專利名稱：一種用于快速檢測(cè)類風(fēng)濕因子的膠體金試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
，本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種醫(yī)用檢測(cè)耗材，具體涉及一種用于快速檢測(cè)類風(fēng)濕因子的膠體金試紙條。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以慢性、對(duì)稱性、進(jìn)行性多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)，至今病因仍不甚明了的自身免疫性疾病，初步調(diào)查我國該病患病率約為0. 32% 0. 36%(唐福林.應(yīng)規(guī)范類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷與治療，中華醫(yī)學(xué)雜志，2004，84(12)，971-973)。一般認(rèn)為它于感染、遺傳、內(nèi)分泌代謝、營養(yǎng)有關(guān)。寒冷、潮濕是其發(fā)病的主要誘因。RF是最先在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中發(fā)現(xiàn)的，是一種抗變性IgG的自身抗體。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者的陽性率為70%-80%陽性，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)陽性率為30%，其他結(jié)締 組織并，如干燥綜合征，硬皮病，多發(fā)性肌炎，以及慢性肝炎，老年人等也可檢出一定的陽性率(吳建民.實(shí)用醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)參考值和異常結(jié)果分析，人民衛(wèi)生出版社，184)。1987年美國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(huì)(ARA)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)(I)晨僵關(guān)節(jié)及其周圍僵硬感至少持續(xù)lh。病程彡6周；(2)3個(gè)或3個(gè)區(qū)域以上關(guān)節(jié)部位的關(guān)節(jié)炎醫(yī)生觀察到下列14個(gè)區(qū)域(左側(cè)或右側(cè)的近端指間關(guān)節(jié)、掌指關(guān)節(jié)、腕、肘、膝、踝及跖趾關(guān)節(jié))中累及3個(gè)，且同時(shí)軟組織腫脹或積液(不是單純骨隆起)，病程> 6周；(3)手關(guān)節(jié)炎腕、掌指或近端指間關(guān)節(jié)炎中，至少有一個(gè)關(guān)節(jié)腫脹，病程> 6周；(4)對(duì)稱性關(guān)節(jié)炎兩側(cè)關(guān)節(jié)同時(shí)受累(雙側(cè)近端指間關(guān)節(jié)、掌指關(guān)節(jié)及跖趾關(guān)節(jié)受累時(shí)，不一定絕對(duì)對(duì)稱。病程>6周；(5)類風(fēng)濕結(jié)節(jié)醫(yī)生觀察到在骨突部位，伸肌表面或關(guān)節(jié)周圍有皮下結(jié)節(jié)；(6)類風(fēng)濕因子陽性任何檢測(cè)方法證明血清類風(fēng)濕因子含量異常，而該方法在正常人群中的陽性率小于5% ；(7)放射學(xué)改變?cè)谑趾屯蟮暮笄拔幌嗌嫌械湫偷念愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎放射學(xué)改變必須包括骨質(zhì)侵蝕或受累關(guān)節(jié)及其鄰近部位有明確的骨質(zhì)脫鈣。以上7條滿足4條或4條以上，并排除其他關(guān)節(jié)炎即可診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì).類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診治指南，現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)2004，16.)。其中RF作為RA分類標(biāo)準(zhǔn)中唯一的血清學(xué)指標(biāo)，因此對(duì)于RA的診斷起著重要的臨床診斷指導(dǎo)作用。類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor; RF),一種抗變性IgG的自身抗體，通常為IgM類，多出現(xiàn)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清、關(guān)節(jié)液或滑膜液。