專利名稱：一種磁性夾心納米免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，尤其是涉及一種磁性夾心納米免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
安培免疫分析方法將高靈敏度的電化學(xué)傳感技術(shù)與特異性免疫反應(yīng)結(jié)合起來，通過電流變化監(jiān)測抗原-抗體反應(yīng)，由于其操作簡便、樣品需求量少、無需分離、檢測范圍寬、快速靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，在社會(huì)各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。其測量一般包括兩個(gè)步驟首先通過一個(gè)競爭或夾心式的免疫反應(yīng)(生物辨識組件，如抗體包被膜)將酶標(biāo)抗體結(jié)合在傳感器表面，而后通過一個(gè)酶催化反應(yīng)(如HRP酶對H2O2催化)引起測試體系電信號變 化并進(jìn)行測定。安培免疫傳感器利用利用抗原、抗體作為分子識別原件，把抗原-抗體特異性反應(yīng)過程中產(chǎn)生的信號通過換能器轉(zhuǎn)變成電信號，從而對被測物進(jìn)行定量分析?，F(xiàn)有的安培免疫傳感器的制備過程中，抗體的固定是至關(guān)重要的步驟。傳統(tǒng)固定法法有物理吸附、化學(xué)交聯(lián)以及溶膠-凝膠包埋等。其中采用物理吸附法固定抗體重復(fù)性差，傳感器靈敏度低；采用化學(xué)交聯(lián)和溶膠-凝膠包埋不能控制抗體的取向，并且容易造成抗體失去活性，因此現(xiàn)有的安培免疫傳感器存在檢測速度慢，檢測誤差大及靈敏度低的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測速度快、準(zhǔn)確性和靈敏度高的夾心免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種磁性夾心納米免疫傳感器的制備方法，包括以下步驟
(O二抗探針的制備
a.Fe304/Au膠納米磁珠制備
將IOOmL的O. 01wt%氯金酸(HAuCl4)置于燒杯中加熱，煮沸后迅速加入2. 5mL的lwt%檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸IOmin直至溶液變?yōu)樯罴t色，輕微攪拌冷卻后得到膠體金溶液；將O. 2g的四氧化三鐵加入90mL的50wt%乙醇溶液中超聲分散均勻后，加入300uL的3-巰丙基三乙氧基硅烷(3-MPTES)和500uL氨水，60 V恒溫水浴，通N2保護(hù)，反應(yīng)6h后，用O. ImoI/L鹽酸洗6次，每次至少lh，再用乙醇和去離子水分別洗滌3次，得到硅烷化四氧化三鐵；將上述的得到膠體金溶液與硅烷化四氧化三鐵混合，輕微攪拌至溶液無色透明，外加磁鐵磁性分離后，用去離子水水洗，真空干燥后得到Fe3O4Au膠納米磁珠；
b.二抗探針Fe3O4Au-HRP-Ab2的制備
將Fe304/Au膠納米磁珠加入水中，超聲波震蕩,得到I. Omg/mL的Fe304/Au納米懸浮液，將Fe3O4Au納米懸浮液用O. IM NaCO3調(diào)pH至8. 2，加入體積分別為Fe304/Au納米懸浮液1/5的I. Omg/mL辣根過氧化物酶(HRP)和10 μ g/mL被測物二抗(Ab2), 4°C攪拌24h，外加磁鐵磁性分離后，用去離子水水洗3次，再加入與Fe304/Au納米懸浮液等體積的pH 7. 4含lwt%牛血清蛋白(BSA)的磷酸鹽(PBS)緩沖液分散后，得到二抗探針溶液；
(2)電極修飾及抗體結(jié)合
a.電極修飾
采用Y-Al2O3拋光的玻碳電極(GCE)作為工作電極，依次在去離子水和乙醇中超聲5min,然后將玻碳電極置于O. 08mM氯金酸中，在室溫,-O. 5V的電壓下電沉積金15s,用去離子水洗凈后，得到Au/GCE電極；
b.抗體結(jié)合
