專利名稱：軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的試紙條及其制備，具體是一種用于快速檢測(cè)軟骨藻酸的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
記憶缺失性貝毒(ASP)是有毒赤潮硅藻分泌產(chǎn)生的毒素，其主要活性成分軟骨藻酸(Domic Acid, DA)是一種氨基酸類毒素。海洋貝類通過食物鏈的傳遞作用可在體內(nèi)累積DA，有毒藻類也可以直接釋放DA到海水中，人和海洋哺乳動(dòng)物中毒之后，會(huì)干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)生暫時(shí)性失去記憶甚至死亡。雖然目前在我國貝類食品中還未檢測(cè)出軟骨藻酸，但由于水污染的不斷加劇，近年來赤潮頻繁發(fā)生，極有可能伴隨軟骨藻酸的污染。所以在我國開展記憶缺失性貝毒快速檢測(cè)技術(shù)研究具有特殊的意義，這既關(guān)系到消費(fèi)者的健康安全又關(guān)系到我國貝類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前應(yīng)用廣泛、方法完善的檢測(cè)分析軟骨藻酸的方法仍然為高效液相色譜法，但由于其操作繁瑣，設(shè)備昂貴，測(cè)定時(shí)間較長，使其推廣普及受到一定的限制。免疫化學(xué)方法是利用抗體對(duì)抗原的特異性結(jié)合建立的分析方法，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，儀器設(shè)備簡單易操作、樣品前處理相對(duì)簡單等優(yōu)點(diǎn)，適用于一定條件下的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)和大量樣本快速篩查，因而近年來在分析化學(xué)領(lǐng)域受到極大的重視和迅速發(fā)展。經(jīng)過對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，目前已有應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)(ELISA)檢測(cè)軟骨藻酸的報(bào)道，如中國專利申請(qǐng)?zhí)?01010283454. 6，名稱為“軟骨藻酸的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法”的發(fā)明專利，公開了一項(xiàng)運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)軟骨藻酸的技術(shù)。該技術(shù)檢測(cè)全過程需要2-4小時(shí)，可一次檢測(cè)多個(gè)樣品，但由于ELISA是一種很敏感的技術(shù)，分析結(jié)果變異性大，檢測(cè)需要酶標(biāo)儀等儀器，需要有經(jīng)驗(yàn)的操作人員，實(shí)現(xiàn)真正的現(xiàn)場(chǎng)操作有困難。膠體金免疫層析法是20世紀(jì)80年代初期發(fā)展起來的以膠體金為標(biāo)記物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型、簡便、快速的檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)時(shí)間可縮短到3-15min，不需要操作儀器，更加適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，用膠體金標(biāo)記抗體，通過競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，快速檢測(cè)貝類中的軟骨藻酸，使得本發(fā)明滿足檢測(cè)方法簡單易操作，快速，不需要任何其他儀器設(shè)備，非專業(yè)人員可現(xiàn)場(chǎng)使用，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條，包括樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊和支撐板，所述樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊粘附在所述支撐板上并依次相互部分重疊；所述膠體金結(jié)合墊上含有抗軟骨藻酸單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，所述硝酸纖維素膜上分別包被有軟骨藻酸-牛血清蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測(cè)線和羊抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線。
優(yōu)選地，所述的檢測(cè)線和質(zhì)控線相隔3mm 7mm。優(yōu)選地，所述的軟骨藻酸單克隆抗體為抗軟骨藻酸雜交瘤細(xì)胞株2B1 No. 9-2-2分泌的單克隆抗體。優(yōu)選地，所述支撐板為PVC塑料板。本發(fā)明還涉及一種前述的軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟步驟一、制備軟骨藻酸單克隆抗體；步驟二、將膠體金與步驟一制得的抗軟骨藻酸單克隆抗體按照I : (0. 01 0. 02)的體積比混勻，經(jīng)純化和濃縮后產(chǎn)生抗軟骨藻酸單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物； 步驟三、將步驟二制得的抗軟骨藻酸單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物噴涂在膠體金結(jié)合墊上，將軟骨藻酸-牛血清蛋白偶聯(lián)物噴點(diǎn)在硝酸纖維素膜上構(gòu)成檢測(cè)線，再將羊抗鼠IgG噴點(diǎn)在硝酸纖維素膜上構(gòu)成質(zhì)控線，最后將樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊粘附在所述支撐板上并依次相互部分重疊，干燥，即得。