專利名稱：一種檢測花生過敏成分Arah1的雙抗體夾心ELISA方法
技術領域：
本發(fā)明涉及單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA檢測花生過敏成分Arahl方法的建立，屬于免疫分析技術領域。
背景技術：
近年來，食物過敏已成為ー個公眾性的食品安全問題，而花生是最常見的八大食品過敏原之一。過敏疾病嚴重危害人們的身體健康，雖然激發(fā)過敏反應的最低過敏原的量隨著人群的不同而不同，但是微量的過敏原就可以使絕大部分患者產(chǎn)生過敏癥狀。為了避免接觸微量的過敏原，過敏原的檢測成為當務之急。現(xiàn)在，雖然有許多過敏原檢測方法可供借鑒，但在具體應用上都存在著各自不同的問題。體內實驗方法可提供最為直接的證據(jù)，但由于安全因素等方面的考慮，只有在不得已的情況下在醫(yī)院進行，而且費用昂貴、風險大；與此相比體外實驗方法具有方便、安全點，但卻存在著準確性差的缺點。目前體外微量的檢測方法有免疫法、PCR法、組胺釋放實驗法、過敏原指紋快速檢測法等。雖然目前有關過敏原檢測的方法很多，但都存在各自不同的問題，如檢測速度慢、成本高、需要特定的分析儀器等，這些制約了食品中過敏原檢測方法的發(fā)展。因此實現(xiàn)準確、安全、經(jīng)濟、快速、高通量、高靈敏的體外檢測技術方法具有現(xiàn)實意義。雙抗體夾心法是檢測抗原的最常用方法，操作步驟如下
1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)接，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質；
2)加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗體抗原復合物。洗滌除去未結合的抗原物質；
3)加酶標抗體，保溫反應。固相抗體抗原復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時，固相載體上帯有的酶量與標本中受檢抗原的量相關；
4)加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標本中抗原的量。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于建立一種可以直接、快速、高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、操作方法簡單的雙抗體夾心ELISA方法。用于檢測花生過敏成分Arahl。本發(fā)明所說的雙抗體夾心ELISA檢測花生過敏成分Arahl方法，是鼠抗花生過敏成分Arahl單克隆抗體作為ー抗包被,與其配對成功的鼠抗花生過敏成分Arahl單克隆抗體用辣根過氧化物酶標記后作為ニ抗，夾心法檢測花生過敏成分Arahl。本發(fā)明方法中所說的鼠抗花生過敏成分Arahl單克隆抗體，其制備方法是雜交瘤的準備，篩選出針對花生過敏成分Arahl的強陽性細胞株14株用于免疫BALB/c小鼠，收集該免疫小鼠的腹水，進行脫脂純化酶標，將此14株細胞株進行配對篩選，得到配對成功即兩株能檢測針對花生過敏成分Arahl的細胞株。本發(fā)明方法的檢測分析原理是利用連接于固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體免疫復合物。由于反應系統(tǒng)中固相抗體和酶標抗體的量相對于待測抗原是過量的，因此復合物的形成量與待測抗原的含量成正比(在本方法可檢測范圍內)。測定復合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質量(OD值)，即可確定待測抗原含量。本發(fā)明的技術方案ー種花生過敏成分Arahl的雙抗體夾心ELISA方法，
(O酶標板的制備所用的包被原是鼠抗Arahl單克隆抗體，所用包被緩沖液是O. 05Μ、pH9. 6碳酸鈉緩沖液，所用封閉液是含O. I %明膠的上述包被緩沖液；
其中，鼠抗Arahl單克隆抗體是花生蛋白粗提取液免疫BALB/c小鼠制備；
