專利名稱：串聯(lián)液相色譜-質(zhì)譜法測定食品中剛果紅的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及應(yīng)用串聯(lián)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對各種食品中非法添加的剛果紅染料進行準確測定的方法及其應(yīng)用。二.
背景技術(shù)：
剛果紅(Congo Red, Direct Red 28，CAS 573-58-0)又名直接大紅28，屬于聯(lián)苯胺為母體的紅色偶氮染料，一般用于臨床診斷，指示劑、生物染色劑及化學(xué)指示劑等。它對各種動物機體為可疑致癌物與誘變劑，并對胎兒性腺發(fā)育產(chǎn)生不良影響，同時，在特定條件下，剛果紅可降解釋放出聯(lián)苯胺類物質(zhì)。由于對人體健康的危害很大，在很多國家已經(jīng)成為禁用偶氮染料。 近年來食品安全事件頻繁發(fā)生，其中添加非食用甚至有毒物質(zhì)的情況尤為突出，基于價格便宜、著色強、穩(wěn)定性強等特點，非食用工業(yè)染料被應(yīng)用到食品加工中。不法食品加工商為使肉制品色澤鮮艷，從外觀上吸引顧客，隨意使用有毒的工業(yè)染料代替食用色素加以使用，對廣大群眾的身體健康造成極大的危害。本機構(gòu)在食品風(fēng)險監(jiān)測過程中發(fā)現(xiàn)肉制品中被非法添加一種紅色未知染料，經(jīng)確證為致癌偶氮染料剛果紅。剛果紅不是食品添加劑，而是一種有毒的非食用物質(zhì)，在食品中添加非食用物質(zhì)是嚴重威脅人民群眾飲食安全的犯罪行為，同時也是阻礙我國食品行業(yè)健康發(fā)展、破壞社會主義市場經(jīng)濟秩序的違法犯罪行為。因此有必要建立一種靈敏、準確、快速的肉制品中剛果紅的檢測方法。國內(nèi)外有關(guān)食品中剛果紅染料的測定未見報道，侍芳采用液相色譜單級質(zhì)譜(LC-MS)測定了環(huán)境水樣中剛果紅的含量，該方法由于樣品基質(zhì)及儀器設(shè)備的限制，不適用于食品中剛果紅的準確測定。由于食品基質(zhì)比較復(fù)雜，加上食品中非法添加的工業(yè)染料多為水溶性鹽類，前處理多采用固相萃取(SPE )、液液萃取(LLE )以及基質(zhì)固相分散(MSPD )等技術(shù)去除樣品中的大量雜質(zhì)，而后采用液相色譜及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對其進行測定。三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是采用串聯(lián)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法準確測定食品中剛果紅的方法及應(yīng)用。首先，如何從食品中快速有效的將非法添加的剛果紅染料快速提取出來，同時最大限度減低基質(zhì)干擾。經(jīng)過大量的試驗篩選，本發(fā)明最終選擇乙腈-正己烷按體積比1:1混合的溶劑作為樣品的提取溶劑，考慮到乙腈會溶解一部分正己烷，因此乙腈要預(yù)先用正己烷溶液飽和，這樣定量計算時不至于產(chǎn)生誤差。剛果紅非常容易溶解于乙腈等強極性溶齊U，而幾乎不溶于正己燒，且正己烷是一種油脂的良好溶劑，可以有效的去除油脂。樣品經(jīng)混合溶劑提取后，剛果紅富集于乙腈層中，棄去的正己烷中含有大量的低極性雜質(zhì)，這樣簡單快速的前處理步驟是非常有效的。其次，如何選擇最優(yōu)的色譜及質(zhì)譜條件，使得在盡可能短的時間內(nèi)對樣品中的剛果紅染料進行分析，并產(chǎn)生最高的靈敏度。本發(fā)明在對剛果紅染料性質(zhì)進行詳細了解的前提下，不斷優(yōu)化儀器條件，最終選定的液相條件為采用10 mmol甲酸銨水溶液-乙腈為流動相梯度洗脫，質(zhì)譜采集m/z 651. 0/152. 0及m/z 325. 0/416. 0離子信號，分別作為定量離子對與定性離子對進行分析，使用外標法定量。本發(fā)明的技術(shù)方案包括1.質(zhì)譜參數(shù)的選擇與優(yōu)化