優(yōu)選地，所述步驟一具體為采用抗軟骨藻酸雜交瘤細(xì)胞株2B1 No. 9-2-2分泌得到軟骨藻酸單克隆抗體。優(yōu)選地，所述步驟二中的膠體金是采用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備而得的。優(yōu)選地，所述步驟三中的軟骨藻酸-牛血清蛋白偶聯(lián)物是采用碳二亞胺法、活潑酯法或混合酸酐法將軟骨藻酸小分子半抗原與牛血清蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的。本發(fā)明選用軟骨藻酸-牛血清蛋白偶聯(lián)物作為檢測(cè)線，羊抗鼠IgG作為質(zhì)控線，抗軟骨藻酸單克隆抗體為膠體金標(biāo)記的抗體，利用競(jìng)爭(zhēng)法來檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有軟骨藻酸。通過待測(cè)樣品中的軟骨藻酸和包被于NC膜上的軟骨藻酸-牛血清蛋白偶聯(lián)物共同競(jìng)爭(zhēng)抗軟骨藻酸單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，在檢測(cè)線上出現(xiàn)顏色深淺不同的紅色條帶或不出現(xiàn)條帶，質(zhì)控線處出現(xiàn)紅色條帶。若待測(cè)樣品試紙條檢測(cè)線無色，同時(shí)質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陽性樣品，即待測(cè)樣品中軟骨藻酸的濃度高于20ng/mL ;若待測(cè)樣品試紙條檢測(cè)線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陰性樣品，即待測(cè)樣品中軟骨藻酸的濃度小于20ng/mL ;如果質(zhì)控線上沒有出現(xiàn)紅色條帶,則該試紙條失效。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果I)檢測(cè)軟骨藻酸的免疫膠體金試紙條，具有特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高，(可達(dá)20ng/mL)，檢測(cè)快速(只需10 15min)，前處理簡單等優(yōu)點(diǎn)；2)檢測(cè)試紙條不需要任何特殊儀器、設(shè)備，檢測(cè)成本低；3)試紙條操作簡單易掌握，無需專業(yè)人員操作；4)試紙條儲(chǔ)存方便，室溫下干燥保存可保存6個(gè)月。


圖I為本發(fā)明檢測(cè)試紙條結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明檢測(cè)試紙條結(jié)果判定示意圖；圖中1樣品墊、2膠體金結(jié)合墊、3硝酸纖維素膜(NC膜)、4吸收墊、5試紙條專用PVC塑料板、6檢測(cè)線、7質(zhì)控線、A為陰性標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果，B為陰性樣品結(jié)果，C、D為陽性樣品結(jié)果，E、F為試紙條失效。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I、軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條的制備方法I. I軟骨藻酸人工抗原的合成 取Img軟骨藻酸(DA)溶于少量溶劑(二甲基亞砜水=1 9)中，加入0. 8mgN_羥基琥拍酰亞胺(20mg/mL,臨用現(xiàn)配)、1. 2mg水溶性碳二亞胺(10mg/mL,臨用現(xiàn)配)及少量0. lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，混合均勻后置于25°C培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)2h。隨后轉(zhuǎn)移至4°C冰箱內(nèi)，放置過夜。第二天加入2mg鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，補(bǔ)加少量
0.lmol/L磷酸鹽緩沖液，混合均勻后置于25°C培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)3h。將混合液置入超濾管內(nèi)管，4500rpm離心15min后，適量稀釋，分裝后保存于_20°C。I. 2抗軟骨藻酸單克隆抗體的制備與純化以DA-KLH為免疫原，免疫5只6 8周齡的雌性BALB/c小鼠。首次免疫用200 u IDA-KLH與等體積完全弗式佐劑乳化，腹腔注射小鼠，第2、4、6周取同量DA-KLH與等體積不完全弗式佐劑充分乳化，腹腔注射。取尾血測(cè)定小鼠血清效價(jià)，待效價(jià)大于要求值后，取同量DA-KLH的PBS溶液腹腔注射加強(qiáng)免疫，3天后選擇I只血清效價(jià)最高的免疫小鼠，取其脾細(xì)胞與生長狀態(tài)良好的小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后的雜交瘤細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，在20%血清的HAT培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，10天后換液并加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2天，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清。