專利名稱：一種豬流感滅活疫苗的效價(jià)測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種疫苗效力的檢驗(yàn)方法，特別涉及一種豬流感滅活疫苗的效價(jià)測(cè)定方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬流感(Swine Influenza, SI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一種急性、高度接觸傳染性的豬呼吸道傳染病。在臨床上該病以突發(fā)性咳嗽、發(fā)熱、呼吸困難、衰竭、迅速康復(fù)或死亡為特征。該病可發(fā)生于各年齡和各品種的豬，發(fā)病率可高達(dá)100%。SI不僅使患豬生產(chǎn)性能下降，肉料比降低，直接影響豬群健康狀態(tài)，引起豬只死亡，而且豬流感病毒對(duì)豬呼吸道上皮細(xì)胞有高度的親嗜性，感染后使豬體的呼吸道天然屏障被破壞，導(dǎo)致豬呼吸與繁殖綜合征病毒、豬呼吸道冠狀病毒、豬胸膜肺炎放線菌等多種細(xì)菌或病毒的并發(fā)或繼發(fā)感染，使疫情更為復(fù)雜和加重。另外，SI還是豬主要的免疫抑制性疾病之一，可造成人工、飼料和藥物的巨大浪費(fèi)，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。使用滅活疫苗接種是控制豬流感的有效辦法，然而目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)商品化的豬流感滅活疫苗，確定疫苗的效力檢驗(yàn)方法是研制疫苗的關(guān)鍵技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)研究單位用于檢驗(yàn)疫苗效力的方法有攻毒保護(hù)試驗(yàn)，該方法所需時(shí)間較長(zhǎng)，可控性差，評(píng)價(jià)結(jié)果時(shí)常因使用的動(dòng)物級(jí)別不同，檢驗(yàn)結(jié)果也常有誤差。無(wú)法快速、準(zhǔn)確地確定豬流感疫苗的效價(jià)，已經(jīng)成為研制豬流感疫苗的難點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種豬流感滅活疫苗的效價(jià)測(cè)定方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是
一種豬流感滅活疫苗的效價(jià)測(cè)定方法，包括如下步驟
1)使用豬流感滅活疫苗免疫豬，免疫后21 28日后采血分離血清；
2)去除血清中的非特異性成分,得到待檢血清；
3)將豬流感滅活抗原稀釋，配制濃度為4HA單位豬流感抗原稀釋液；
4)將待檢血清稀釋，將血清稀釋液與4HA單位豬流感抗原稀釋液、紅細(xì)胞混合，進(jìn)行血凝抑制實(shí)驗(yàn)，以完全抑制4 HA單位豬流感抗原的血清最高稀釋度為HI效價(jià)。優(yōu)選的，所述方法包括如下步驟
1)使用豬流感滅活疫苗免疫豬，免疫后21 28日后采血分離血清；
2)將血清與受體破壞酶(RDE)混合，37°C水浴去除血清中非特異性成分；
3)將血清移至56°C水浴30min滅活殘留的RDE，加入雞紅細(xì)胞，20 25°C下吸附血清中殘余的非特異性成分；
4)將去除了非特異性成分的血清離心，取上清，上清即為待檢血清；
5)將豬流感滅活抗原進(jìn)行稀釋，之后加入雞紅細(xì)胞懸液，在血凝板震蕩均勻后于20 25°C下靜置20 30 min,以紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋倍數(shù)為血凝價(jià)；、6)根據(jù)測(cè)得的血凝價(jià)配制濃度為4HA單位豬流感抗原稀釋液；
7)將待檢血清稀釋，加入4HA單位豬流感抗原稀釋液和雞紅細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，進(jìn)行血凝抑制實(shí)驗(yàn)，以完全抑制4 HA單位豬流感抗原的血清最高稀釋度為HI效價(jià)。優(yōu)選的，步驟3)中，加入雞紅細(xì)胞使血清中紅細(xì)胞的體積濃度為5% 20%。優(yōu)選的，步驟5)和7)中，雞紅細(xì)胞的體積濃度為1%。本發(fā)明的有益效果是
首先，本發(fā)明采用了測(cè)定經(jīng)RDE處理的血清中紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)的方法來(lái)評(píng)價(jià)疫苗的免疫效力。該方法大大縮短了測(cè)定時(shí)間，操作誤差小，可控性強(qiáng)，批間差異小，同時(shí)也減少了用動(dòng)物攻毒保護(hù)試驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)效力時(shí)常常因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物級(jí)別不同，檢測(cè)結(jié)果常有的誤差。 其次，本發(fā)明的紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)的測(cè)定方法簡(jiǎn)便、快速、具有特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，可用于疫苗免疫效力檢驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。豬血清的獲得和預(yù)處理