在實驗前采用系統(tǒng)的autotune功能對質(zhì)譜系統(tǒng)各參數(shù)進行快速優(yōu)化。剛果紅分子量為696. 69，選擇掃描范圍m/Z100-1000，斷開色譜柱，進樣器將標準溶液直接進質(zhì)譜分析，同時采集正負離子信號，發(fā)現(xiàn)目標物在負離子模式下的響應(yīng)值遠大于正離子模式，該現(xiàn)象和剛果紅帶兩個磺酸結(jié)構(gòu)有關(guān)。剛果紅的一級質(zhì)譜在ESI負離子化模式下產(chǎn)生m/z651. 0[M-2Na+H]_及m/z 325. 0 [M_2Na] 2-兩個離子信號，符合文獻報道的聯(lián)苯胺偶氮染料電噴霧質(zhì)譜特征。選擇m/z651. 0進行子離子掃描，生成的主要碎片離子為m/z 152. 0，其為母離子失掉兩側(cè)偶氮苯磺酸結(jié)構(gòu)后剩余的聯(lián)苯基團(圖I. C)，改變碰撞電壓沒有其他明顯離子出現(xiàn)。再選擇m/z325. 0進行子離子掃描，生成的主要碎片離子為m/z416. 0，其為母離子一側(cè)的偶氮N=N鍵斷裂后剩余的碎片基團(圖I. C)，因剛果紅為對稱結(jié)構(gòu)，它的豐度較前者要高，適合作為定量離子，同時改變碰撞電壓也沒有其他明顯離子出現(xiàn)。將相關(guān)聯(lián)的離子對中豐度較大的一對即325. 0/416. 0作為定量離子對，651. 0/152. 0作為定性離子對。最后 對其裂解電壓參數(shù)及碰撞電壓進行優(yōu)化，選擇本發(fā)明中具體實施方案2中規(guī)定的質(zhì)譜條件進行檢測。
2.色譜條件的優(yōu)化
在純甲醇-水或乙腈-水流動相體系中，剛果紅的響應(yīng)非常低，完全不能滿足分析的要求。在負離子模式下有機相選擇甲醇、乙腈，水相選擇甲酸銨、乙酸銨、氨水的水溶液等常見體系，發(fā)現(xiàn)剛果紅在乙腈-甲酸銨體系下響應(yīng)值最大，接著對甲酸銨的濃度進行了優(yōu)化，其濃度分別選擇 5 mmol /I,. 10 mmol/L、20 mmol/L 及 30 mmol/L,發(fā)現(xiàn)在 10 mmol/L 的濃度下待測離子響應(yīng)值最高，因此最終選擇乙腈-lOmmol/L甲酸銨溶液作為本發(fā)明的流動相。一個合格的液質(zhì)聯(lián)用分析方法必須要良好的色譜分析條件為前提。剛果紅在反相色譜柱上的保留較弱，且本實驗前處理過程較為簡單，需要較好的色譜分離條件作為補充。本實驗采用梯度洗脫的方式不僅能使目標物與干擾組分完全分離，降低了基質(zhì)影響，同時避免了連續(xù)進樣過程中強保留物質(zhì)的堆積效應(yīng)。同時本次實驗選擇了填料粒徑僅為I. 8 mm高分離度色譜柱，如果不沖洗徹底很容易造成堵塞，降低色譜柱的壽命。在實驗中把RRLC的管路調(diào)整為低延遲狀態(tài)主要通過斷開阻尼器與溶劑混合器來降低系統(tǒng)的死體積，這在低流量做梯度洗脫時非常有用。
3.前處理條件的優(yōu)化
剛果紅易溶于水及極性較強的有機溶劑，如甲醇、乙腈，但其在乙醚、正己烷等非極性溶劑中的溶解度極小。本實驗采用正己烷與乙腈I :1的混合溶液對肉制品中的目標物進行提取主要基于以下考慮首先正己烷能去除樣品中脂肪以及其他大量非極性物質(zhì)，盡可能減少其在反相C18柱上的殘留。以脂肪含量高達35%的香腸樣品為例，實驗證明5 g樣品中經(jīng)10 ml正己烷提取一次后，脂肪含量降為5%以下，因此采用10 ml正己烷去除脂肪的方案是可行的；其次食品中含有大量的氯化鈉及谷氨酸鈉等物質(zhì)，這些不揮發(fā)鹽類在富有機溶劑中溶解度較小，使用乙腈提取剛果紅不僅極大降低不揮發(fā)鹽類對質(zhì)譜儀器的影響，同時乙腈具有沉淀蛋白的作用，可有效的提取目標物，降低基質(zhì)效應(yīng)。在提取方式上，比較了超聲、渦旋及手振搖的方式，發(fā)現(xiàn)超聲及渦旋方式在相同的提取時間內(nèi)提取效率不如手工振搖，但在振搖過程中應(yīng)注意選擇密封性良好的離心管，否則易造成損失。在振搖次數(shù)上依次選擇50、100、200、300進行試驗，發(fā)現(xiàn)100次以上回收率水平趨于平穩(wěn)，因此選擇振搖100次為最優(yōu)化條件。實驗證明，采用正己烷和乙腈混合溶劑手動振搖提取的方法快速，高效，結(jié)果準確，非常適用于食品安全監(jiān)管中的快速檢測。本發(fā)明的有益效果是高分辨快速液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(RRLC-MS/MS)具有高靈敏度、高分離度的特點，在痕量物質(zhì)分析、食品非法添加物檢測領(lǐng)域具有獨特的優(yōu)勢。本發(fā)明首次建立了肉制品中剛果紅工業(yè)染料的RRLC-MS/MS快速檢測方法，該方法快速、準確、有效，可操性強，可作為食品安全監(jiān)管的有力手段推廣使用。該方法的建立將在很大程度上有效打擊剛果紅的非法添加使用，保證廣大群眾的食品安全。本發(fā)明準確、科學(xué)、有效，在實際工作中具有很大意義，同時填補了國內(nèi)外空白。 四.