將抗陽性細(xì)胞孔的雜交瘤細(xì)胞孔，按照有限稀釋法進(jìn)行克隆，亞克隆，直到所有細(xì)胞孔的上清均為陽性為止，篩選可穩(wěn)定分泌抗軟骨藻酸單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2B1 No. 9-2-2。采用體內(nèi)誘生法，用0. 8ml/只劑量的滅菌石蠟油腹腔注射致敏8周齡的雌性BALB/c小鼠，I周后注射雜交瘤細(xì)胞。視小鼠腹部膨大情況于14天后收集腹水。腹水的純化采用Protein G柱親和層析純化,再用0. 01mol/L的磷酸鹽(PBS)緩沖液(pH7. 4)透析4-5天，得到純化的軟骨藻酸單克隆抗體，取出用紫外分光光度計(jì)測(cè)得蛋白濃度為0. 675mg/ml，小瓶分裝，-20°C保存。I. 3抗軟骨藻酸單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備即包被膠體金結(jié)合墊采用檸檬酸三鈉還原法制備20nm膠體金，取0. 01%的氯金酸溶液100ml，放入經(jīng)酸洗并硅化的潔凈錐形瓶中，攪拌狀態(tài)下，加熱至沸騰，一次性加入1%檸檬酸三鈉1ml，繼續(xù)攪拌加熱15min，直至溶液呈透亮的紅色，室溫冷卻，4°C保存?zhèn)溆谩Ｈ?0nm膠體金于干凈的燒杯中，用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值為8. 5,加入抗軟骨藻酸單克隆抗體，使其在膠體金中終濃度為15iig/mL (此時(shí),加入的膠體金和抗軟骨藻酸單克隆抗體的體積比為I : (0.01 0.02))，繼續(xù)攪拌Ih ;電磁攪拌下加入10%的BSA至終濃度為1%，以穩(wěn)定膠體金顆粒的殘留表位，再攪拌30min，4°C條件下隔夜靜置12h。采用低溫超速離心法純化金標(biāo)單抗,將金標(biāo)抗體用2000r/min, 4°C離心20min,棄去沉淀；將上清以13000r/min離心60min,棄去上清；將沉淀以原體積的金標(biāo)稀釋液(含0.2%PEG20000, 0. 5%BSA, 0. 02%NaN3 的 0. Olmol/L pH7. 4 的 PBS 溶液)溶解，重復(fù)離心 2 3次，沉淀溶于原體積1/10的金標(biāo)稀釋液中，4°C保存?zhèn)溆谩?biāo)記好的抗體溶液I :4稀釋后按照60 u L/cm2的量均勻涂布在4mmX 5mm的玻璃纖維上，37 °C真空干燥Ih后取出，作為膠體金結(jié)合墊。I. 4偶聯(lián)抗原包被NC膜將NC膜裁成4mmX2. 5 cm大小，取I U L羊抗鼠IgG (lmg/mL)和I y L包被抗原DA-BSA (0.8mg/ml)噴涂在NC膜上，分別作為質(zhì)控線和檢測(cè)線，兩線相隔0.5cm (可為
0.3cm 0. 7cm中任意值)，37°C真空干燥Ih ;干燥后完全浸泡于含1%BSA的pH7. 4的PBS溶液中，以封閉NC膜的殘余吸附能力，封閉2h ;然后用pH7. 4的0. 01mol/L的PBS溶液洗滌兩次，每次5min，37度真空干燥后后備用。I. 5試紙條組裝裁取4mmX 3cm的吸水紙作吸收墊。4mmX 2. 8cm的玻璃纖維作樣品墊。將樣品墊、包被有抗軟骨藻酸單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的膠體金結(jié)合墊、包被有軟骨藻酸-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原作為檢測(cè)線和包被有羊抗鼠IgG作為質(zhì)控線的NC膜、吸收墊首尾相連，按順序粘貼在4mmX 8cm的PVC塑料板上(圖I )，組裝結(jié)束后，與干燥劑一起裝入鋁箔袋，密封儲(chǔ)存。實(shí)施例2、軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條使用方法2. I樣品前處理取生鮮帶殼或冷凍后在室溫下半解凍的樣品，用刀切開閉殼肌取出貝肉，將可食部分與中腸腺分離，放在網(wǎng)孔細(xì)小的金屬網(wǎng)上浙水5min。取5g樣品，加入IOmL勻漿液(50%甲醇水溶液)，勻衆(zhòng)后，鏇潤振蕩Imin,超聲提取5min ;4000rpm離心20min。移出上清液至25mL容量瓶，剩余殘?jiān)偌尤雱驖{液5mL，重復(fù)提取兩次，上清液均移至25mL容量瓶內(nèi)，蒸懼水定容。0. 22iim濾膜過濾。2. 2用實(shí)施例I制得的試紙條進(jìn)行檢測(cè)陽性標(biāo)準(zhǔn)品(20ng/mL的軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)溶液)、陰性標(biāo)準(zhǔn)品(0. 01mol/L pH7. 4的PBS緩沖液)及待測(cè)樣品各取80 u I加入到微孔板中，將膠體金試紙條插入其中，15min后觀
察結(jié)果。2. 3結(jié)果判定如圖2所示，若待測(cè)樣品試紙條檢測(cè)線顏比陰性空白試紙條檢測(cè)線顏色淺，同時(shí)質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，則判斷為陽性樣品，即樣品中軟骨藻酸的濃度小于20ng/mL;若待測(cè)樣品試紙條檢測(cè)線無顏色，同時(shí)質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，則判斷為陽性樣品，即樣品中軟骨藻酸的的濃度大于或等于20ng/mL;若待測(cè)樣品試紙條檢測(cè)線顏色與陰性空白試紙條檢測(cè)線顏色一致，同時(shí)質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，則判斷為陰性樣品，即樣品中不含軟骨藻酸；若質(zhì)控線上無顏色，則該試紙條無效。