專利名稱：一種無氰化測(cè)定血紅蛋白濃度及白細(xì)胞分群計(jì)數(shù)的溶血素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定血樣中總血紅蛋白濃度及同時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)或白細(xì)胞分群計(jì)數(shù)的組合物，具體涉及一種無氰化測(cè)定血紅蛋白濃度及白細(xì)胞分群計(jì)數(shù)的溶血素。
背景技術(shù)：
總血紅蛋白的測(cè)定是血液攜氧量的重要指標(biāo)。迄今為止已經(jīng)在正常人和血液病患者中發(fā)現(xiàn)了 300多種以上的血紅蛋白，這些異常導(dǎo)致血紅蛋白濃度的改變或者血紅蛋白攜氧能力的改變，從而出現(xiàn)廉狀細(xì)胞性貧血、地中海貧血和血紅蛋白異常等疾病。測(cè)定血樣中血紅蛋白的濃度是相關(guān)疾病診斷的十分重要的依據(jù)，對(duì)監(jiān)控血紅蛋白疾病的治療以及其他可能影響血紅蛋白水平改變的疾病的治療也是十分重要的。在用人工或自動(dòng)測(cè)定血樣中總血紅蛋白濃度及用于同時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)或白細(xì)胞亞群的分類計(jì)數(shù)的分析實(shí) 驗(yàn)中，盡管通過標(biāo)準(zhǔn)的氰化正鐵血紅蛋白方法及其改良的自動(dòng)方法形成的色原穩(wěn)定可靠，然而，由于使用氰化鉀，試劑廢液會(huì)引起很大的環(huán)境污染。在過去十多年中，人們付出巨大的努力以開發(fā)不使用氰化物的自動(dòng)血紅蛋白測(cè)定方法。Oshiix)等[臨床生物化學(xué)(Clin.Biochem.)，1583 (1982)]說明了用于血紅蛋白分析所使用的試劑，該試劑包含十二烷基硫酸鈉(SLS)和Triton X-100。SLS用于溶解紅細(xì)胞，并被認(rèn)為進(jìn)一步產(chǎn)生SLS-血紅蛋白復(fù)合物，它在539nm處具有最大吸光度并在572nm處有肩峰。SLS法現(xiàn)為世界公認(rèn)的一種比較穩(wěn)妥可靠的無氰化物血紅蛋白測(cè)定方法。然而，使用Oshiro方法不能進(jìn)行血紅蛋白測(cè)定的同時(shí)分析白細(xì)胞。因?yàn)楦邼舛鹊氖榛蛩徕c將白細(xì)胞破壞程度過高。美國(guó)專利號(hào)5，242，832 (屬sakata)公開了用于對(duì)血樣進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)并測(cè)定血紅蛋白濃度的無氰物溶血素。該溶血素包含至少一種表面活性劑包括陽離子表面活性劑和兩性表面活性劑以及至少一種選自下列化合物的血紅蛋白穩(wěn)定劑Tiron、8-輕喹啉、聯(lián)卩比唳、1,10-臨菲咯啉、酚類化合物、雙酚等等。Sakata說明了白細(xì)胞分級(jí)分離或三個(gè)組(包括淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的聚集體以及中性粒細(xì)胞的聚集體)。只有通過使用至少兩種適合的表面活性劑和嚴(yán)格控制表面活性劑的濃度才能完成。Sakata也說明了溶血?jiǎng)﹥?yōu)選的PH值是5. 0-8. O。如果PH值是3. 0或更小，對(duì)白細(xì)胞的破壞增加，這樣增加白細(xì)胞的測(cè)定困難，如果PH值是9.0或者更大，血紅蛋白的穩(wěn)定性隨時(shí)間的延長(zhǎng)而變差。而且，其中的8-羥喹啉水溶性差，長(zhǎng)期使用會(huì)殘留在儀器管道中，造成儀器部件的污染，給使用帶來不便；PCT/US95/02897 (Kim)公開了用于測(cè)定全血樣中的血紅蛋白無氰化方法和試齊U。該試劑包括配體(選自下列化合物咪唑及其衍生物、N-羥乙酰胺、H-羥胺、吡啶、惡唑、噻唑、吡唑、嘧啶、嘌呤、喹啉和異喹啉)以及一種強(qiáng)紅細(xì)胞溶解能力的表面活性劑(選自十二烷基二甲基胺氧化物和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)。該分析方法快速，不到10秒。然而，該試劑僅在極端堿性PH值11-14條件下操作。此外，Kim沒有說明計(jì)數(shù)白細(xì)胞或分別白細(xì)胞亞群的能力。上述的無氰化物血紅蛋白測(cè)定中，沒有一種可以在血紅蛋白測(cè)定的同時(shí)提供單核細(xì)胞和整個(gè)粒細(xì)胞的數(shù)量；然而，這兩個(gè)參數(shù)都是用于各種疾病臨床診斷的有價(jià)值的工具。這就需要更多用途的無氰化物血紅蛋白測(cè)定方法和多功能試劑以在單個(gè)自動(dòng)步驟中可以完成若干診斷分析。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?8801947屬于庫(kù)爾特公司，公開了一種無氰化物試劑組合物，其中含有選自下列化合物的血紅蛋白配體三唑及其衍生物、四唑及其衍生物、4，6- 二羥基_1，3，5三嗪-2-羧酸的堿金屬鹽、蜜胺、苯胺-2-磺酸、喹哪啶酸、