類風(fēng)濕因子(rheumatoidfactor, RF)可分為IgM、IgA、IgG、IgD、IgE五型，是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清中針對(duì)IgG FC片段上抗原表位的一類自身抗體，類風(fēng)濕因子陽性患者較多伴有關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，如皮下結(jié)節(jié)及血管炎等。RA病人和約50%的健康人體內(nèi)都存在有產(chǎn)生RF的B細(xì)胞克隆，在變性IgG (或與抗原結(jié)合的IgG)或EB病毒直接作用下，可大量合成RF。健康人產(chǎn)生RF的細(xì)胞克隆較少，且單核細(xì)胞分泌的可溶性因子可抑制RF的產(chǎn)生，故一般不易測(cè)出。類風(fēng)濕因子是由于感染因子(細(xì)菌、病毒等)引起體內(nèi)產(chǎn)生的以變性IgG (—種抗體)為抗原的一種抗體，故又稱抗抗體。常見的類風(fēng)濕因子有IgM型、IgG型、IgA型和IgE型。人體內(nèi)普遍存在著類風(fēng)濕因子，并起著一定的生理作用。近年來對(duì)IgM型類風(fēng)濕因子的生物作用已有所了解，這些生物作用包括1、調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫反應(yīng)；2、激活補(bǔ)體，加快清除微生物感染；3、清除免疫復(fù)合物使機(jī)體免受循環(huán)復(fù)合物的損傷。只有類風(fēng)濕因子的量超過一定的滴度時(shí)稱類風(fēng)濕因子陽性。由于IgM型類風(fēng)濕因子是類風(fēng)濕因子的主要類型，而且具有高凝集的特點(diǎn)，易于沉淀，故臨床上主要測(cè)定IgM型類風(fēng)濕因子，測(cè)定方法為乳膠凝集法和酶聯(lián)免疫吸附法。類風(fēng)濕因子陽性除見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎外，還可見于病毒感染如感冒、腫瘤、慢性感染如肺結(jié)核、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎以及其它自身免疫性疾病。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，IgM類RF的含量與RA的活動(dòng)性無密切關(guān)系；IgG類RF的含量與RA患者的滑膜炎、血管炎和關(guān)節(jié)外癥狀密切相關(guān)。Ig A類RF見于RA、硬皮病、Felty綜合征和SLE，是RA臨床活動(dòng)的一個(gè)指標(biāo)。IgD類RF研究甚少。IgE類RF除RA患者外，也見于Felty綜合征和青年型RA。在RA患者，高效價(jià)的RF存在并伴有嚴(yán)重的關(guān)節(jié)功能受限時(shí)，常提示預(yù)后不良。在非類風(fēng)濕患者中，RF的陽性率隨年齡的增加而增加，但這些人以后發(fā)生RA者極少。老年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是指發(fā)病年齡> 60歲的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者，約占RA的1/3，隨著社會(huì)老齡化，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)(程秀峰譚魁麟譚軍.老年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者自身抗體檢測(cè)及其臨床意義，臨床內(nèi)科雜志，545-546.)。類風(fēng)濕因子(RF)是臨床檢驗(yàn)的常規(guī)項(xiàng)目，目前對(duì)于類風(fēng)濕因子(RF)的檢測(cè)主要是RF體外診斷，而RF體外診斷主要技術(shù)有，乳膠凝集法、酶免疫法和免疫比濁法(陳琳潔，李志軍，范曉云，段京明.抗RA33抗體在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎鑒別診斷中的意義及一年隨訪研究，實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2005，21 (11),1141-1143;李敬揚(yáng)，周倫祥，易晴松，蔡細(xì)英，羅筱文，董李湘.抗核周因子、抗角蛋白抗體與類風(fēng)濕因子聯(lián)合檢測(cè)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的意義，中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2006，16 (13)，1996-1999;雷小妹，何培根.