專利名稱：以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速含量測定方法，屬于分析化學(xué)和納米技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
金納米粒子由于其易于制備和生物功能化、優(yōu)良的生物穩(wěn)定性和獨(dú)特的光譜特性已受到廣泛的關(guān)注。金納米粒子的表面等離子吸收帶位于電磁波譜的可見光區(qū)，并受納米聚集體的形貌的影響。典型的膠體納米金粒子為酒紅色，而它們的聚集體則呈現(xiàn)紫色或藍(lán)色，這是由于納米金的表面等離子吸收帶向長波長移動所致?；谶@一原理的方法可用于細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA、金屬離子等各種分析物的檢測。三聚氰胺(1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺，C3H6N6)是一種常見的化學(xué)物質(zhì)，主要用于生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂。由于其氮含量高(66.6%)、成本低，三聚氰胺常被非法添加入食物中，以在傳統(tǒng)的凱氏或杜馬斯法測定中產(chǎn)生蛋白質(zhì)含量高的假象。長期膳食攝入過量三聚氰胺可導(dǎo)致嬰兒和寵物的腎功能衰竭和死亡。因此，需要建立可以提供現(xiàn)場實(shí)時檢測食品中三聚氰胺的可靠和高靈敏度方法。目前，三聚氰胺的檢測方法主要包括高效液相色譜(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/ MS)、毛細(xì)管電泳法(CE)、化學(xué)發(fā)光法(CL)、紅外光譜法(IR)、拉曼光譜法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、核磁共振法(NMR)等。然而，這些方法由于需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理過程，相對費(fèi)時。此外，這些分析技術(shù)需要昂貴和先進(jìn)的檢測儀器，并由受過專業(yè)訓(xùn)練的人員操作，因此難以廣泛應(yīng)用。近來，I- (2-巰基)-I, 3，5-三嗪-2，4，6_三酮、冠醚、3 -巰基-I-丙烷磺酸鈉、核黃素、半胱胺、單鏈寡核苷酸修飾的金納米粒子均被作為顯色探針用于原料奶和嬰幼兒配方奶粉中三聚氰胺檢測。這些方法大多表現(xiàn)出相當(dāng)高的靈敏度，但金納米粒子復(fù)雜的修飾過程在一定程度上限制了它們的應(yīng)用。在金納米粒子的形成過程中比色法檢測三聚氰胺的技術(shù)也有報道，但非常費(fèi)時。使用未改性的金納米粒子(實(shí)際上為檸檬酸覆蓋的金納米粒子)作為顯色探針已建立了更簡單的三聚氰胺檢測方法，但均靈敏度欠佳。本發(fā)明直接以硼氫化鈉還原法制備的裸納米金作為顯色探針，所得到的裸納米金表面吸附有 AuCI4VAuCI2-離子(文獻(xiàn)A. Kumar, S. Mandal, P. R. Selvakannan, R.Pasricha， A. B. Mandale， and M. Sastry, Investigation into the Interactionbetween Surface-Bound Alkylamines and Gold Nanoparticles, Langmuir 2003， 19，6277-6282)，利用三聚氰胺的環(huán)外氨基與裸納米金表面吸附的AuC147AuC12_離子的靜電作用與共價作用，提供了一種快速、簡便、靈敏的三聚氰胺檢測新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以硼氫化鈉還原法制備的裸納米金為顯色探針，提供了一種快速、簡便、靈敏的三聚氰胺檢測新方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
本發(fā)明所述的一種以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速測定方法，其特征是利用三聚氰胺的環(huán)外氨基與裸納米金表面吸附的AuC147AuC12_離子的作用，導(dǎo)致納米金聚集而表現(xiàn)出溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，來測定三聚氰胺濃度。所述的以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速測定方法，其特征是利用目視觀察溶液顏色特征以判斷三聚氰胺的濃度。所述的以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速測定方法，其特征是利用吸光度比 值A(chǔ)65tZA518以判斷三聚氰胺的濃度。