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電噴霧萃取電離串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)尿中1-ohp的方法

文檔序號(hào):5893663閱讀:291來源:國(guó)知局
專利名稱:電噴霧萃取電離串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)尿中1-ohp的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及尿中I羥基芘(1-0HP)的檢測(cè)方法,特別涉及一種電噴霧萃取電離串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)尿中1-0HP的方法,屬于多環(huán)芳烴生物標(biāo)志物的分析檢測(cè)手段。
背景技術(shù)
尿中1-0HP是致癌性環(huán)境污染物多環(huán)芳烴(PAHs)的重要生物標(biāo)志物,在人體對(duì)PAHs暴露及健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)研究(如PAHs分子流行病學(xué))中意義重大。目前文獻(xiàn)報(bào)道的尿中1-0HP的分析方法包括高效液相色譜熒光光譜法(highperformance liquid chromatography fluorescence detection, HPLC-FD)> RTF、SFS>共振光散射法(resonance light scattering spectroscopy, RLS)、氣相色譜(氫火焰離子化檢測(cè)器)(gas chromatography flame ionization detection, GC-FID)、氣相色譜質(zhì)譜法(gas chromatography mass spectrometry, GC-MS)、液相色譜質(zhì)譜法(liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS)、毛細(xì)管電泳(紫外檢測(cè)器)(capillaryelectrophoresis)、化學(xué)發(fā)光法(chemiluminescence)、電化學(xué)法(electrochemistry)、光譜電化學(xué)法(spectroelectrochemical sensing)、免疫學(xué)法(immunologic methods)、放身寸免疫學(xué)法(radioimmunoassay)、免疫化學(xué)法(immunochemical assay)等。在上述方法中,盡管上述分析檢測(cè)技術(shù)均能實(shí)現(xiàn)OH-PAHs的定性定量分析,且靈敏度、準(zhǔn)確度等結(jié)果互可比擬。但是考慮到操作簡(jiǎn)易程度、儀器設(shè)備可獲取性、技術(shù)成熟度等因素,HPLC是目前最常用的檢測(cè)技術(shù)。另一方面,基于MS檢測(cè)技術(shù)的LC-MS(包括LC-MS/MS)和GC-MS (包括GC-MS/MS),由于MS檢測(cè)結(jié)果可以提供分子結(jié)構(gòu)信息,因此在方法特異性上具有其它檢測(cè)技術(shù)不可比擬的優(yōu)勢(shì)。此外,因?yàn)镚C-MS和LC-MS已在實(shí)驗(yàn)室較為普及,因此也是目前常用的OH-PAHs檢測(cè)手段。然而,現(xiàn)有尿中1-0HP分析方法普遍存在樣品前處理和色譜環(huán)節(jié)耗時(shí)較長(zhǎng),無法滿足PAHs健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)(如PAHs分子流行病學(xué))中高通量樣品分析的迫切需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有尿中1-0HP檢測(cè)方法前處理過程繁瑣、分析周期較長(zhǎng)而提供一種電噴霧萃取電離串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)尿中1-0HP的方法。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)尿中
