Η-42 f-f ± 4.79
4.152.944.15
_ n 93.87 土 ...86. 64土 ' —. 89.84 土 _ …
b. O ^b 二,4 Si …IU
ο. 854. I/4. 58本發(fā)明方法中測(cè)定雞組織中脫氫乙酸的精密度結(jié)果見表2。表2雞組織中脫乙酸測(cè)定的精密度(n=6)
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)雞組織中脫氫乙酸殘留量的方法，是將雞組織樣品經(jīng)過(guò)提取、凈化后，以甲醇-O. 02%乙酸銨溶液為流動(dòng)相，高效液相色譜-紫外檢測(cè)法檢測(cè)； 液相色譜條件為色譜柱，Eclipse Plus C18, 5 μ m, 250mmX 4. 6mm i. d.;流動(dòng)相為體積比20/80的甲醇-O. 02%乙酸銨溶液；流速1. O mL · min—1 ;檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm ;柱溫30°C ；進(jìn)樣體積20mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述檢測(cè)雞組織中脫氫乙酸殘留量的方法，其特征在于雞組織樣品中脫氫乙酸的提取和凈化使用乙腈超聲波提取，正己烷及PAX固相萃取柱凈化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)雞組織中脫氫乙酸殘留量的方法，其特征在于雞組織樣品中脫氫乙酸的提取和凈化具體操作是將雞組織絞碎后稱量，加乙腈10 mL勻漿并用乙腈洗漆勻衆(zhòng)機(jī)刀片；乙腈勻衆(zhòng)液超聲波提取10 min后4000 rpm離心10 min,收集上清液，殘?jiān)靡译?0 mL重復(fù)提取，合并上清液并加入正丙醇3 mL后于40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，力口入乙腈2. O mL漩渦振蕩溶解殘?jiān)? 若為肌肉樣品，殘?jiān)芙獾囊译嬉褐?20°C冰凍15 min, 4000 rpm離心10 min，上清液過(guò)O. 22 μ m有機(jī)濾膜，供HPLC檢測(cè)用； 若為腎臟樣品，貝1J加入正己燒4 mL潤(rùn)旋混合5 min, 4000 rpm離心10 min,棄去正己烷，并用正己烷重復(fù)凈化三次后，乙腈相過(guò)O. 22 μ m有機(jī)濾膜，供HPLC檢測(cè)用； 若為肝臟樣品，加入正己燒4 mL潤(rùn)旋混合5 min,4000 rpm離心10 min,棄去正己燒，乙腈相加至已分別經(jīng)甲醇5 mL和I %氨水溶液5 mL活化、平衡后的PAX小柱，自然流出；依次用3 %氨水溶液5 mL和甲醇5 mL淋洗小柱，然后用5 %乙酸甲醇溶液5 mL洗脫，收集洗脫液并用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)靡译?. O mL溶解后，過(guò)O. 22 μ m有機(jī)濾膜，供HPLC檢測(cè)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)雞組織(肌肉、肝臟和腎臟)中脫氫乙酸殘留量的方法。該方法是將雞組織樣品經(jīng)過(guò)提取、凈化后，以甲醇-0.02%乙酸銨溶液為流動(dòng)相,高效液相色譜-紫外檢測(cè)法檢測(cè)；液相色譜條件為色譜柱，EclipsePlusC18，5μm，250mm×4.6mmi.d.；流動(dòng)相為體積比20/80的甲醇-0.02%乙酸銨溶液；流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)290nm；柱溫30℃；進(jìn)樣體積20mL。本發(fā)明方法所測(cè)得雞組織中脫氫乙酸的LOD為0.05mg·kg-1；LOQ為0.2mg·kg-1，能夠滿足關(guān)于動(dòng)物性食品中脫氫乙酸藥物殘留分析的要求。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102636590SQ20121013727
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月6日
發(fā)明者劉學(xué), 崔衛(wèi)波, 張雨梅, 杜玉峰, 殷俊, 胡成云 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)