將20 μ L的O. 5 mg/mL被測物一抗(Ab1)滴至Au/GCE電極表面，4°C溫育2h后，將未結(jié)合在工作電極表面的被測物一抗用磷酸鹽緩沖液輕微沖洗掉，然后將20 μ L的3wt%牛血清蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)滴至工作電極表面，室溫溫育lh，封閉非特異性活性位點(diǎn)，將工作電極表面用磷酸鹽緩沖液輕微沖洗，洗凈剩余的牛血清蛋白，獲得牛血清蛋白封閉的Abl/Au/GCE電極；
(3)夾心免疫傳感器的組裝
將Abl/Au/GCE電極置于被測物抗原溶液中，室溫下溫育O. 2-lh后，用磷酸鹽緩沖液輕微沖洗，再將Abl/Au/GCE電極置于20 μ L二抗探針溶液中，室溫下溫育O. 2-lh,用磷酸鹽緩沖液輕微沖洗后，即組裝成夾心免疫傳感器。步驟(I)中所述的硅烷化四氧化三鐵的制備過程如下。所述的被測物為三聚氰胺、蘇丹紅、瘦肉精或雌激素。一種磁性夾心納米免疫傳感器的應(yīng)用，所述的磁性夾心納米免疫傳感器可用于測定食物中三聚氰胺、蘇丹紅、瘦肉精或雌激素的濃度。工作原理在工作電極表面修飾納米金再結(jié)合被測物一抗，并在溶液中和被測物抗原溫育結(jié)合，將標(biāo)記有HRP酶的被測物二抗分別與在工作電極表面的被測物一抗一抗原溫育結(jié)合，形成“三明治”復(fù)合物，在外加磁場作用下，包被了“夾心免疫復(fù)合物”的納米磁珠被吸附到電極表面，并加入HRP酶催化底物過氧化脲(包含30%H202的固體，俗稱固體H2O2,比H2O2穩(wěn)定且對抗體/抗原干擾小)，通過傳感器電流輸出信號的大小來測定抗原的濃度。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明一種磁性夾心納米免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用，包括二抗探針Fe3O4Au-HRP-Ab2的制備，電極修飾及一抗結(jié)合，最后將Abl/Au/GCE電極置于被測物抗原溶液中結(jié)合抗原，再與二抗探針結(jié)合即組裝成磁性夾心納米免疫傳感器，優(yōu)點(diǎn)如下
1)本發(fā)明制備過程中的抗體濃度、抗體固定過程參數(shù)均經(jīng)過試驗(yàn)優(yōu)化，使抗體的固定效果好，提高了免疫傳感器的靈敏度；
2)本發(fā)明制備過程中提供的抗體及酶的量有助于傳感器電流輸出信號的放大，進(jìn)而提升傳感器的檢測速度、準(zhǔn)確性與靈敏度，但又將抗體及酶的用量控制在有效范圍內(nèi)，降低制備成本；
3)Fe304、金體膠等均具有良好的生物兼容性，通過靜電引力負(fù)載抗體非常牢固，并可保證其長期保持生物活性，從而保證免疫傳感器具有良好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性；
4)采用外加磁場控制這一宏觀的手段，除了使待測樣品快速從復(fù)雜的檢測背景中分離富集外，還保證了一次性免疫傳感器表面結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而具有穩(wěn)定的檢測性能；5)Fe3O4Au膠納米磁珠具有強(qiáng)大的電信號放大功能，這源于該納米微粒比表面積大、生物相容性好，能夠負(fù)載大量的HRP酶。綜上所述，本發(fā)明一種磁性夾心納米免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用，具有檢測速度快、準(zhǔn)確性和靈敏度高，低成本的優(yōu)點(diǎn)。


圖I為本發(fā)明磁性夾心納米免疫傳感器的制備原理圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。一、具體實(shí)施例
本發(fā)明一種磁性夾心納米免疫傳感器的制備方法，具體包括以下步驟
(O二抗探針的制備
a.Fe304/Au膠納米磁珠制備