2-氨基-I，3，4-噻二唑、三嗪及其衍生物、尿唑、DL-2-哌啶酸、異煙酰胺、鄰氨基苯甲晴、6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶、腺嘌呤、3-(2-噻吩基)丙烯酸、苯甲酸和苯甲酸的堿金屬和銨鹽、吡嗪及其衍生物的有機(jī)配體的水溶液。還有選自季銨鹽、吡啶嗡鹽、有機(jī)磷酸酯和烷基磺酸的溶血性表面活性劑以溶解紅細(xì)胞釋放血紅蛋白。然而該方法仍然采用了一定毒性或致癌的化合物，對(duì)環(huán)境依然有一定的污染。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?3140211. 9 (專利權(quán)人深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)公開了一種無氰化物溶血素，提到了同時(shí)使用陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑共三種表面活性劑，不僅繁瑣；而且還有一個(gè)眾所周知的嚴(yán)重缺陷，即陽離子表面活性劑和陰離子表面活性劑在水溶液中混合容易形成沉淀，專利中也提到要嚴(yán)格控制這兩種表面活性劑的量，否則容易形成沉淀，在實(shí)際應(yīng)用 中很不方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提出一種無氰化測(cè)定血紅蛋白濃度及白細(xì)胞分群計(jì)數(shù)的溶血素，以解決背景技術(shù)存在沒有無氰化血紅蛋白及白細(xì)胞分群測(cè)定試劑可以在血紅蛋白測(cè)定的同時(shí)提供單核細(xì)胞和整個(gè)粒細(xì)胞的數(shù)量，以及采用了一定毒性或致癌的化合物做測(cè)定試劑，對(duì)環(huán)境依然有一定的污染，以及陽離子表面活性劑和陰離子表面活性劑在水溶液中混合容易形成沉淀，在實(shí)際應(yīng)用中很不方便的問題。解決該技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種無氰化測(cè)定血紅蛋白濃度及白細(xì)胞分群計(jì)數(shù)的溶血素，為均一的水溶液，其特征在于基本組成為a)至少一種溶解紅細(xì)胞的陽離子表面活性劑，選自季銨鹽、吡啶嗡鹽、氧化胺型季銨鹽，
權(quán)利要求
1.一種無氰化測(cè)定血紅蛋白濃度及白細(xì)胞分群計(jì)數(shù)的溶血素，為均一的水溶液，其特征在于基本組成為 a)至少一種溶解紅細(xì)胞的陽離子表面活性劑，選自季銨鹽、吡啶嗡鹽、氧化胺型季銨鹽，
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種無氰化測(cè)定血紅蛋白濃度及白細(xì)胞分群計(jì)數(shù)的溶血素，其特征在于a)至少一種溶解紅細(xì)胞的陽離子表面活性劑，選自季銨鹽、吡啶嗡鹽、氧化胺型季銨鹽，濃度為3-90g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種無氰化測(cè)定血紅蛋白濃度及白細(xì)胞分群計(jì)數(shù)的溶血素，其特征在于b)至少一種酸化劑，濃度為0. l-5g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種無氰化測(cè)定血紅蛋白濃度及白細(xì)胞分群計(jì)數(shù)的溶血素，其特征在于c)至少一種能夠與釋放的血紅蛋白結(jié)合的配位體,該配位體為40%的卩比唳硫酮鈉溶液，濃度為0. 1-1. 0ml/Lo
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種無氰化測(cè)定血紅蛋白濃度及白細(xì)胞分群計(jì)數(shù)的溶血素，其特征在于試劑的優(yōu)選方案是溶解紅細(xì)胞的陽離子表面活性劑的濃度為16-60g/L，酸化劑的濃度為0. l-3g/L，40%的配位體溶液的濃度為0. 4-lml/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或5所述的一種無氰化測(cè)定血紅蛋白濃度及白細(xì)胞分群計(jì)數(shù)的溶血素，其特征在于試劑的更優(yōu)選方案是陽離子表面活性劑十二烷基三甲基氯化銨的濃度為26g/L，酸化劑丁二酸的濃度為0. lg/L，40%的配位體吡啶硫酮鈉溶液的濃度為I. 0ml/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或5所述的一種無氰化測(cè)定血紅蛋白濃度及白細(xì)胞分群計(jì)數(shù)的溶血素，其特征在于酸化劑選取丁二酸、鹽酸、草酸、甲酸、檸檬酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種無氰化測(cè)定血紅蛋白濃度及白細(xì)胞分群計(jì)數(shù)的溶血素，其特征在于酸化劑選取丁二酸、鹽酸、草酸、甲酸、檸檬酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無氰化測(cè)定血紅蛋白濃度及白細(xì)胞分群計(jì)數(shù)的溶血素。所要解決的問題就是背景技術(shù)存在的沒有無氰化血紅蛋白及白細(xì)胞分群測(cè)定試劑可以在血紅蛋白測(cè)定的同時(shí)提供單核細(xì)胞和整個(gè)粒細(xì)胞的數(shù)量，以及采用了一定毒性或致癌的化合物做測(cè)定試劑，對(duì)環(huán)境依然有一定的污染，以及陽離子表面活性劑和陰離子表面活性劑在水溶液中混合容易形成沉淀的問題。解決該問題所采用技術(shù)方案要點(diǎn)是試劑包括a)至少一種足夠量的溶解紅細(xì)胞的陽離子表面活性劑，b)至少一種足夠量的酸化劑，c)至少一種足夠量的能夠與釋放的血紅蛋白結(jié)合的配位體吡啶硫酮鈉，可應(yīng)用于測(cè)試血紅蛋白及白細(xì)胞分群的試劑，具有無毒、無污染、測(cè)試準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102662067SQ20121016214
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月20日
發(fā)明者張國(guó)聯(lián), 郝慶霞 申請(qǐng)人:煙臺(tái)卓越生物技術(shù)有限責(zé)任公司