抗角蛋白抗體及類風(fēng)濕因子對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷價(jià)值，臨床內(nèi)科雜志，2003，20 (12),668.)。免疫比濁法，采用實(shí)驗(yàn)儀器進(jìn)行檢測(cè)，保證了檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性，但檢測(cè)過程中需維持反應(yīng)管中抗體蛋白始終過剩，浪費(fèi)樣品，同時(shí)易受到脂血的影響，并且其操作復(fù)雜，耗時(shí)。目前，檢測(cè)類風(fēng)濕因子較普遍采用的方法是乳膠凝集定性試驗(yàn)，因其經(jīng)濟(jì)實(shí)用和操作簡單而被廣泛應(yīng)用，但其靈敏度低，特異性差，假陽性率高，受環(huán)境及個(gè)體差異等影響困素較多，已遠(yuǎn)不能滿足臨床診斷、治療及預(yù)后的需要。RF乳膠凝集玻片檢測(cè)法(上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司)。因?yàn)轭愶L(fēng)濕因子(RF)是一種主要發(fā)生于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的抗人變性IgG自身抗體，可與IgG的Fe段結(jié)合并呈現(xiàn)特異性凝集反應(yīng)。該方法檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性不高。申請(qǐng)?zhí)枮?00910194749. 3的發(fā)明專利，提出一種半定量檢測(cè)類風(fēng)濕因子方法，該方法操作復(fù)雜，并且要求專業(yè)技術(shù)人員。申請(qǐng)?zhí)枮?00910049923. 5的發(fā)明專利提出一種IgG型類風(fēng)濕因子酶免疫檢測(cè)方法；申請(qǐng)?zhí)枮?00910222271.0的發(fā)明專利，提出一種人變性IgG和類風(fēng)濕因子吸附裝置及相關(guān)的人血清中IgM抗體檢測(cè)方法，此兩種方法檢測(cè)類風(fēng)濕因子前、后都需要做必要的儀器清洗及保養(yǎng)工作，并且要求專業(yè)技術(shù)人員來操作。免疫膠體金技術(shù)(Immunogold labelling techique)是上世紀(jì)80年代繼突光素、放射性同位素和酶三大標(biāo)記技術(shù)后發(fā)展起來的固相標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)。該技術(shù)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，形成肉眼可見的紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中?？焖僭\斷試紙條是20世紀(jì)90年代以來在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新型層析材料基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新型體外診斷技術(shù)，近年來發(fā)展迅速，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用。該技術(shù)主要是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在硝酸纖維膜上，膠體金標(biāo)記試劑吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待測(cè)樣品加到試紙條一端的樣品墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動(dòng)至固定的抗原或抗體區(qū)域時(shí)，待測(cè)物金標(biāo)試劑復(fù)合物與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，膠體金標(biāo)記聚集在檢測(cè)帶上，可通過目測(cè)得到直觀的顯色結(jié)果。而游離的標(biāo)記物則越過檢測(cè)帶，從而達(dá)到與檢測(cè)物自動(dòng)分離的目的。目前膠體金技術(shù)與雙抗原夾心法、抗體捕獲法聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)是非常成熟的技術(shù)，但是應(yīng)用到類風(fēng)濕因子(RF)的檢測(cè)中，卻分別出現(xiàn)了靈敏性低和檢測(cè)類型窄的現(xiàn)象，單獨(dú)使用雙抗原夾心法的免疫膠體金技術(shù)，其靈敏性低，不能達(dá)到臨床的常見參考值，而單獨(dú)使用抗體捕獲法的免疫膠體金技術(shù)，其靈敏性較高，能達(dá)到臨床的參考值，但這種方法只能單一檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)類風(fēng)濕因子(RF)的IgM型，而不能檢測(cè)類風(fēng)濕因子(RF)的其它類型。