al.將IOOmL的O. 01wt%氯金酸(HAuCl4)置于燒杯中加熱，煮沸后迅速加入2. 5mL的lwt%檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸IOmin直至溶液變?yōu)樯罴t色，輕微攪拌冷卻后得到膠體金溶液；a2.將O. 2g的四氧化三鐵加入90mL的50wt%乙醇溶液中超聲分散均勻后，加入300uL的3-巰丙基三乙氧基硅烷(3-MPTES)和500uL氨水，60°C恒溫水浴，通N2保護(hù)，反應(yīng)6h后，用O. lmol/L鹽酸洗6次，每次至少lh，再用乙醇和去離子水分別洗滌3次，得到硅烷化四氧化二鐵。
a3.將上述膠體金溶液與上述硅烷化四氧化三鐵混合，輕微攪拌至溶液無色透明，外加磁鐵磁性分離后，用去離子水水洗，真空干燥后得到Fe3O4Au膠納米磁珠；
b.二抗探針Fe3O4Au-HRP-Ab2的制備
將Fe304/Au膠納米磁珠加入水中，超聲波震蕩，得到I. Omg/mL的Fe304/Au納米懸浮液Fe3O4Au納米懸浮液用O. IM NaCO3調(diào)pH至8. 2，加入體積分別為Fe304/Au納米懸浮液1/5的I. Omg/mL辣根過氧化物酶(HRP)和10 μ g/mL被測物二抗(Ab2), 4°C攪拌24h，外加磁鐵磁性分離后，用去離子水水洗3次，再加入與Fe3O4Au納米懸浮液等體積的pH 7. 4含lwt%牛血清蛋白(BSA)的磷酸鹽(PBS)緩沖液分散后，得到二抗探針溶液；
(2)電極修飾及抗體結(jié)合
a.電極修飾
采用Y -Al2O3拋光(將O. 5g Y -Al2O3溶于水，超聲形成懸浮液，滴涂在麂皮上，將電極面朝下，在麂皮上順時(shí)針磨20圈左右得到Y(jié)-Al2O3拋光的電極)的玻碳電極(GCE)作為工作電極，依次在去離子水和乙醇中超聲5min，然后將玻碳電極置于O. OSmM氯金酸中，在室溫，-O. 5V的電壓下電沉積金15s,用去離子水洗凈后,得到Au/GCE電極；
b.抗體結(jié)合
將20 μ L的O. 5 mg/mL被測物一抗(Ab1)滴至Au/GCE電極表面，4°C溫育2h后，將未結(jié)合在工作電極表面的被測物一抗用磷酸鹽緩沖液輕微沖洗掉，然后將20 μ L的3wt%牛血清蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)滴至工作電極表面，室溫溫育lh，封閉非特異性活性位點(diǎn)，將工作電極表面用磷酸鹽緩沖液輕微沖洗，洗凈剩余的牛血清蛋白，獲得牛血清蛋白封閉的Abl/Au/GCE電極；
(3)磁性夾心納米免疫傳感器的組裝
將Abl/Au/GCE電極置于被測物抗原溶液中，室溫下溫育O. 2-lh后，用磷酸鹽緩沖液輕微沖洗，再將Abl/Au/GCE電極置于20 μ L二抗探針溶液中，室溫下溫育O. 2-lh,用磷酸鹽緩沖液輕微沖洗后，即組裝成夾心免疫傳感器。上述實(shí)施例中被測物可為聚氰胺、蘇丹紅、瘦肉精或雌激素。二、具體應(yīng)用實(shí)施例
一種磁性夾心納米免疫傳感器的應(yīng)用，磁性夾心納米免疫傳感器可用于測定食物中三聚氰胺、蘇丹紅、瘦肉精或雌激素的濃度。以下以瘦肉精為試驗(yàn)對象，采用本發(fā)明的磁性夾心納米免疫傳感器與酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒分別檢測火腿腸中的瘦肉精含量，具體如下
取市場收集的火腿腸樣品4個(gè)，采用粉碎機(jī)高度粉碎后，準(zhǔn)確稱取I. OOOg,加入5. O mL70%甲醇，渦旋振蕩5 min，再用超聲波提取10 min后定性濾紙過濾、定容。提取液經(jīng)稀釋后分別采用本發(fā)明的磁性夾心納米免疫傳感器與酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒進(jìn)行分析。表I火腿腸樣品中的瘦肉精檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種磁性夾心納米免疫傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)二抗探針的制備 a.Fe304/Au膠納米磁珠制備 將IOOmL的0. 01wt%氯金酸置于燒杯中加熱，煮沸后迅速加入2. 