(2)酶標ニ抗是辣根過氧化物酶標記與一抗配對成功的鼠抗Arahl單克隆抗體；
(3)洗滌液PBST的配方為1000mL蒸餾水中加入氯化鈉8 g、磷酸ニ氫鉀O. 2g、磷酸氫ニ鈉2. 9 g、氯化鉀O. 2 g、吐溫-20 O. 5mL。
(4)標準品稀釋液的配方為在含30%體積甲醇的pH 6. 5的PBS中加入質量比為5%的氯化鈉；
(5)顯色液包括A液和B液，A液配方為每100mL水中加入O. 933 g檸檬酸，3. 68 gNa2HPO4 · 12H20,18 μ L 30%Η202 ；Β液配方為60 mg四甲基聯(lián)苯胺溶于100 mLこニ醇，使用時按A : B=I : I體積比使用；
(6)終止液為2mol/L的硫酸；
檢測步驟為
1)以鼠抗Arahl單克隆抗體anti-ArahI-NO. 8作為捕獲抗體包被酶標板，100 μ L/孔，以O. 05 Μ、ρΗ 9. 6的碳酸鈉緩沖液為包被緩沖液，37°C孵育2h ；
2)洗板包被后,將酶標板內容溶液洗掉,拍干,每孔加220μ L洗滌液，放搖床上振動3min，倒掉拍干，再加洗液反復洗板三次；
3)封閉將板拍干后，每孔22(^し封閉液，37で孵育2h，洗板三次拍干，置37°C烘箱15min烘干備用；
4)加受檢標本，以NaCl含量為O.9%的O. OlM pH 7. 4的PBS溶液稀釋，IOOul/孔，37°C孵育O. 5h，同法洗板拍干；
5)加酶標鼠抗Arahl單克隆抗體HRP-anti-Arahl_NO.5作為檢測抗體，以含O. 1%明膠的PBST為抗體稀釋液，IOOul/孔，37°C孵育O. 5h，同法洗滌拍干；
6)顯色姆孔加入100yL顯色液,暗處37 °C反應15 min,取出后姆孔加入100 μ L終止液，用酶標儀測定吸光值A伽。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明建立了一種可以直接、快速、高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、操作方法簡單的雙抗體夾心ELISA方法，用于檢測花生過敏成分Arahl。


圖I Arahl雙抗體夾心ELISA標準曲線。
具體實施方案以下通過實施例進ー步說明本發(fā)明。一、儀器
TGL 一 40Β臺式低速離心機，上海安亭科學儀器廠KFLOff純水機，凱佛隆公司
ZD - 9556水平搖床，太倉科教器材廠
Costar96孔8X 12可拆酶標板,上海吉泰生物科技有限公司
MuLtiska Mks 酶標儀，Thermo Labsystems 公司
可調試移液器，Thermo Labsystems公司
渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠
AKTA purifierlO自動快速蛋白純化系統(tǒng)，superdex 7510/300 GL凝膠過濾柱 GEhealth life sciences 公ロ]
垂直電泳儀Bio-rad公司 倒置生物顯微鏡德國萊卡公司 ニ、試劑
辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG (HRP - IgG)，康成生物工程公司 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，華美生物工程公司 Arahl標品，Indoor公司 其他試劑均為分析純試劑
三、步驟
I、花生過敏原的提取與純化
a、將新鮮花生仁去皮，研磨粉碎。稱取10g，按1:10 (W/V)浸入石油醚(60 90)中4°C脫脂，磁力攪拌下過夜，靜置0. 5h,8000r離心20min，棄上清，反復脫取三次，沉淀用吹風機冷風吹干。b、隨即按1:20 (W/V)浸入0. 05M、pH 7.4 PBS中浸提，磁力攪拌4h，靜置0. 5h，8000r離心20min,去殘洛,取上清。C、在b所得上清中緩慢加入硫酸銨固體，邊加邊攪拌，加入的完全溶解后才繼續(xù)往后加，直至飽和度為30%，4°C靜置0. 5h，8000 r/min離心20 min，沉淀用所述PBS復溶。繼續(xù)往上清液中加硫酸銨同理得到60%、80%飽和度組分。上述分級組分分別裝入透析袋中，在 0.05M、pH 7. 4 PBS 中透析 24h。d、上述三個分級組分分別用紫外測定其蛋白含量，然后用SDS-PAGE鑒定各組分蛋白成分。e,通過SDS-PAGE鑒定后，挑選含有Arahl較多的硫酸銨沉淀組進行凝膠過濾層析。層析柱為superdex 7510/300 GL凝膠過濾柱，層析條件洗脫液為0. 05M、pH 7.4 PBS,流速為0. 35mL/min, 280nm紫外吸收監(jiān)測。收集所需出峰樣品，超純水透析24h即得含Arahl純度較高的花生蛋白。2、單抗的準備