1)用35日齡陰性(HI亞型流感HI抗體效價(jià)< 1:20)易感仔豬5頭，各頸部肌肉分左右兩點(diǎn)注射豬流感滅活疫苗(HlNl)3 ml，接種后21日，連同對(duì)照豬5頭采血，分離血清；
2)為去除血清中非特異性成分,將血清與受體破壞酶(RDE)按I : 4的體積比例混勻，置于37°C水浴中作用16 18h后，移至56°C水浴30min滅活殘留的RDE，取出后冷卻；
3)加入濃的雞紅細(xì)胞，使其終濃度為5% 20%，在室溫下吸附30min以去除其他非特異性成分；
4)然后低速離心(2000r/min)5 IOmin,吸取上清，即I: 5稀釋的待測(cè)血清,備用。豬流感滅活疫苗(HlNl)紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)
1)取96孔V型微量血凝板，每孔加25W PBS,在第I孔加25W豬流感滅活抗原，反復(fù)抽打8 10次混勻，從第I孔吸取25W加入第2孔，混勻后吸取25W加入第3孔，如此進(jìn)行2倍稀釋至第11孔，第11孔吸取25W棄去；
2)每孔加入25^1%雞紅細(xì)胞懸液，將反應(yīng)板在振蕩器上震蕩I 2min或輕扣反應(yīng)板混合反應(yīng)物，在室溫(20 25°C)下靜置20 30分鐘；
3)在對(duì)照孔紅細(xì)胞顯著呈鈕扣狀時(shí)判定結(jié)果，將反應(yīng)板傾斜60度，觀察紅細(xì)胞有無(wú)淚珠狀流淌，完全無(wú)淚珠樣流淌(100%凝集)的最高稀釋倍數(shù)為血凝價(jià)。4HA單位抗原的配制
1)根據(jù)測(cè)定的抗原血凝價(jià)，用PBS配制4HA單位抗原
2)將配置好的4HA單位抗原用PBS稀釋，使其稀釋度為I :2、I :3、I :4、I :5、I :6、I :7，在每一稀釋度的25W抗原中加25 W PBS，再加入1%雞紅細(xì)胞懸液25 W，混勻，室溫靜置40min判結(jié)果。3) 如果I :4稀釋為100%紅細(xì)胞凝集終點(diǎn)，表明配制的是4HA單位抗原；如果100%紅細(xì)胞凝集終點(diǎn)是I :5或I :6，表明配制的4HA單位抗原實(shí)際上是高于4個(gè)單位；如果100%紅細(xì)胞凝集終點(diǎn)是I :2或I :3，表明配制的4HA單位抗原實(shí)際上是低于4個(gè)單位。應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果適當(dāng)調(diào)整，使抗原工作液為4HA單位。
血凝抑制試驗(yàn)(HI):
1)取96孔V型微量反應(yīng)板，第I 11孔加入25W PBS，第12孔加入50 W PBS ；
2)在第I孔加入25W待檢血清，充分混勻后吸取25W于第2孔，依次2倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取25W棄去，并在每塊板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清對(duì)照；
3)第I 11孔均加入25W 4HA單位的抗原，在室溫靜置30 min ；
4)每孔中加入25W 1% (V/V)雞紅細(xì)胞懸液，震蕩混勻，在室溫靜置20 30 min,對(duì)照紅細(xì)胞將呈鈕扣狀沉于孔底；
5)結(jié)果判定將反應(yīng)板傾斜，凡血清反應(yīng)孔與紅細(xì)胞對(duì)照孔中紅細(xì)胞以同樣速度從 孔底流淌者判為血凝抑制，以完全抑制4HA單位抗原的血清最高稀釋度作為HI效價(jià)。疫苗評(píng)價(jià)
以完全抑制4HA單位抗原的血清最高稀釋度作為HI效價(jià)。若免疫后21日HI抗體免疫組至少有4/5豬只的HI效價(jià)不低于I : 160，對(duì)照組HI效價(jià)應(yīng)不高于I :20，則判定疫苗合格。本發(fā)明方法可靠性的驗(yàn)證
取30頭35日齡非免疫仔豬隨機(jī)分成A、B、C共3組，10頭/組，分別經(jīng)頸部肌肉注射S0802批豬流感滅活疫苗(H1N1)，其中A組0. 3 ml/頭，B組0. 5 ml/頭，C組I ml/頭，另取5頭同日齡仔豬不免疫作空白對(duì)照；
免疫后21天，各組采集血液分離血清，按I :4的比例使用受體破壞酶(RDE)處理血清，用HI亞型豬流感滅活抗原測(cè)定HI效價(jià)，并根據(jù)HI抗體的高低將試驗(yàn)豬分成I、II JILIV共四組，其中I組的HI抗體效價(jià)< 1:40 ； II組的HI抗體效價(jià)=1 80 ;111組的HI抗體=1 160 ;IV組的HI抗體效價(jià)彡I :320。攻毒保護(hù)試驗(yàn)