雙抗原夾心法(double antigen sandwich method)一種借助酶免疫或放射免疫法檢測(cè)抗體的技術(shù)。即以已知抗原包被固相載體，相繼加入待測(cè)抗體和酶標(biāo)記的抗原，從而 形成三明治樣雙抗原夾心?？贵w捕獲法(亦稱反向間接法)ELISA，主要用于血清中某種抗體亞型成分的測(cè)定。其原理是將抗原固化在基質(zhì)上，加入含抗體的雜交瘤培養(yǎng)上清，洗去未結(jié)合的抗體，結(jié)合于抗原上的抗體可由標(biāo)記有熒光素、放射性核素或一些酶的兔抗小鼠免疫球蛋白抗體識(shí)別。目前，能同時(shí)保證檢測(cè)的靈敏度和特異性，并且使用方便，操作簡單，節(jié)省資源的用于快速檢測(cè)類風(fēng)濕因子的產(chǎn)品鮮有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述領(lǐng)域的需求和空白，本發(fā)明旨在提供一種用于快速檢測(cè)類風(fēng)濕因子的膠體金試紙條，本發(fā)明試紙條在檢測(cè)時(shí)抗體捕獲法和雙抗原夾心法原理并用，并且結(jié)合免疫膠體金技術(shù)快速檢測(cè)人血清、血漿或全血中的類風(fēng)濕因子，用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的檢測(cè)，兼具靈敏性和特異性；操作簡單，使用方便，拿來即用，不需要本領(lǐng)域的專業(yè)人員，能夠滿足不同層次人員的需要，容易普及到基層社區(qū)醫(yī)院，對(duì)老年人體檢類風(fēng)濕的篩查，以符號(hào)顯示結(jié)果，擺脫了對(duì)設(shè)備、儀器、人員及貯存和運(yùn)輸環(huán)境的特殊要求，可廣泛用于類風(fēng)濕因子(RF)的定性檢測(cè)，并且具有快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確、特異的特點(diǎn)，同時(shí)所需樣本少，節(jié)省資源。一種用于快速檢測(cè)類風(fēng)濕因子的膠體金試紙條，在高度方向上包括基板支撐層、反應(yīng)試劑載體吸附層，所述反應(yīng)試劑載體吸附層固定在所述基板支撐層上；從沾液端到手持端依次設(shè)有樣品纖維墊，金標(biāo)纖維墊，纖維素藥膜，手持端吸水材料墊，在所述金標(biāo)纖維墊和手柄段吸水材料墊上覆蓋有保護(hù)膜層，在所述纖維素藥膜上印制有條狀的檢測(cè)線T線和條狀的對(duì)照線C線，所述檢測(cè)線T線和所述對(duì)照線C線均呈與所述膠體金試紙條長度方向垂直的條狀，其特征在于，在所述金標(biāo)纖維墊上包被有膠體金標(biāo)記的人變性IgG ;在所述T線上包被有抗U鏈IgM和人變性IgG，所述金標(biāo)纖維墊上的膠體金標(biāo)記的人變性IgG、T線上的抗U鏈IgM和人變性IgG的單位面積包被量比值為0. 133 0. 889 :5 :1。包被于所述金標(biāo)纖維墊上的膠體金標(biāo)記的人變性IgG和包被于所述T線上的抗鏈IgM、人變性IgG的單位面積包被量比值為1:15:3。包被于所述金標(biāo)纖維墊上的膠體金標(biāo)記的人變性IgG和包被于所述T線上的抗ii鏈IgM、人變性IgG的單位面積包被量分別為1600ng / cm2, 24000ng / cm2,4800ng / cm2。所述用于快速檢測(cè)類風(fēng)濕因子的膠體金試紙條，其特征在于，在樣品纖維墊上對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜層上表面標(biāo)有與所述檢測(cè)線T平行的可視的MAX標(biāo)志線。所述樣品纖維墊采用玻璃纖維棉，所述吸水材料墊采用粗纖維吸水紙，所述金標(biāo)纖維墊采用吸附金標(biāo)蛋白的玻璃纖維棉。所述保護(hù)膜層為膠帶。所述基板支撐層為不吸水的塑料基板。