1-0HP的快速定量,能夠滿足PAHs健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)(如PAHs分子流行病學(xué))中高通量樣品分析的迫切需求。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法是借助電噴霧萃取電離(EESI)源和商品化儀器LTQ-XL型線性離子阱質(zhì)譜儀,進(jìn)行無樣品前處理?xiàng)l件下、尿中1-0HP的快速檢測(cè)。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
(I) 1-0HP母液的配制準(zhǔn)確稱取10.0 土 0.5 mg 1-0HP,置入大瓶中,加入甲醇溶解,得到濃度為100 土 5mg I/1的1-0HP母液。將母液轉(zhuǎn)移至棕色小瓶中,4 土 0.2 °C密封避光保存。
(2) 1-0HP標(biāo)液的配制移取有效體積1-0HP母液,用甲醇稀釋為濃度20 土 I y gI/1的1-0HP標(biāo)液,將標(biāo)液轉(zhuǎn)移至棕色小瓶中,4 土 0.2 °(密封避光保存。(3)加標(biāo)尿樣的準(zhǔn)備取有效體積1-0HP母液(100 mg L_O,用尿樣逐級(jí)稀釋,得到1-0HP加標(biāo)濃度為0. 01 - 5 mg I/1的加標(biāo)尿樣。加標(biāo)后尿中1-0HP濃度約為未加標(biāo)前尿(水解尿樣)1-0HP濃度的I. 5 - 3. 0倍最佳。加標(biāo)尿樣是為EESI-MS定量測(cè)定尿中1-0HP時(shí)所用的標(biāo)準(zhǔn)加入法所備。配制加標(biāo)尿樣所用的尿樣為水解后的尿樣。采用水解尿樣的原因是,尿中排出的1-0HP主要是結(jié)合態(tài)1-0HP (如1-0HP和葡糖苷酸的結(jié)合物),需水解尿樣后,才可得到游離態(tài)1-0HP,進(jìn)行檢測(cè)。尿樣水解流程為用1-mL移液管取0. 5 mL鹽酸(0. I M),加入玻璃離心管中;用
2-mL移液管取I. 5 mL的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液(0. 5 M, pH = 5),加入玻璃離心管中;用5-mL移液管取4 mL實(shí)際尿樣,加入玻璃離心管中;用25-111微量進(jìn)樣針取10111^-葡萄糖醛酸酶,加入玻璃離心管中;將離心管置于水浴鍋中37 °(恒溫水浴過夜。(4) EESI源參數(shù)的設(shè)置ESI溶劑管路和樣品溶液管路間的距離與角度分別約為I - 2 mm和40 - 70°,二者與質(zhì)譜儀金屬離子傳輸管入口的距離和角度分別約為6 - 15 mm和145 - 160。。初級(jí) ESI 溶劑為含有 I. 0 X KT3-LO X KT2M 醋酸銨或 7.0 X IO-3- I. 5X 10_1 M氨水的甲醇水混合溶劑(體積比大于95%),流速1-4 UL min-1 ;樣品溶液流速
4- L min — 1 ;ESI電壓-3 - - 4 kV ;金屬離子傳輸管溫度350 - 400 0C ;樣品霧化氣為高純氮?dú)?純度99. 999%),壓力I. 0 - I. 4 MPa。(5)串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)參數(shù)的設(shè)置負(fù)離子檢測(cè)模式 ’母離子m/z 217 ;母離子隔離寬度2. 0 ;活化值Q (AQ)為0. 40 - 0. 50,碰撞能量(NCE)為35 - 55%,碰撞時(shí)間30 ms ;質(zhì)量數(shù)掃描范圍50 - 350;離子阱最大離子注入時(shí)間200 ms;實(shí)際注入離子量由自動(dòng)獲取控制(AGC)確定;碰撞氣He氣(離子阱內(nèi)壓力0.82 - 0. 83 X 10 —5 Torr);離子透鏡等其它MS條件由LTQ-XL-MS自動(dòng)優(yōu)化得到。(6)樣品檢測(cè)在相同EESI-MS/MS條件下,分別分析溶劑空白、1-0HP標(biāo)液、未加標(biāo)尿樣和梯度濃度加標(biāo)尿樣;每次進(jìn)樣約0. 5 min,平行進(jìn)樣6次;測(cè)定MS/MS譜圖中m/z2ll,m/z 189處質(zhì)譜峰強(qiáng)度,進(jìn)行定性定量分析。