所述的以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速測定方法，其特征是所使用的裸納米金采用硼氫化鈉還原氯金酸的方法制備，將500 UL濃度為0.1 g/L氯金酸水溶液用39. 5毫升的水稀釋，在劇烈攪拌下加入0. 8毫升濃度為0. I g/L的硼氫化鈉水溶液，反應(yīng)溶液顏色從淺黃色變成酒紅色，暗處繼續(xù)快速攪拌而形成裸納米金。所述的以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速測定方法，其特征是將裸納米金溶液分別與含不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液混合，所述的裸納米金溶液與不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液按體積比1:1混合，40-50°C反應(yīng)5-10分鐘，目視觀察顏色特征或測定吸光度比值A(chǔ)65(i/A518，當(dāng)目視觀察顏色特征時，隨著三聚氰胺濃度的增大，納米金的顏色逐漸由酒紅色變?yōu)樽霞t色-紫色-藍(lán)紫色-藍(lán)色，目視觀察的檢測限為0.05 mg/L;當(dāng)測定吸光度比值A(chǔ)65tlA518時，隨著三聚氰胺濃度的增大而吸光度比值a65(i/a518逐漸增大,在5^200 u g/L范圍內(nèi)吸光度比值與三聚氰胺濃度呈線性關(guān)系，檢測限為0.2 yg/L。所述的以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速測定方法，其特征是所使用的裸納米金平均粒徑為8. I nm,最大吸收波長為518 nm。所述的以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速測定方法，其特征是將裸納米金溶液分別與含不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液混合，所述的裸納米金溶液與不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液按體積比I: I混合，其中磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0. 01 mol/L、pH=3. 0，在40°C下反應(yīng)5分鐘，目視觀察顏色特征或測定吸光度比值A(chǔ)65tlA518以判斷三聚氰胺的濃度；裸納米金溶液和含不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液的體積分別為0. 2 mL。本發(fā)明所述的以裸納米金為顯色探針的快速測定奶粉中的三聚氰胺的方法，包括如下步驟1)將裸納米金溶液分別與含不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液混合，所述的裸納米金溶液與不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液按體積比1:1混合，40-50°C反應(yīng)5-10分鐘，目視觀察顏色特征或測定吸光度比值A(chǔ)65(i/A518，當(dāng)測定吸光度比值A(chǔ)65ciA518時，隨著三聚氰胺濃度的增大而吸光度比值A(chǔ)65tlA518逐漸增大，獲得在5 200 u g/L范圍內(nèi)的吸光度比值與三聚氰胺濃度呈線性關(guān)系值；2)奶粉樣品的預(yù)處理在奶粉中加入三氯乙酸和甲醇，振搖后取適量上清液，氮?dú)獯蹈?，加入磷酸鹽緩沖溶液溶解殘渣，得樣品溶液，測定吸光度比值A(chǔ)65tlA518，從5 200 u g/L范圍內(nèi)的吸光度比值與三聚氰胺濃度的線性關(guān)系值中獲得奶粉中的三聚氰胺含量。所述的以裸納米金為顯色探針的快速測定奶粉中的三聚氰胺的方法，其特征是奶粉樣品的預(yù)處理為在2. 0 g奶粉中加入0.2 mL濃度為lwt%三氯乙酸和2.0 mL甲醇，振搖2分鐘后取其I. 0 mL的上清液，氮?dú)獯蹈?，加入I. 0 mL濃度為0. 01 mol/L、pH=3的磷酸鹽緩沖溶液溶解殘渣，得樣品溶液。
所述的以裸納米金為顯色探針的快速測定奶粉中的三聚氰胺的方法，其特征是將裸納米金溶液分別與含不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液混合，所述的裸納米金溶液與不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液按體積比1:1混合，其中磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0. 01 mol/L、pH=3. 0，40°C反應(yīng)5分鐘，目視觀察顏色特征或測定吸光度比值A(chǔ)65(l/A518，獲得在5 200 u g/L范圍內(nèi)的吸光度比值與三聚氰胺濃度呈線性關(guān)系值；裸納米金溶液和含不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液的體積分別為0. 2 mL。具體步驟為
(一)裸納米金的制備