還包括外殼，所述外殼具有中空位，所述中空位與所述反應(yīng)試劑載體吸附層及所述基板支撐層形成的簡易膠體金試紙條的形狀大小相匹配，用于裝載所述反應(yīng)試劑載體吸附層，所述外殼上表面對(duì)應(yīng)于樣品纖維層及纖維素藥膜的位置分別設(shè)有加樣窗和視窗。一種用于快速檢測(cè)類風(fēng)濕因子的試劑盒，其特征在于包括上述任一膠體金試紙條和樣品稀釋器皿。技術(shù)效果單獨(dú)采用抗體捕獲法和雙抗原夾心法檢測(cè)類風(fēng)濕因子的難度在于靈敏度和特異性不能兩全，為了既保證靈敏度，又提高特異性，本發(fā)明采用抗體捕獲法和雙抗原夾心法原理并用的方式制備了快速檢測(cè)血清/血漿/全血樣本中的類風(fēng)濕因子(RF)的試紙條，在試紙條的檢測(cè)線上包被有抗U鏈IgM和人變性IgG混合液，在膠體金墊上包被膠體金標(biāo)記的人變性IgG，并通過調(diào)整金標(biāo)纖維墊上的膠體金標(biāo)記的人變性IgG和所述T線上的抗ii鏈IgM、人變性IgG的單位面積包被量的比值在特定范圍內(nèi)，從而保證了試紙條的檢測(cè)靈敏性和特異性。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，見表I和表3，在該比值范圍內(nèi)，特異性和靈敏性都高于單一檢測(cè)原理的試紙條。檢測(cè)時(shí)在硝酸纖維膜上包被抗U鏈IgM、人變性IgG和抗人IgG。若待檢樣本中RF含量高于其檢測(cè)閾值時(shí)，膠體金標(biāo)記的人變性IgG在層析過程中與樣本中的RF結(jié)合，形成“金標(biāo)人變性IgG-RF復(fù)合物”繼續(xù)爬行，在檢測(cè)線上與固相的人變性IgG作用，形成“金標(biāo)人變性IgG-RF-人變性IgG”抗原抗體復(fù)合物沉積，即出現(xiàn)一條紅色條帶(檢測(cè)線，T線)，或者在檢測(cè)線上與固相的抗U鏈IgM作用，形成“金標(biāo)人變性IgG-RF-抗ii鏈IgM”抗原抗體復(fù)合物沉積，即出現(xiàn)一條紅色條帶(檢測(cè)線，T線)；無論RF是否存在于樣本中，一條紅色條帶都會(huì)出現(xiàn)在對(duì)照區(qū)(C)內(nèi)。對(duì)照區(qū)(C)內(nèi)所顯現(xiàn)的紅色條帶是判定是否有足夠樣本，層析過程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明解決了特異性差和靈敏度弱的問題?？贵w捕獲法的不足之處是特異性差，但其靈敏度高；雙抗原夾心法的不足之處是靈敏度弱，但其特異性高。兩者的結(jié)合解決了抗體捕獲法特異性差的問題，以及雙抗原夾心法靈敏度弱的問題，其準(zhǔn)確率高于單獨(dú)使用抗體捕獲法和雙抗原夾心法。同時(shí)，與單獨(dú)采用兩種方法的測(cè)試條相比，二者合二為一節(jié)省了原材料材料，降低了成本，提高了使用的效率。本發(fā)明一種用于快速檢測(cè)類風(fēng)濕因子的膠體金試紙條，其獨(dú)特之處在于，在所述金標(biāo)纖維墊上包被有膠體金標(biāo)記的人變性IgG ;在所述T線上包被有抗ii鏈IgM和人變性IgG，所述金標(biāo)纖維墊上的膠體金標(biāo)記的人變性IgG、T線上的抗U鏈IgM和人變性IgG的單位面積包被量比值為0. 133 0. 889 5 :1。根據(jù)表I數(shù)據(jù)列表來看，在這個(gè)單位面積的包被量比值范圍內(nèi)，膠體金試紙條都是合格的，而在這個(gè)范圍之外，則是不合格的。包被于所述金標(biāo)纖維墊上的膠體金標(biāo)記的人變性IgG和包被于所述T線上的抗U鏈IgM、人變性IgG的單位面積包被量比值為1:15:3，同時(shí)考慮在放大生產(chǎn)過程中的誤差因素，以及成本因素，這個(gè)單位面積的包被量比值為較佳比值。
包被于所述金標(biāo)纖維墊上的膠體金標(biāo)記的人變性IgG和包被于所述T線上的抗U鏈IgM、人變性IgG的單位面積包被量分別為1600ng / cm2, 24000ng / cm2,4800ng / cm2。同時(shí)考慮在放大生產(chǎn)過程中的誤差因素，以及成本因素，這個(gè)單位面積的包被量為最佳包被量。本發(fā)明，優(yōu)選在樣品纖維墊上對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜層上表面標(biāo)有與所述檢測(cè)線T平行的可視的MAX標(biāo)志線。用于提醒操作人員，操作時(shí)待測(cè)液不要超過標(biāo)志線，以免引起假陽性。本發(fā)明，優(yōu)選所述樣品纖維墊采用玻璃纖維棉，所述吸水材料墊采用粗纖維吸水紙，所述纖維素藥膜采用硝酸纖維素膜，所述金標(biāo)纖維墊采用吸附金標(biāo)蛋白的玻璃纖維棉。這些材料配合使用，其吸水性及毛吸作用配合良好，保證本發(fā)明檢測(cè)試紙條的檢測(cè)速度和準(zhǔn)確性。本發(fā)明，優(yōu)選保護(hù)膜層為膠帶，使試紙條免受污染，成本低且效果好。本發(fā)明，優(yōu)選基板支撐層為不吸水的塑料基板，不吸水的材料，避免支撐材料吸收待測(cè)液從而影響水平方向的遷移。本發(fā)明，優(yōu)選樣品纖維墊的上表面及所述金標(biāo)纖維墊的下表面設(shè)一層無紡布。用于適量吸取液體，起到一定的緩沖作用。