取^ 189處質(zhì)譜峰是1-0HP分子離子二級(jí)質(zhì)譜碎片離子。(7)數(shù)據(jù)處理包括(a)定性分析和(b)定量分析兩部分。(a)定性分析以1-0HP標(biāo)液MS/MS譜圖中取A 189和取A 217處質(zhì)譜峰強(qiáng)度比值為參照,對(duì)比樣品MS/MS譜圖中取A 189和取A 217處質(zhì)譜峰強(qiáng)度比值,確認(rèn)樣品中1-0HP是否被檢出。(b)定量分析采用標(biāo)準(zhǔn)加入法定量尿中1-0HP。同時(shí),為減少EESI源和質(zhì)譜儀長(zhǎng)期
操作對(duì)1-0HP信號(hào)響應(yīng)的影響、提高分析結(jié)果的穩(wěn)定性,在初級(jí)ESI溶劑中加入氘代1-0HP (D9-I-OHP) (0. I mg I/1)。MS/MS 檢測(cè) D9-I-OHP 的目標(biāo)離子為 D9-I-OHP 的碎片離子[M - H - 28]- Wz 198),CID 分析條件與 I-OHP 相同。以未加標(biāo)/加標(biāo)尿樣MS/MS譜圖中189和198處質(zhì)譜峰強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)(7),以1-0HP加標(biāo)濃度為橫坐標(biāo)CO,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析,得到線性回歸方程7=aJ + b。7=0時(shí)得到Z的絕對(duì)值-―,此絕對(duì)值即為尿中
權(quán)利要求
1.I、一種電噴霧萃取電離串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)尿中I-OHP的方法,其特征在于借助電噴霧萃取電離EESI源和商業(yè)化儀器LTQ-XL型線性離子阱質(zhì)譜儀,尿樣直接進(jìn)行電噴霧萃取電離串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè),具體操作步驟如下 (1)1-0HP母液的配制準(zhǔn)確稱取10.0 土 0.5 mg 1-0HP,置入大瓶中,加入甲醇溶解,得到濃度為100 土 5mg I/1的1-0HP母液;將該母液轉(zhuǎn)移至棕色小瓶中,4土 0.2 °C密封避光保存; (2)1-0HP標(biāo)液的配制移取有效體積1-0HP母液,用甲醇稀釋為濃度20± I iigl/1的1-0HP標(biāo)液,將該標(biāo)液轉(zhuǎn)移至棕色小瓶中,4 土 0.2 °(密封避光保存; (3)加標(biāo)尿樣的準(zhǔn)備取有效體積1-0HP母液,濃度為100土 0.5 mg I/1,用尿樣逐級(jí)稀釋,得到1-0HP加標(biāo)濃度為0. 01 - 5 mg I/1的加標(biāo)尿樣;加標(biāo)后尿中1-0HP濃度約為未加標(biāo)前尿一水解尿樣1-0HP濃度的I. 5 - 3. 0倍; (4)EESI源參數(shù)的設(shè)置ESI溶劑管路和樣品溶液管路間的距離與角度分別約為I - 2mm和40 - 70°,二者與質(zhì)譜儀金屬離子傳輸管入口的距離和角度分別約為6-15 mm和145- 160。;初級(jí)ESI 溶劑為含有 I. 0 X KT3-LO X KT2M醋酸銨或7.0 X KT3-L 5X 10 1 M氨水的甲醇水混合溶劑,體積比大于95%,流速I-4ii L HiirT1 ;樣品溶液流速4- L miiT1 ;ESI電壓-3 - - 4 kV ;金屬離子傳輸管溫度350 - 400 0C ;樣品霧化氣為高純氮?dú)?,純?9. 999%,壓力I. 0 - I. 4 MPa ; (5)串聯(lián)質(zhì)譜MS/MS參數(shù)的設(shè)置負(fù)離子檢測(cè)模式 ,母離子m/z217 ;母離子隔離寬度·2. 0 ;活化值Q為0. 40 - 0. 50,碰撞能量NCE為35 - 55%,碰撞時(shí)間30 ms ;質(zhì)量數(shù)掃描范圍50- 350 ;離子阱最大離子注入時(shí)間200 ms ;實(shí)際注入離子量由自動(dòng)獲取控制確定;碰撞氣He氣,離子阱內(nèi)壓力0.82 - 0.83 X 1(T5 Torr ;離子透鏡其它MS條件由LTQ-XL-MS自動(dòng)優(yōu)化得到; (6)樣品檢測(cè)在相同EESI-MS/MS條件下,分別分析溶劑空白、1-0HP標(biāo)液、未加標(biāo)尿樣和梯度濃度加標(biāo)尿樣;每次進(jìn)樣約0. 