實(shí)施例3、軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條靈敏度測(cè)驗(yàn)按照實(shí)施例2所述實(shí)驗(yàn)方法，用實(shí)施例I的檢測(cè)試紙條分別檢測(cè)10 U g/mL, I U g/mL, lOOng/mL, 80ng/mL, 40ng/mL, 20ng/mL, 15ng/mL, lOng/mL, 5ng/mL, Ong/mL, 10 個(gè)濃度梯度的軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)4次，通過肉眼觀察檢測(cè)線，檢測(cè)結(jié)果如表I所示。發(fā)現(xiàn)軟骨藻酸濃度為0ng/ml (陰性對(duì)照)時(shí)，檢測(cè)線出現(xiàn)很深的紅色條帶，隨著濃度的增加，檢測(cè)線的顏色逐漸減弱，當(dāng)DA標(biāo)準(zhǔn)品濃度增至20ng/ml時(shí)，檢測(cè)線無紅色條帶，當(dāng)DA標(biāo)準(zhǔn)品濃度繼續(xù)增至IOii g/ml時(shí)，檢測(cè)線都無紅色條帶，而質(zhì)控線均出現(xiàn)紅色條帶。由此判斷，該試紙條檢測(cè)軟骨藻酸的檢測(cè)靈敏度為20ng/ml (對(duì)于貝類食品相當(dāng)于8 u g/g貝肉)，可以滿足國際規(guī)定的20ii g/g的安全限值。表I軟骨藻酸免疫層析試紙條靈敏度檢測(cè)結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條，包括樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊和支撐板，其特征在于，所述樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊粘附在所述支撐板上并依次相互部分重疊；所述膠體金結(jié)合墊上含有抗軟骨藻酸單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，所述硝酸纖維素膜上分別包被有軟骨藻酸-牛血清蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測(cè)線和羊抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述的檢測(cè)線和質(zhì)控線相隔3mm 7mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條，其特征是，所述的軟骨藻酸單克隆抗體為抗軟骨藻酸雜交瘤細(xì)胞株2B1 No. 9-2-2分泌的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述支撐板為PVC塑料板。
5.一種如權(quán)利要求I所述的軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟一、制備軟骨藻酸單克隆抗體； 步驟ニ、將膠體金與步驟ー制得的抗軟骨藻酸單克隆抗體按照I : (O. Ol O. 02)的體積比混勻，經(jīng)純化和濃縮后產(chǎn)生抗軟骨藻酸單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物； 步驟三、將步驟ニ制得的抗軟骨藻酸單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物噴涂在膠體金結(jié)合墊上，將軟骨藻酸-牛血清蛋白偶聯(lián)物噴點(diǎn)在硝酸纖維素膜上構(gòu)成檢測(cè)線，再將羊抗鼠IgG噴點(diǎn)在硝酸纖維素膜上構(gòu)成質(zhì)控線，最后將樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊粘附在所述支撐板上并依次相互部分重疊，干燥，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其特征在干，所述步驟一具體為采用抗軟骨藻酸雜交瘤細(xì)胞株2B1 No. 9-2-2分泌得到軟骨藻酸單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其特征在干，所述步驟ニ中的膠體金是采用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備而得的。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其特征在干，所述步驟三中的軟骨藻酸-牛血清蛋白偶聯(lián)物是采用碳ニ亞胺法、活潑酯法或混合酸酐法將軟骨藻酸小分子半抗原與牛血清蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條及其制備方法；所述試紙條包括粘附在支撐板上并依次相互部分重疊的樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊；所述膠體金結(jié)合墊上含有抗軟骨藻酸單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，所述硝酸纖維素膜上分別包被有軟骨藻酸-牛血清蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測(cè)線和羊抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線。本發(fā)明的軟骨藻酸膠體金免疫層析試紙條，具有特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)快速,前處理簡單等優(yōu)點(diǎn)；檢測(cè)時(shí)不需要任何特殊儀器、設(shè)備，檢測(cè)成本低。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102680693SQ20121015787
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月18日
發(fā)明者余朝毅, 唐慶麗, 席磊, 皮帥帥, 程芳, 程金平, 高利利 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)