本發(fā)明，優(yōu)選還包括外殼，所述外殼具有中空位，所述中空位與所述反應(yīng)試劑載體吸附層及所述基板支撐層形成的簡易膠體金試紙條的形狀大小相匹配，用于裝載所述反應(yīng)試劑載體吸附層，所述外殼上表面對(duì)應(yīng)于樣品纖維墊及纖維素藥膜的位置分別設(shè)有加樣窗和視窗。便于攜帶和保存。本發(fā)明試紙條采用抗體捕獲法和雙抗原夾心法并用的原理，并且結(jié)合免疫膠體金技術(shù)快速檢測(cè)人血清、血漿或全血中的類風(fēng)濕因子，用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的檢測(cè)；本發(fā)明試紙條操作簡單，使用方便，拿來即用，不需要本領(lǐng)域的專業(yè)人員，能夠滿足不同層次人員的需要，并且保證檢測(cè)的靈敏性、準(zhǔn)確性和高效率。


圖I本發(fā)明試紙條的俯視圖；圖2本發(fā)明試紙條的縱向剖面圖其中1-手持端，2-對(duì)照線C線，3-檢測(cè)線T線，4-MAX標(biāo)志線，5-沾液端，6-纖維素藥膜層，7-樣品纖維層，8-手持端吸水材料層，9-金標(biāo)纖維層，10-大無紡布，11-小無紡布，12-手持端膠帶，13-箭頭膠帶，14-基板支撐層。
具體實(shí)施例方式提供下述實(shí)施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，并不局限于所述最佳實(shí)施方式，不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成限制，任何人在本發(fā)明的啟示下或是將本發(fā)明與其他現(xiàn)有技術(shù)的特征進(jìn)行組合而得出的任何與本發(fā)明相同或相近似的產(chǎn)品，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例I.根據(jù)膠體金檢測(cè)的原理，將本發(fā)明的膠體金試紙條的粘液端浸入待測(cè)液中，或者在粘液端的樣品纖維層滴加待測(cè)液，待測(cè)液中的物質(zhì)在纖維層材料的毛細(xì)作用下沿著試紙條從沾樣端向手持端移動(dòng)，待測(cè)液中的靶標(biāo)物質(zhì)經(jīng)過金標(biāo)纖維層時(shí)與膠體金標(biāo)記蛋白粘附在一起并向吸水紙墊方向移動(dòng)，待測(cè)液中的靶標(biāo)物質(zhì)經(jīng)過檢測(cè)線時(shí)，靶標(biāo)物質(zhì)與檢測(cè)線上包被的物質(zhì)由于特異性結(jié)合導(dǎo)致膠體金在檢測(cè)線上聚集，使檢測(cè)線顯色。其余膠體金標(biāo)記蛋白繼續(xù)遷移，到對(duì)照線時(shí)，由于采用的膠體金標(biāo)記蛋白與對(duì)照線上包被的蛋白能特異結(jié)合，因此，膠體金在對(duì)照線上聚集使對(duì)照線顯色。即檢測(cè)線和對(duì)照線都顯色，表明待測(cè)液為陽性；如果，待測(cè)液中不存在靶標(biāo)物質(zhì)，那么，待測(cè)液遷移至檢測(cè)線時(shí)，待測(cè)液中沒有與檢測(cè)線上包被的物質(zhì)能夠結(jié)合的成分，從而導(dǎo)致膠體金不會(huì)聚集于檢測(cè)線，因此，檢測(cè)線不會(huì)顯色，但是對(duì)照線處仍然顯色。即僅僅有對(duì)照線顯色，表明待測(cè)液為陰性。 本發(fā)明試紙條，在高度方向上包括基板支撐層14、反應(yīng)試劑載體吸附層，所述反應(yīng)試劑載體吸附層固定在所述基板支撐層14上；所述反應(yīng)試劑載體吸附層從沾液端5到手持端I依次為樣品纖維墊7，金標(biāo)纖維墊9，纖維素藥膜6，手持端吸水材料墊8 ;在所述金標(biāo)纖維墊9和手持端吸水材料墊8上覆蓋有保護(hù)膜層。在所述纖維素藥膜上印制有條狀的檢測(cè)線T-3和條狀的對(duì)照線C-2，所述檢測(cè)線檢測(cè)線T-3和對(duì)照線C-2均呈與所述膠體金試紙條長度方向垂直的條狀。其特征在于，在所述金標(biāo)纖維墊上包被有膠體金標(biāo)記的人變性IgG ;在所述T線上包被有抗U鏈IgM和人變性IgG，所述金標(biāo)纖維墊上的膠體金標(biāo)記的人變性IgG、T線上的抗U鏈IgM和人變性IgG的單位面積包被量比值為0. 133 0. 889 :5 :1。根據(jù)表I數(shù)據(jù)列表來看，在這個(gè)單位面積的包被量比值范圍內(nèi)，膠體金試紙條都是合格的，而在這個(gè)范圍之外，則是不合格的。包被于所述金標(biāo)纖維墊上的膠體金標(biāo)記的人變性IgG和包被于所述T線上的抗U鏈IgM、人變性IgG的單位面積包被量比值為1:15:3，同時(shí)考慮在放大生產(chǎn)過程中的誤差因素，以及成本因素，這個(gè)單位面積的包被量比值為較佳比值。包被于所述金標(biāo)纖維墊上的膠體金標(biāo)記的人變性IgG和包被于所述T線上的抗U鏈IgM、人變性IgG的單位面積包被量分別為1600ng / cm2, 24000ng / cm2,4800ng / cm2。