5mL的1 丨％檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸IOmin直至溶液變?yōu)樯罴t色，輕微攪拌冷卻后得到膠體金溶液；將0. 2g的四氧化三鐵加入90mL的50wt%乙醇溶液中超聲分散均勻后，加入300uL的3-巰丙基三乙氧基硅烷和500uL氨水，60°C恒溫水浴，通N2保護(hù)，反應(yīng)6h后，用0. lmol/L鹽酸洗6次，每次至少lh，再用乙醇和去離子水分別洗滌3次，得到硅烷化四氧化三鐵；將上述的得到膠體金溶液與硅烷化四氧化三鐵混合，輕微攪拌至溶液無色透明，外加磁鐵磁性分離后，用去離子水水洗，真空干燥后得到Fe3O4Au膠納米磁珠； b.二抗探針Fe3O4Au-HRP-Ab2的制備 將Fe3O4Au膠納米磁珠加入水中，超聲波震蕩,得到I. Omg/mL的Fe3O4Au納米懸浮液，將Fe3O4Au納米懸浮液用0. IM NaCO3調(diào)pH至8. 2，加入體積分別為Fe3O4Au納米懸浮液1/5的I. Omg/mL辣根過氧化物酶和10 u g/mL被測物二抗，4°C攪拌24h,外加磁鐵磁性分離后，用去離子水水洗3次，再加入與Fe3O4Au納米懸浮液等體積的pH 7. 4含lwt%牛血清蛋白的磷酸鹽緩沖液分散后，得到二抗探針溶液； (2)電極修飾及抗體結(jié)合 a.電極修飾 采用Y-Al2O3拋光的玻碳電極作為工作電極,依次在去離子水和乙醇中超聲5min,然后將玻碳電極置于0. 08mM氯金酸中，在室溫，-0. 5V的電壓下電沉積金15s,用去離子水洗凈后，得到Au/GCE電極； b.抗體結(jié)合 將20 ii L的0. 5 mg/mL被測物一抗滴至Au/GCE電極表面，4°C溫育2h后，將未結(jié)合在工作電極表面的被測物一抗用磷酸鹽緩沖液輕微沖洗掉，然后將20 ii L的3wt%牛血清蛋白的磷酸鹽緩沖液滴至工作電極表面，室溫溫育lh，封閉非特異性活性位點(diǎn)，將工作電極表面用磷酸鹽緩沖液輕微沖洗，洗凈剩余的牛血清蛋白，獲得牛血清蛋白封閉的Abl/Au/GCE電極； (3)磁性夾心納米免疫傳感器的組裝 將Abl/Au/GCE電極置于被測物抗原溶液中，室溫下溫育0. 2-lh后，用磷酸鹽緩沖液輕微沖洗，再將Abl/Au/GCE電極置于20 y L二抗探針溶液中，室溫下溫育0. 2-lh,用磷酸鹽緩沖液輕微沖洗后，即組裝成夾心免疫傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種磁性夾心納米免疫傳感器的制備方法，其特征在于所述的被測物為三聚氰胺、蘇丹紅、瘦肉精或雌激素。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的磁性夾心納米免疫傳感器的應(yīng)用，其特征在于所述的磁性夾心納米免疫傳感器可用于測定食物中三聚氰胺、蘇丹紅、瘦肉精或雌激素的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種磁性夾心納米免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用，特點(diǎn)是包括將膠體金溶液與硅烷化四氧化三鐵混合攪拌至溶液無色透明，外加磁鐵磁性分離后，得到Fe3O4/Au膠納米磁珠的步驟；Fe3O4/Au膠納米磁珠的負(fù)載辣根過氧化物酶和被測物二抗得到二抗探針Fe3O4/Au-HRP-Ab2的步驟；玻碳電極電沉積金后再負(fù)載被測物一抗，蛋白封閉非特異性活性位點(diǎn)后得到Ab1/Au/GCE電極的步驟；最后將Ab1/Au/GCE電極負(fù)載抗原，再結(jié)合二抗探針得到夾心免疫傳感器的步驟；該磁性夾心納米免疫傳感器可用于測定食物中三聚氰胺、蘇丹紅、瘦肉精或雌激素的濃度，優(yōu)點(diǎn)是檢測速度快、準(zhǔn)確性和靈敏度高，低成本。
文檔編號G01N33/553GK102707049SQ201210145999
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者干寧, 朱珊珊, 熊萍, 胡富陶 申請人:寧波大學(xué)