以下過程中使用的所有玻璃器皿均經(jīng)過王水浸泡，并用雙蒸水徹底清洗，晾干。裸納米金的制備首先，500 u L濃度為0. I g/L氯金酸水溶液用39. 5毫升的水稀釋，在劇烈攪拌下加入0. 8毫升濃度為0. I g/L的硼氫化鈉水溶液(加入時間控制在5分鐘內(nèi))，反應(yīng)溶液顏色從淺黃色變成酒紅色，暗處繼續(xù)快速攪拌I小時。所得的裸納米金平均粒徑為8. I ±1.1 nm，最大吸收波長為518 nm, 4 °C保存，能保持至少兩個月的相對穩(wěn)定。(二)三聚氰胺的測定
0.2毫升三聚氰胺樣品溶液中加入0. 2毫升步驟(一)制備的裸納米金溶液，混合后在40°C反應(yīng)5分鐘，目視觀察顏色的變化或測定650 nm與518 nm波長處的吸光度比值(A65tl/A518)。根據(jù)溶液顏色與比色標(biāo)準(zhǔn)系列比較或通過吸光度比值標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。目視觀察的檢測限為50 Ug/L，吸光度比值測定的檢測限為0.2 yg/L。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
(I)本發(fā)明基于三聚氰胺的環(huán)外氨基與裸納米金表面吸附的AuC147AuC12-離子的靜電作用與共價作用，導(dǎo)致納米金聚集，從而表現(xiàn)出溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，通過奶粉樣品簡單的預(yù)處理，可以直接用于三聚氰胺的含量檢測。2)本方法所使用的納米金直接由硼氫化鈉還原氯金酸得到，無需進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，制備過程簡單快速。3)本發(fā)明對樣品的處理要求低，奶粉樣品僅需加入三氯乙酸和甲醇，沉淀蛋白并提取三聚氰胺，上清液除去甲醇用緩沖液溶解后即可測定。4)本發(fā)明的檢測速度快，可以在10分鐘內(nèi)完成實(shí)際奶粉樣品的預(yù)處理和檢測。5)本發(fā)明的檢測靈敏度高，通過肉眼觀察顏色變化的檢測限為50 U g/L,吸光度比值測定的檢測限為0.2 yg/L。


圖I為裸納米金的透射電鏡圖。圖1-1納米金的粒徑分布圖。圖2為裸納米金的紫外吸收光譜圖。圖3為裸納米金與三聚氰胺作用后的紫外吸收光譜圖。圖4為裸納米金與三聚氰胺作用后的透射電鏡圖。 圖5為不同pH條件下裸納米金與三聚氰胺作用后的吸光度比值圖。圖6為不同溫度條件下裸納米金與三聚氰胺作用后的吸光度比值圖。圖7為裸納米金與三聚氰胺作用后的吸光度比值隨時間的變化圖。
圖8為裸納米金與不同濃度三聚氰胺作用后的顏色變化圖，圖中從左到右依次是酒紅色、紫紅色、紫色、藍(lán)紫色及藍(lán)色。圖9為裸納米金與不同濃度三聚氰胺作用后的吸光度比值變化圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :
裸納米金的制備首先，500 UL濃度為0.1 g/L氯金酸水溶液用39. 5毫升的水稀釋，在劇烈攪拌下加入0. 8毫升濃度為0. I g/L的硼氫化鈉水溶液(加入時間控制在5分鐘內(nèi))，反應(yīng)溶液顏色從淺黃色變成酒紅色，暗處繼續(xù)快速攪拌I小時。所得的裸納米金平均粒徑為8. 1±1. I nm (見圖1，圖1-1)波長為518 nm (見圖2)，4 °C保存，裸納米金能保持至少兩個月、相對穩(wěn)定。以上過程中使用的所有玻璃器皿均經(jīng)過王水浸泡，并用雙蒸水徹底清洗，晾干。
實(shí)施例2
三聚氰胺與裸納米金相互作用在0. 2毫升實(shí)施例I制得的裸納米金中加入0. 2毫升含0.1 mg/L三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液(磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.01 mol/L，pH=3)，40攝氏度反應(yīng)5分鐘。裸納米金顏色由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色，最大吸收波長紅移(見圖3)，從透射電鏡圖中可明顯看到聚集的納米金(見圖4)。實(shí)施例3
三聚氰胺與裸納米金相互作用在0. 2毫升實(shí)施例I制得的裸納米金中加入0. 2毫升含有0. I mg/L三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液(磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.01 mol/L,pH=3-12),40攝氏度反應(yīng)5分鐘，測定吸光度比值A(chǔ)65Q/A518。如圖5所示，吸光度比值A(chǔ)65tlA518在pH=3時達(dá)到最大。實(shí)施例4