同時(shí)考慮在放大生產(chǎn)過程中的誤差因素，以及成本因素，這個(gè)單位面積的包被量為最佳包被量。本發(fā)明，優(yōu)選在樣品纖維墊I上對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜層上表面標(biāo)有與所述檢測(cè)線T 3平行的可視的MAX標(biāo)志線4。用于提醒操作人員，操作時(shí)待測(cè)液不要超過標(biāo)志線4，以免引起假陽性。本發(fā)明，優(yōu)選所述樣品纖維墊7采用玻璃纖維棉，所述吸水材料墊8采用粗纖維吸水紙，所述纖維素藥膜6采用硝酸纖維素膜，所述金標(biāo)纖維墊9采用吸附金標(biāo)蛋白的玻璃纖維棉。這些材料配合使用，其吸水性及毛吸作用配合良好，保證本發(fā)明檢測(cè)試紙條在檢測(cè)速度和準(zhǔn)確性。本發(fā)明，優(yōu)選保護(hù)膜層為膠帶，使試紙條免受污染，成本低且效果好。
本發(fā)明，優(yōu)選基板支撐層14為不吸水的塑料基板，不吸水的材料，避免支撐材料吸收待測(cè)液從而影響水平方向的遷移。本發(fā)明，優(yōu)選樣品纖維墊7的上表面及所述金標(biāo)纖維墊9的下表面設(shè)一層無紡布10，11。用于適量、快速吸取液體，起到一定的緩沖作用。本發(fā)明，優(yōu)選還包括外殼，所述外殼具有中空位，所述中空位與所述反應(yīng)試劑載體吸附層及所述基板支撐層形成的簡易膠體金試紙條的形狀大小相匹配，用于裝載所述反應(yīng)試劑載體吸附層，所述外殼上表面對(duì)應(yīng)于樣品纖維墊及纖維素藥膜的位置分別設(shè)有加樣窗和視窗。便于攜帶和保存。本發(fā)明試紙條的難度在于靈敏度和特異性不能兩全，為了既保證靈敏度，又提高特異性，本發(fā)明技術(shù)方案采用抗體捕獲法和雙抗原夾心法并用的原理，解決了特異性差和靈敏度弱的問題。同時(shí)，與單獨(dú)采用兩種方法的測(cè)試條相比，二者合二為一節(jié)省了原材料材料，降低了成本，提高了使用的效率。
本發(fā)明試紙條采用抗體捕獲法和雙抗原夾心法并用的原理，并且結(jié)合免疫膠體金技術(shù)快速檢測(cè)血清、血漿、全血樣本中的類風(fēng)濕因子(RF)。在硝酸纖維膜上包被人變性IgG和抗U IgM0即在包被T線時(shí)同時(shí)包被有抗ii IgM和人變性IgG，若單獨(dú)用抗體捕獲法就會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)類型窄出現(xiàn)導(dǎo)致的假陰性，單獨(dú)用雙抗原夾心法就會(huì)出現(xiàn)靈敏度弱而導(dǎo)致的低值標(biāo)本不能檢出，考慮類風(fēng)濕因子是一種以人變性IgG為靶抗原而產(chǎn)生的自身抗體，抗體本身又主要為IgM型，于是用抗ii IgM抗體和人變性IgG同時(shí)捕捉自身抗體RF，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)品的高準(zhǔn)確性，以及靈敏度和特異性的結(jié)合。另外在加樣方法上我們采用1000倍稀釋的方法，克服了產(chǎn)品特異性差和HOOK效應(yīng)的現(xiàn)象。實(shí)施例2.試紙條的制備性能驗(yàn)證生物活性原料抗U鏈IgM，人變性lgG，抗人IgG的購買來源均為加拿大ArtronBioResearch Inc.進(jìn)口試劑牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白(casein)購自Sigma。硝酸纖維素膜德國賽多利斯(Sartorius)公司試紙條的制備程序如下步驟I.抗]i鏈IgM與人變性IgG的混合如下配制抗ii鏈IgM與人變性IgG的混合液，用20mM PBS對(duì)抗y鏈IgM與人變性IgG進(jìn)行稀釋，配制成特定濃度從而使包被濃度如表I所示。步驟2.膠體金標(biāo)記的人變性IgG的制備取40nm的膠體金溶液，按終濃度16 u I/ml加入0. 2M K2CO3,加入人變性IgG制備成特定濃度從而使包被濃度如表I所示，放置室溫反應(yīng)18分鐘,然后按終濃度20 u I/ml加A 20%BSA的溶液，用于飽和游離的膠體金。IOOOOrpm離心30分鐘，除去上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。用1/10體積的0. 5M硼酸溶液(含l%Tween、5%蔗糖、1%水解BSA、1%水解酪蛋白、0. 1%PVA)復(fù)溶沉淀的膠體金標(biāo)記原液。工作溶液采用上述0. 5m硼酸溶液稀釋，濃度為原液的15%。步驟3.試劑的包被硝酸纖維膜上包被抗U鏈IgM、人變性IgG和抗人IgG的方法將抗ii鏈IgM與人變性IgG的混合液和抗人IgG用包被機(jī)分別包被于T線和C線，C、T線之間的間距為4. Omm，C、T線寬度為0. 8mm，包被速度為40mm/s。干燥時(shí)間為6小時(shí)，溫度為30°C，濕度彡35%。金標(biāo)纖維層的標(biāo)記將膠體金標(biāo)記的人變性IgG溶液鋪于30*30cm玻璃纖維墊上，加液量使玻璃纖維墊單位面積上的人變性IgG如表I所示，干燥時(shí)間為6小時(shí)，溫度為30°C，濕度< 35%。表I為膠體金標(biāo)人變性IgG /抗ii鏈IgM /人變性IgG的單位面積的包被量，其比例為 0. 133 0. 889 :5 :1。表I如下