用上述得到的Arahl純度較高的蛋白免疫小鼠，挑選效價最高的小鼠進行沖刺免疫，沖免三天后取其脾臟中脾細胞與SP2/0骨髄瘤細胞融合，融合后篩選出陽性雜交瘤細胞并及時進行亞克隆，經(jīng)多次亞克隆后，挑選到14顆強陽性的純細胞株。將這14株細胞株擴大培養(yǎng)，將收集的細胞腹腔注射到已打石蠟油的BALB/c小鼠體內，待小鼠腹部明顯變大且行動遲緩時抽取腹水，5000r/min、IOmin后收集中層澄清腹水。采用正辛酸-硫酸銨沉淀法分·別純化收集到的14類腹水，并記為anti-Arah I-NO. f 14。
3、配對篩選
采用過碘酸鈉法對純化后的抗體anti-Arah I-NO. Γ 4進行HRP標記，并用直接ELISA法鑒定HRP標記抗體是否成功。利用兩種單抗進行雙抗體夾心法ELISA法檢測過敏原吋，必須是針對不同抗原表位的兩種單抗才能成功，而所針對的兩個抗原表位的空間位置也是雙抗體夾心法ELISA法效果好壞的關鍵。以制備的anti-Arah I-NO. 1 14這14種單抗中的任意一種稀釋1000倍包被酶標板，然后封閉，封閉后加入Arahl標準品溶液，設置陽性對照(P，100ng/mL的Arahl標準品溶液)和陰性對照(N,0ng/mL的Arahl標準品溶液),待標準品與包被抗體反應后,カロ入除包被的單抗外的13種HRP標記的抗Arahl單抗(稀釋1000倍)，顯色終止、檢測后，選擇P/N值最大者的組合為最優(yōu)組合。4、ELISA方法條件的優(yōu)化
通過優(yōu)化實驗，建立了 Arahl雙抗體夾心ELISA檢測方法，最終確定的工作條件為以anti-Arah I-NO. 8為捕獲抗體，稀釋1600倍包被酶標板；以HRP-anti-Arahl_NO. 5為檢測抗體，工作濃度為800倍稀釋；包被液采用0.05 M、pH 9.6的碳酸鈉緩沖液；封閉液為含O. 1%明膠的包被液；以NaCl含量為O. 9%的O. OlM pH 7. 4的PBS溶液作為樣品稀釋液，含O. 1%明膠的PBST為酶標抗體稀釋液。5、ELISA標準曲線的建立
根據(jù)優(yōu)化的ELISA條件，建立Arahl標準曲線。配制成一系列的Arahl標準溶液1200ng/mL>600ng/mL>300ng/mL>150ng/mL>75ng/mL,37 ng/mL,18 ng/mL,9 ng/mL,4. 5 ng/mL, 2. 3 ng/mL, I. I ng/mL, 0. 5 ng/mL 12個濃度梯度，姆個濃度做3個重復,零孔做6個重復。以標品濃度為橫坐標，對應的OD值為縱坐標繪制曲線。根據(jù)繪制的曲線選取最佳的線性范圍，最低檢測限(LOD)為零孔加3倍標準差所對應標準曲線上的濃度值。本實驗建立的Arahl雙抗體夾心ELISA檢測方法檢測限達到O. 42ng/mL,線性范圍是為O. 8 100 μ g/mL。具體見附圖I。6、ELISA檢測方法評估
I)將純牛奶稀釋五倍，分別添加Arahl標準品至濃度為Ing/mL, 5ng/mL, 30 ng/mL, 60ng/mL，每個濃度做6次測定平均值，做5次重復實驗，添加回收實驗結果見表I。表I Arahl雙抗體夾心ELISA精密度、穩(wěn)定性和準確度驗證
批間(n=6)批次(n=6)
添加量(ng/ml) 檢測值士SD(ng/ml)回收率(％) 檢測值士 SD(ng/ml)回收率(％)
6070. 51±5.879117:69.00±6.79114.9
3030·80±3·149102:29·06±3·7998.28
54·673±0·27993.9:5·207±0·289103.54