三聚氰胺與裸納米金相互作用在0. 2毫升實(shí)施例I制得的裸納米金中加入0. 2毫升含有0. I mg/L三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液(磷酸鹽緩沖溶液濃度為0. 01 mol/L, pH=3),20-60攝氏度反應(yīng)5分鐘，測定吸光度比值A(chǔ)65(i/A518。如圖6所示，扣除空白后吸光度比值A(chǔ)65tZA518在40-50 °C時達(dá)到最大。實(shí)施例5
三聚氰胺與裸納米金相互作用在0. 2毫升實(shí)施例I制得的裸納米金中加入0. 2毫升含有0.1 mg/L三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液(磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.01 mol/L,pH=3), 40攝氏度反應(yīng)1-10分鐘，測定吸光度比值A(chǔ)65(i/A518。如圖7所示，吸光度比值A(chǔ)65tlA518在5分鐘后達(dá)到最大。實(shí)施例6
三聚氰胺的測定在0. 2毫升實(shí)施例I制得的裸納米金溶液中加入0. 2毫升含不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液(磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.01 mol/L, pH=3)，混合后在40°C反應(yīng)5分鐘，目視觀察顏色的變化，結(jié)果如圖8所示。當(dāng)不含三聚氰胺時，溶液顯酒紅色；三聚氰胺濃度為50 U g/L時，溶液顯紫紅色；三聚氰胺濃度為80 U g/L時，溶液顯紫色；三聚氰胺濃度為100 u g/L時，溶液顯藍(lán)紫色；三聚氰胺濃度為500 u g/L時，溶液顯藍(lán)色。實(shí)施例I 三聚氰胺的測定在0. 2毫升實(shí)施例I制得的裸納米金溶液中加入0. 2毫升含不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液(磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.01 mol/L, pH=3)，混合后在40°C反應(yīng)5分鐘，測定吸光度比值A(chǔ)65(i/A518。如圖9所示，吸光度比值隨三聚氰胺濃度的增大而增大，在5 200 u g/L范圍內(nèi)吸光度比值與三聚氰胺濃度呈線性關(guān)系，檢測限為0.2 Ug/L0實(shí)施例8:
奶粉中三聚氰胺的測定在2. 0 g奶粉中加入0. 2 mL lwt%三氯乙酸和2. 0 mL甲醇，振搖2分鐘。取1.0 mL上清液，氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL磷酸鹽緩沖溶液(濃度為0.01 mol/L, pH=3)溶解殘渣，得樣品溶液。在0. 2毫升實(shí)施例I制得的裸納米金溶液中加入0. 2毫升上述的樣品溶液，混合后在40°C反應(yīng)5分鐘，目視觀察顏色變化或測定吸光度比值A(chǔ)65tl/A5180結(jié)合實(shí)施例7計算奶粉中三聚氰胺的含量，樣品的測定回收率為97. 69^107%，相對標(biāo) 準(zhǔn)偏差為0. 8-2. 4%。
權(quán)利要求
1.一種以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速測定方法，其特征是利用三聚氰胺的環(huán)外氨基與裸納米金表面吸附的AuC147AuC12-離子的作用，導(dǎo)致納米金聚集而表現(xiàn)出溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，來測定三聚氰胺濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速測定方法，其特征是利用目視觀察溶液顏色特征以判斷三聚氰胺的濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速測定方法，其特征是利用吸光度比值A(chǔ)65tlA518以判斷三聚氰胺的濃度。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速測定方法，其特征是所使用的裸納米金采用硼氫化鈉還原氯金酸的方法制備，將500 UL濃度為0.1 g/L氯金酸水溶液用39. 5毫升的水稀釋，在劇烈攪拌下加入0. 8毫升濃度為0. I g/L的硼氫化鈉水溶液，反應(yīng)溶液顏色從淺黃色變成酒紅色，暗處繼續(xù)快速攪拌而形成裸納米金。