上述I、II、III、IV共四組免疫豬連同5頭同日齡抗體陰性豬(對(duì)照組)均用I :10倍稀釋的HlNl亞型豬流感病毒SGDOl株進(jìn)行攻毒，滴鼻和肌肉注射各I ml /頭(約含5X 106_5EID5tl),攻毒后5日各組采集鼻拭子進(jìn)行病毒分離，分別使用將每頭豬采集的鼻拭子各放入裝有Iml滅菌生理鹽水(含有雙抗)的塑料離心管中，4°C條件下靜置3-4小時(shí)后，3000rpm離心后經(jīng)尿囊腔接種9_11日齡SPF雞胚5枚，每枚0. 2ml，35°C孵育觀察72小時(shí)，測(cè)定雞胚液血凝價(jià)，以5枚雞胚中至少有I枚雞胚的血凝價(jià)>1:8 (微量法)判為感染。以血凝價(jià)為陰性的雞胚尿囊液盲傳一次，判定方法同上。結(jié)果見(jiàn)表2。免疫后21日HI抗體情況
HlNl亞型豬流感疫苗S0802批以不同劑量免疫35日齡非免疫仔豬后21日的HI抗體情況見(jiàn)表I，結(jié)果表明HI抗體效價(jià)主要分布在I :80到I :160之間，約占60%。衣I,豬流感校衍CHIN! !Ml. SCiDOi株.)免疫Iim體分術(shù)情況
權(quán)利要求
1.一種豬流感滅活疫苗的效價(jià)測(cè)定方法，包括如下步驟 1)使用豬流感滅活疫苗免疫豬，免疫后21 28日后采血分離血清； 2)去除血清中的非特異性成分,得到待檢血清； 3)將豬流感滅活抗原稀釋，配制濃度為4HA單位豬流感抗原稀釋液； 4)將待檢血清稀釋，將血清稀釋液與4HA單位豬流感抗原稀釋液、紅細(xì)胞混合，進(jìn)行血凝抑制實(shí)驗(yàn)，以完全抑制4 HA單位豬流感抗原的血清最高稀釋度為HI效價(jià)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的豬流感滅活疫苗的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于所述方法包括如下步驟 1)使用豬流感滅活疫苗免疫豬，免疫后21 28日后采血分離血清； 2)將血清與受體破壞酶(RDE)混合，37°C水浴去除血清中非特異性成分； 3)將血清移至56°C水浴30min滅活殘留的RDE，加入雞紅細(xì)胞，20 25°C下吸附血清中殘余的非特異性成分； 4)將去除了非特異性成分的血清離心，取上清，上清即為待檢血清； 5)將豬流感滅活抗原進(jìn)行稀釋，之后加入雞紅細(xì)胞懸液，在血凝板震蕩均勻后于20 25°C下靜置20 30 min,以紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋倍數(shù)為血凝價(jià)； 6)根據(jù)測(cè)得的血凝價(jià)配制濃度為4HA單位豬流感抗原稀釋液； 7)將待檢血清稀釋，加入4HA單位豬流感抗原稀釋液和雞紅細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，進(jìn)行血凝抑制實(shí)驗(yàn)，以完全抑制4 HA單位豬流感抗原的血清最高稀釋度為HI效價(jià)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬流感滅活疫苗的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于步驟3)中，加入雞紅細(xì)胞使血清中紅細(xì)胞的體積濃度為5% 20%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬流感滅活疫苗的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于步驟5)和7)中，雞紅細(xì)胞的體積濃度為1%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬流感滅活疫苗的效價(jià)測(cè)定方法，包括如下步驟使用豬流感滅活疫苗免疫豬，免疫后21～28日后采血分離血清；去除血清中的非特異性成分，得到待檢血清；將豬流感滅活抗原稀釋，配制濃度為4HA單位豬流感抗原稀釋液；將待檢血清作倍比稀釋，依次加入4HA單位豬流感抗原稀釋液、1%紅細(xì)胞，進(jìn)行血凝抑制實(shí)驗(yàn)，以完全抑制4HA單位豬流感抗原的血清最高稀釋度為HI效價(jià)。該方法大大縮短了測(cè)定時(shí)間，操作誤差小，可控性強(qiáng)，批間差異小，同時(shí)也減少了用動(dòng)物攻毒保護(hù)試驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)效力時(shí)常常因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物級(jí)別不同，檢測(cè)結(jié)果常有的誤差。
文檔編號(hào)G01N33/86GK102735853SQ201210186169
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
發(fā)明者仇微紅, 葉賀佳, 孫招金, 廖明, 李敏, 梁昭平, 王斌, 羅開(kāi)健 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué), 廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司