I[1.403 + 0.066]139.2jl.289±0.210[^128.93
由表I可知，在批間實驗中，回收率在93. 9 139. 2之間，變異系數(shù)在4. 68% 10. 32%之間，在批次實驗中，回收率在98. 28 128. 9之間，變異系數(shù)在6. 989Γ12. 30%之間，所以建立的Arahl雙抗體夾心ELISA檢測方法精密度高、穩(wěn)定性和準確度好。2)實際樣品檢測從本地超市選購10種包裝食品，按建立的ELISA方法進行Arahl實際樣品檢測，根據(jù)標準曲線結果進行分析，檢測結果如表2所示
表2樣品檢測結果分析權利要求
1.一種撿測花生過敏成分Arahl的雙抗體夾心ELISA方法,其特征在于 (O酶標板的制備所用的包被原是鼠抗Arahl單克隆抗體，所用包被緩沖液是O. 05Μ、pH9. 6碳酸鈉緩沖液，所用封閉液是含O. I %明膠的上述包被緩沖液； 其中，鼠抗Arahl單克隆抗體是花生蛋白粗提取液免疫BALB/c小鼠制備； (2)酶標ニ抗是辣根過氧化物酶標記與一抗配對成功的鼠抗Arahl單克隆抗體； (3)洗滌液PBST的配方為1000mL蒸餾水中加入氯化鈉8 g、磷酸ニ氫鉀O. 2g、磷酸氫ニ鈉2. 9 g、氯化鉀O. 2 g、吐溫-20 O. 5mL ； (4)標準品稀釋液的配方為在含30%體積甲醇的pH6. 5的PBS中加入質量比為5%的氯化鈉； (5)顯色液包括A液和B液，A液配方為每100mL水中加入O. 933 g檸檬酸，3. 68 gNa2HPO4 · 12H20,18 μ L 30%Η202 ；Β液配方為60 mg四甲基聯(lián)苯胺溶于100 mLこニ醇，使用時按A : B=I : I體積比使用； (6)終止液為2mo I/L的硫酸； 檢測步驟為 1)以鼠抗Arahl單克隆抗體anti-ArahI-NO. 8作為捕獲抗體包被酶標板，100 μ L/孔，以O. 05 Μ、ρΗ 9. 6的碳酸鈉緩沖液為包被緩沖液，37°C孵育2h ； 2)洗板包被后,將酶標板內容溶液洗掉,拍干,每孔加220μ L洗滌液，放搖床上振動3min，倒掉拍干，再加洗液反復洗板三次； 3)封閉將板拍干后，每孔22(^し封閉液，37で孵育2h，洗板三次拍干，置37°C烘箱15min烘干備用； 4)加受檢標本，以NaCl含量為O.9%的O. OlM pH 7. 4的PBS溶液稀釋，100 μ L/孔，37°C孵育O. 5h，同法洗板拍干； 5)加酶標鼠抗Arahl單克隆抗體HRP-anti-Arahl_NO.5作為檢測抗體，以含O. 1%明膠的PBST為抗體稀釋液，100 μ L/孔，37°C孵育O. 5h，同法洗滌拍干； 6)顯色姆孔加入100yL顯色液,暗處37 °C反應15 min,取出后姆孔加入100 μ L終止液，用酶標儀測定吸光值A45tlt全文摘要
一種檢測花生過敏成分Arah1的雙抗體夾心ELISA方法，屬于免疫分析技術領域。本發(fā)明首先從新鮮花生仁中獲取含Arah1純度較高的花生蛋白，用其免疫小鼠獲得14株單抗，從中選擇P/N值最大者的組合為最優(yōu)組合。利用連接于固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體免疫復合物。由于反應系統(tǒng)中固相抗體和酶標抗體的量相對于待測抗原是過量的，因此復合物的形成量與待測抗原的含量成正比。測定復合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質量(OD值)，即可確定待測抗原含量。本發(fā)明直接、快速、高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、操作方法簡單的雙抗體夾心ELISA法，檢測花生過敏成分Arah1。
文檔編號G01N33/577GK102680696SQ201210187068
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權日2012年6月8日
發(fā)明者匡華, 宋珊珊, 尹玉云, 彭娟, 朱建平, 王利兵, 王文彬, 胥傳來 申請人:江南大學