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速測定方法，其特征是將裸納米金溶液分別與含不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液混合，所述的裸納米金溶液與不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液按體積比I: I混合，40-50°C反應(yīng)5-10分鐘，目視觀察顏色特征或測定吸光度比值A(chǔ)65(i/A518，當(dāng)目視觀察顏色特征時，隨著三聚氰胺濃度的增大，納米金的顏色逐漸由酒紅色變?yōu)樽霞t色-紫色-藍(lán)紫色-藍(lán)色，目視觀察的檢測限為.0.05 mg/L ;當(dāng)測定吸光度比值A(chǔ)65tlA518時，隨著三聚氰胺濃度的增大而吸光度比值A(chǔ)65tlA518逐漸增大，在5 200 u g/L范圍內(nèi)吸光度比值與三聚氰胺濃度呈線性關(guān)系，檢測限為0.2V- g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速測定方法，其特征是所使用的裸納米金平均粒徑為8. I nm,最大吸收波長為518 nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速測定方法，其特征是將裸納米金溶液分別與含不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液混合，所述的裸納米金溶液與不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液按體積比1:1混合，其中磷酸鹽緩沖溶液的濃度為.0.01 mol/L、pH=3. 0，在40°C下反應(yīng)5分鐘，目視觀察顏色特征或測定吸光度比值A(chǔ)65tlA518以判斷三聚氰胺的濃度；裸納米金溶液和含不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液的體積分別為0. 2 mL。
8.一種以裸納米金為顯色探針的快速測定奶粉中的三聚氰胺的方法，包括如下步驟I)將裸納米金溶液分別與含不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液混合，所述的裸納米金溶液與不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液按體積比1:1混合，40-50°C反應(yīng)5-10分鐘，目視觀察顏色特征或測定吸光度比值A(chǔ)65(i/A518，當(dāng)測定吸光度比值A(chǔ)65tlA518時，隨著三聚氰胺濃度的增大而吸光度比值A(chǔ)65(l/A518逐漸增大，獲得在5 200 u g/L范圍內(nèi)的吸光度比值與三聚氰胺濃度呈線性關(guān)系值；2)奶粉樣品的預(yù)處理在奶粉中加入三氯乙酸和甲醇，振搖后取適量上清液，氮?dú)獯蹈?，加入磷酸鹽緩沖溶液溶解殘渣，得樣品溶液，測定吸光度比值A(chǔ)65tlA518，從5 200 u g/L范圍內(nèi)的吸光度比值與三聚氰胺濃度的線性關(guān)系值中獲得奶粉中的三聚氰胺含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的以裸納米金為顯色探針的快速測定奶粉中的三聚氰胺的方法，其特征是奶粉樣品的預(yù)處理為在2.0 g奶粉中加入0.2 mL濃度為lwt%三氯乙酸和.2.0 mL甲醇，振搖2分鐘后取其1.0 mL的上清液，氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL濃度為0.01 mol/L、pH=3的磷酸鹽緩沖溶液溶解殘渣，得樣品溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的以裸納米金為顯色探針的快速測定奶粉中的三聚氰胺的方法，其特征是將裸納米金溶液分別與含不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液混合，所述的裸納米金溶液與不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液按體積比1:1混合，其中磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0. 01 mol/L、pH=3. 0，40°C反應(yīng)5分鐘，目視觀察顏色特征或測定吸光度比值A(chǔ)65tlA518，獲得在5 200 u g/L范圍內(nèi)的吸光度比值與三聚氰胺濃度呈線性關(guān)系值；裸納米金溶液和含不同濃度三聚氰胺的磷酸鹽緩沖溶液的體積分別為0. 2 mL。
全文摘要
本發(fā)明公開一種以裸納米金為顯色探針的三聚氰胺快速含量測定方法。三聚氰胺的環(huán)外氨基與裸納米金表面吸附的AuCl4-/AuCl2-離子的靜電作用與共價作用，導(dǎo)致納米金聚集，從而表現(xiàn)出溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化。目視觀察的檢測限為0.05mg/L。吸光度比值測定的線性范圍為5~200μg/L，檢測限為0.2μg/L。奶粉樣品可通過簡單的預(yù)處理后，采用該方法測定其中的三聚氰胺含量。
文檔編號G01N21/29GK102706814SQ201210145529
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月11日
發(fā)明者劉愛林, 洪磊, 王勝, 鄧豪華, 陳偉 申請人:福建醫(yī)科大學(xué)