權(quán)利要求
1.一種用于快速檢測(cè)類風(fēng)濕因子的膠體金試紙條，在高度方向上包括基板支撐層、反應(yīng)試劑載體吸附層，所述反應(yīng)試劑載體吸附層固定在所述基板支撐層上；從沾液端到手持端依次設(shè)有樣品纖維墊，金標(biāo)纖維墊，纖維素藥膜，手持端吸水材料墊，在所述金標(biāo)纖維墊和手柄段吸水材料墊上覆蓋有保護(hù)膜層，在所述纖維素藥膜上印制有條狀的檢測(cè)線T線和條狀的對(duì)照線C線，所述檢測(cè)線T線和所述對(duì)照線C線均呈與所述膠體金試紙條長度方向垂直的條狀，其特征在于，在所述金標(biāo)纖維墊上包被有膠體金標(biāo)記的人變性IgG ;在所述T線上包被有抗U鏈IgM和人變性IgG，所述金標(biāo)纖維墊上的膠體金標(biāo)記的人變性IgG、T線上的抗U鏈IgM和人變性IgG的單位面積包被量比值為0. 133 0. 889 :5 :1。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述試紙條，其特征在于，包被于所述金標(biāo)纖維墊上的膠體金標(biāo)記的人變性IgG和包被于所述T線上的抗U鏈IgM、人變性IgG的單位面積包被量比值為1:15:3。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述試紙條，其特征在于，包被于所述金標(biāo)纖維墊上的膠體金標(biāo)記的人變性IgG和包被于所述T線上的抗U鏈IgM、人變性IgG的單位面積包被量分別為1600ng / cm2,24000ng / cm2,4800ng / cm2。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述試紙條，其特征在于，在樣品纖維墊上對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜層上表面標(biāo)有與所述檢測(cè)線T平行的可視的MAX標(biāo)志線。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述試紙條，其特征在于，所述樣品纖維墊采用玻璃纖維棉，所述吸水材料墊采用粗纖維吸水紙，所述金標(biāo)纖維墊采用吸附金標(biāo)蛋白的玻璃纖維棉。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述試紙條，其特征在于，所述保護(hù)膜層為膠帶。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述試紙條，所述基板支撐層為不吸水的塑料基板。
8.權(quán)利要求1-7任一所述試紙條，還包括外殼，所述外殼具有中空位，所述中空位與所述反應(yīng)試劑載體吸附墊及所述基板支撐層形成的簡易膠體金試紙條的形狀大小相匹配，用于裝載所述反應(yīng)試劑載體吸附層，所述外殼上表面對(duì)應(yīng)于樣品纖維墊及纖維素藥膜的位置分別設(shè)有加樣窗和視窗。
9.一種用于快速檢測(cè)類風(fēng)濕因子的試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求I 6任一所述的膠體金試紙條和樣品稀釋器皿。
全文摘要
本發(fā)明“一種用于快速檢測(cè)類風(fēng)濕因子的膠體金試紙條”，屬于醫(yī)用檢測(cè)耗材。其特征在于，在所述金標(biāo)纖維墊上包被有膠體金標(biāo)記的人變性IgG；在所述T線上包被有抗μ鏈IgM和人變性IgG，所述金標(biāo)纖維墊上的膠體金標(biāo)記的人變性IgG、T線上的抗μ鏈IgM和人變性IgG的單位面積包被量比值為0.133～0.88951。本發(fā)明試紙條在檢測(cè)時(shí)抗體捕獲法和雙抗原夾心法原理并用，兼具靈敏性與特異性，并且結(jié)合免疫膠體金技術(shù)快速檢測(cè)人血清、血漿或全血中的類風(fēng)濕因子，具有簡便、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102707050SQ201210165040
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月24日
發(fā)明者孫茜, 聶麗芳 申請(qǐng)人:藍(lán)十字生物藥業(yè)(北京)有限公司