專利名稱：西瓜花葉病毒的單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種西瓜花葉病毒的單克隆抗體。
背景技術：
西瓜花葉病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)在分類上屬于馬鈴暮Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus),此病毒被多種姆蟲以非持久方式傳播。該病毒主要危害西瓜和甜瓜等葫蘆科植物，引起花葉病，在國內西甜瓜產區(qū)廣泛發(fā)生，造成的損失為30% 50%，甚至造成絕產，已經成為制約西瓜和甜瓜高產穩(wěn)產最主要的因素之一。目前植物病毒的檢測方法主要包括生物學、血清學和分子生物學方法，而單克隆抗體由于其是針對單一抗原決定簇產生的，所以具有特異性好的優(yōu)勢，為植物病毒免疫學方法的應用奠定了基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種西瓜花葉病毒的單克隆抗體及應用。本發(fā)明提供了一種保藏號為CGMCC No. 6100的西瓜花葉病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株6C6。本發(fā)明還提供了一種西瓜花葉病毒的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC No. 6100的西瓜花葉病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株6C6產生。所述的單克隆抗體在檢測西瓜花葉病毒抗原中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。所述的單克隆抗體在制備西瓜花葉病毒檢測試劑盒中的應用；或所述的單克隆抗體在制備檢測西瓜花葉病毒的膠體金快速檢測試紙條中的應用，上述應用均是本發(fā)明保護的范圍。含有所述的單克隆抗體的檢測西瓜花葉病毒的試劑盒也是本發(fā)明保護的范圍；或含有所述的單克隆抗體的檢測西瓜花葉病毒的膠體金快速檢測試紙條也是本發(fā)明保護的范圍。經篩選得到能穩(wěn)定分泌的西瓜花葉病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株6C6，該雜交瘤細胞株6C6的分類命名為分泌西瓜花葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株，已于2012年5月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo.6100。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明研制的西瓜花葉病毒單克隆抗體的特異性好、效價高，與購自ATCC的3個西瓜花葉病毒分離物均起反應，具有較好的廣譜性，應用于植物病毒血清學診斷試劑中，特異性好，避免了交叉反應。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中所用的病毒和試劑如下南瓜,品種名一味,購自北京世農種苗；本生煙(Nicotiana benthamiana):公眾可以從中國檢驗檢疫科學研究院獲得；參考文獻黃峰，陳青，陳紅運，白靜，李桂芬等，黃瓜綠斑駁花葉病毒低風險參照物質的研制，植物檢疫，2009年第4期，第23卷，24-26頁。昆諾藜(Chenopodium guinoa):公眾可以從中國檢驗檢疫科學研究院獲得；參考文獻李桂芬，朱水芳、周群等，侵染紫松果菊的黃瓜花葉病毒分離物的鑒定，植物保護，2007年第33卷，第I期，54-56頁。西瓜花葉病毒(Watermelonmosaic virus,縮寫WMV),購自 ATCC,編號PV-27 ;西瓜花葉病毒，購自ATCC，編號PV-379 ;西瓜花葉病毒，購自ATCC，編號PV-511。接種在南 瓜上。馬鈴薯A 病毒(Potato virus A，縮寫PVA)，購自 DSMZ，DSMZ 編號PV_0320，接種在本生煙(Nicotiana benthamiana)上。萵苣花葉病毒(Lettucemosaic virus,縮寫LMV),購自 ATCC,編號PV_63,接種在昆諾藜(Chenopodium quinoa)上。
李痘病毒(Plum pox virus，縮寫PPV)，購自DSMZ，編號PV_0213，接種在本生煙上。堿性磷酸酯酶標記的馬抗小鼠酶標抗體購自中杉金橋公司，貨號AP_2000。樣品抽提緩沖液為0. 5mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7. 5)，配方如下Na2HPO4 12H20146. 837gKH2PO412. 248g先加入800ml蒸餾水溶解，然后用蒸餾水定容至1000ml。實施例I、西瓜花葉病毒的單克隆抗體的制備和生物學特性的測定一、西瓜花葉病毒的單克隆抗體的制備I、病毒繁殖與純化病汁液的制備將購自ATCC的西瓜花葉病毒毒源(PV-27)接種在南瓜上，18天采收病葉，病葉加2倍體積的0. 5mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7. 5，含0. 1%巰基乙醇)，勻漿，雙層紗布過濾，低速離心(3750 X g, 15min)，取上清即為病汁液。將上述病汁液中加入2. 5%TRIT0N X_100、0. lmol/L氯化鈉、4%PEG(分子量6000)，4°C攪拌3h，離心(18160 Xg，20min)。沉淀懸浮于0. 5mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7. 5，含0. 