圖I加標樣品多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖(A)、選擇監(jiān)測離子對(B)與裂解途徑(C)
五.
具體實施例方式 I.樣品提取與凈化。準確稱取5 g均化后的樣品于50 ml離心管中，加入10 ml正己燒及10 ml乙腈,抒緊蓋子,劇烈上下震搖100次后于離心機中以5000 r/min離心10 min,取下層乙腈溶液Iml于離心機中以15000r/min離心IOmin,取上清液上機測試。乙腈層顏色較深的樣品可適當(dāng)稀釋，使其濃度在線性范圍之內(nèi)。2.色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件
色譜柱為Agilent XDB (18柱(2.1父50 mm, I. 8 mm);柱溫35 °C，進樣量I U L ;流動相A為10 mmol甲酸銨水溶液，流動相B為乙腈，流速0. 3 mL/min, RRLC系統(tǒng)管路調(diào)節(jié)為低延遲體積模式。流動相梯度洗脫程序為B在5 min內(nèi)由20%線性升至80%，再于I min后回到20%，保持2 min，單次分析時間為8 min。在此條件下，剛果紅保留時間為2. 7 min，加標樣品測試譜圖見附圖LA。
質(zhì)譜條件
電離模式=ESI (-);毛細管電壓4000 V ;干燥氣溫度320 °C ;干燥氣流速9. 0 L/min ；霧化氣壓力40 psi ;其余參數(shù)通過儀器自動調(diào)諧至最優(yōu)化。選擇多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，定性離子對與定量離子對分別為m/z 651.0/152. 0及m/z 325. 0/416. 0，見圖I. B。碎裂電壓分別為70 V及130 V，碰撞氣分別為39 V及13 V，駐留時間均為100 ms。3.標準曲線的建立
將剛果紅標準物質(zhì)溶液用空白基質(zhì)溶液稀釋成0. 1,0. 5,2. 0,5. 0,10. 0 mg/ml五個不同濃度的標準工作液，將標準工作液上機測試，外標法定量，建立響應(yīng)值與濃度的線性擬合方程。
權(quán)利要求
1.ー種對食品中剛果紅染料的快速液相串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測定方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成 (I)將含有剛果紅的食品經(jīng)均化并準確稱量后用正己烷-こ腈按體積比1:1混合的溶劑提取，提取液經(jīng)高速離心沉淀后直接上機檢測； (2)采用10 mmol甲酸銨水溶液-こ腈為流動相梯度洗脫，質(zhì)譜采集m/z 651.0/152.0及m/z 325. 0/416. O離子信號，分別作為定量離子對與定性離子對進行分析，使用外標法定量。
2.權(quán)利要求I所述對食品中剛果紅染料的快速液相串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測定方法在食品質(zhì)量安全檢測或出入境檢驗檢疫中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及應(yīng)用快速液相串聯(lián)質(zhì)譜法測定了食品中非法添加的剛果紅工業(yè)染料。均質(zhì)后的樣品經(jīng)乙腈與正己烷按體積比1:1混合的溶劑提取，乙腈提取層過濾后直接上機測試。使用AgilentXDBC18色譜柱，以乙腈和10mmol/L甲酸銨水溶液為流動相梯度洗脫，采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)負離子模式檢測，m/z325.0/416.0及m/z651.0/152.0分別作為定量離子對與定性離子對，外標法定量。
文檔編號G01N30/88GK102680634SQ20121017820
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者喬玲, 凌睿, 胡文彥, 胡飛杰 申請人:南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院