5 min,平行進(jìn)樣6次;測(cè)定MS/MS譜圖中 々217, /z 189處質(zhì)譜峰強(qiáng)度,進(jìn)行定性定量分析.jn/z 189處質(zhì)譜峰是1-0HP分子離子二級(jí)質(zhì)譜碎片離子; (7)數(shù)據(jù)處理包括(a)定性分析和(b)定量分析兩部分 Ca)定性分析以1-0HP標(biāo)液MS/MS譜圖中取A 189和取A 217處質(zhì)譜峰強(qiáng)度比值為參照,對(duì)比樣品MS/MS譜圖中取A 189和取A 217處質(zhì)譜峰強(qiáng)度比值,確認(rèn)樣品中1-0HP是否被檢出; (b)定量分析采用標(biāo)準(zhǔn)加入法定量尿中1-0HP,同時(shí),為減少EESI源和質(zhì)譜儀長(zhǎng)期操作對(duì)1-0HP信號(hào)響應(yīng)的影響、提高分析結(jié)果的穩(wěn)定性,在初級(jí)ESI溶劑中加入氘代1-0HP(D9-I-OHP) (0. I mg I/1),MS/MS 檢測(cè) D9-I-OHP 的目標(biāo)離子為 D9-I-OHP 的碎片離子[M-H- 28] - im/z 198),MS/MS 分析條件與 1-0HP 相同; 以未加標(biāo)/加標(biāo)尿樣MS/MS譜圖中tn/z 189和tn/z 198處質(zhì)譜峰強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)Cr),以1-0HP加標(biāo)濃度為橫坐標(biāo)CO,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析,得到線性回歸方程7=aJ+ b ;7 = O時(shí)得到Z的絕對(duì)值,此絕對(duì)值即為尿中I-OHP濃度。
2.2、根據(jù)權(quán)利要求I所述電噴霧萃取電離串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)尿中1-0HP的方法,其特征在于加標(biāo)尿樣所用的尿樣為水解后的尿樣。
3.3、根據(jù)權(quán)利要求I所述電噴霧萃取電離串聯(lián)質(zhì)譜 快速檢測(cè)尿中1-0HP的方法,加標(biāo)后尿中1-0HP濃度約為未加標(biāo)前尿一水解尿樣中1-0HP濃度的I. 5 - 3. 0倍最佳。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種電噴霧萃取電離串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)尿中1-OHP的方法,特別涉及尿中1-OHP的常壓電離源質(zhì)譜檢測(cè)方法,屬于多環(huán)芳烴生物標(biāo)志物的分析檢測(cè)手段,操作步驟是(1)1-OHP的母液的配制;(2)1-OHP標(biāo)液的配制;(3)加標(biāo)尿樣的準(zhǔn)備;(4)EESI源參數(shù)的設(shè)置;(5)串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)的設(shè)置;(6)樣品檢測(cè);(7)數(shù)據(jù)處理。本發(fā)明能在無需樣品前處理?xiàng)l件下直接測(cè)定尿中1-OHP,改善了現(xiàn)有技術(shù)前處理過程繁瑣、分析周期長(zhǎng)的不足。該法具有快速、抗基質(zhì)干擾等特點(diǎn),尤其適用于快速篩查暴露人群尿中1-OHP存在情況,對(duì)PAHs暴露人群的健康風(fēng)險(xiǎn)研究意義重大。
文檔編號(hào)G01N27/62GK102721733SQ20121018891
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月11日
發(fā)明者于志強(qiáng), 傅家謨, 方小偉, 李銀萍, 李雪, 陳煥文 申請(qǐng)人:上海大學(xué), 東華理工大學(xué)
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