5mol/L尿素)中，4°C攪拌過夜，離心(2860Xg，15min)。取上清經20%蔗糖墊離心(210000 X g，2. 5h )，沉淀懸浮于0. 05mo 1/L磷酸鹽緩沖液(pH7. 5 )中，4 °C攪拌3h，離心(2860 X g, IOmin),上清液即為純化的西瓜花葉病毒制劑。2、小鼠免疫將純化的西瓜花葉病毒制劑在與其同體積的弗氏完全佐劑中乳化，乳化后對8周齡的BALB/c小鼠做腹腔注射,每只小鼠IOOii g純化病毒。2周后,將純化的西瓜花葉病毒制劑在與其同體積的弗氏不完全佐劑中乳化作第二次腹腔注射，每只小鼠100 yg純化病毒。2周后第三次免疫小鼠(同第二次)。融合前3d加強免疫,加強免疫是采用200 ii g純化的西瓜花葉病毒制劑直接注射小鼠腹腔。3、雜交瘤細胞的篩選將免疫小鼠的脾細胞與SP2/0細胞進行細胞融合,用純化的西瓜花葉病毒制劑4ug/ml的濃度包被酶標板，采用間接ELISA進行測定。對陽性孔的細胞用有限稀釋法克隆3次，使陽性率達100%，陽性克隆細胞及時凍存。經間接ELISA法篩選，3次亞克隆化獲得了 I株能穩(wěn)定分泌西瓜花葉病毒的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，雜交瘤細胞培養(yǎng)上清抗體效價為1:8000。經篩選得到能穩(wěn)定分泌的西瓜花葉病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株6C6，該雜交瘤細胞株6C6的分類命名為分泌西瓜花葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株，已于2012年5月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo.6100。4、單克隆抗體的制備將上述篩選得到的雜交瘤細胞株6C6 CGMCC No. 6100置于細胞培養(yǎng)基(含體積百分含量為20%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)中，放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(96小時)，得到6C6培養(yǎng)上清，即為單克隆抗體。DMEM培養(yǎng)基，購自ATCC，貨號30-2002 ;上述培養(yǎng)時間3天，培養(yǎng)條件溫度37°C，二氧化碳濃度5%，pH 7. O。用G蛋白柱(G蛋白柱購自GE公司，產品目錄號為17-0404-01)對6C6培養(yǎng)上清進行純化(完全按照G蛋白柱的使用說明進行操作)，得到純化單克隆抗體(濃度為0. 63mg/ml), -20°C保存。二、單克隆抗體生物學特性的測定I、效價的測定方法①用純化西瓜花葉病毒4 U g/mL的濃度包被酶標板，37°C孵育2h，洗酶標板。②用含5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液封板，37°C孵育30min，洗酶標板。③將由上述一得到的6C6培養(yǎng)上清(單克隆抗體)按一定比例稀釋加入到酶標板中，37°C孵育2h，洗酶標板。④加入I :1000稀釋的堿性磷酸酶標記的馬抗小鼠抗體，37°C孵育2h。洗酶標板。⑤加入底物溶液，室溫避光孵育60min后用酶標儀測定405nm波長下各孔的吸收值，結果見表I。表I為效價的測定結果
權利要求
1.保藏號為CGMCCNo. 6100的西瓜花葉病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株6C6。
2.由權利要求I所述的保藏號為CGMCCNo. 6100的西瓜花葉病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株6C6產生的單克隆抗體。
3.權利要求2所述的單克隆抗體在制備西瓜花葉病毒檢測試劑盒中的應用。
4.權利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測西瓜花葉病毒的膠體金快速檢測試紙條中的應用。
5.含有權利要求2所述的單克隆抗體的檢測西瓜花葉病毒的試劑盒。
6.含有權利要求2所述的單克隆抗體的檢測西瓜花葉病毒的膠體金快速檢測試紙條。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種西瓜花葉病毒的單克隆抗體。本發(fā)明提供的一種保藏號為CGMCC No.6100的西瓜花葉病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株6C6。還提供了一種西瓜花葉病毒的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC No.6100的西瓜花葉病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株6C6產生。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明研制的西瓜花葉病毒單克隆抗體的特異性好、效價高，與購自ATCC的3個西瓜花葉病毒分離物均起反應，具有較好的廣譜性，應用于植物病毒血清學診斷試劑中，特異型好，避免了交叉反應。
文檔編號G01N33/577GK102749450SQ20121018901
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權日2012年6月8日
發(fā)明者呂玉峰, 周琦, 張永江, 李建光, 李桂芬, 梁新苗, 汪萬春, 程琳, 邊勇, 鄧叢良, 高文娜 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局