專利名稱：檢測(cè)自身免疫性肝病相關(guān)抗體asma的試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種檢測(cè)自身免疫性肝病相關(guān)抗體ASMA的試劑盒，本發(fā)明還涉及使用該試劑盒檢測(cè)ASMA的方法。
背景技術(shù)：
自身免疫性肝病(autoimmune liver diseases)主要包括三種與自身免疫密切相關(guān)的、以肝膽損傷為主的疾病自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)、原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)和原發(fā)性硬化性 膽管炎(primarysclerosing cholangitis, PSC)。AIH是一種伴循環(huán)自身抗體和高免疫球蛋白血癥、病因未明、呈慢性炎性壞死的肝臟疾病，PBC是以自身免疫介導(dǎo)的肝內(nèi)膽管損傷、以后呈肝纖維化、最終導(dǎo)致肝功能衰竭為特征的一類病因不明的自身免疫性肝臟疾病，PSC是一種原因不明的慢性綜合征，其特征是肝外和/或肝內(nèi)膽管彌漫性炎癥及纖維化所引起的慢性膽汁淤積癥。近年來(lái)，國(guó)際上對(duì)自身免疫性肝病基礎(chǔ)與臨床的研究高度重視，并且進(jìn)展迅速，主要涉及自身免疫性肝病的發(fā)病機(jī)制、遺傳背景、相關(guān)自身抗體及其靶抗原性質(zhì)、臨床流行病學(xué)、臨床診斷及治療和預(yù)后等方面。自身免疫性肝病的診斷主要依靠病史、臨床表現(xiàn)、體征和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。肝組織病理學(xué)檢查被認(rèn)為是AIH，PBC診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但此項(xiàng)檢查臨床應(yīng)用具有局限性，例如，自身免疫性肝病的肝活檢組織病理學(xué)表現(xiàn)特異性不強(qiáng)，非自身免疫性肝病所特有；患者不愿或不適接受此項(xiàng)創(chuàng)傷性檢查；此外，目前多數(shù)醫(yī)院采用B超引導(dǎo)下細(xì)針穿刺取材進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查，此檢查受取材標(biāo)本局限，是否能取得病變組織，對(duì)檢查結(jié)果影響很大。盡管如此，肝組織病理學(xué)檢查對(duì)自身免疫性肝病診斷、鑒別診斷及病變程度的判斷至關(guān)重要，仍是診斷的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。AIH，PBC早期病變(膽管炎期、慢性膽汁淤積期)屬臨床治療可逆轉(zhuǎn)期或可部分逆轉(zhuǎn)期，后期或終末期(肝纖維化/肝硬化期、肝衰竭期)屬臨床治療不可逆轉(zhuǎn)期，愈后不佳。因此，早期診斷、早期治療尤為重要。自身免疫性肝病發(fā)病機(jī)制與免疫功能異常密切相關(guān)，自身抗體在發(fā)病機(jī)制中起重要作用。每種自身免疫性肝病都具有特征性自身抗體譜，自身抗體檢測(cè)對(duì)自身免疫性肝病的診斷、分型及鑒別診斷具有重要意義。近年來(lái)，國(guó)外對(duì)自身免疫性肝病相關(guān)自身抗體譜靶抗原性質(zhì)、臨床診斷應(yīng)用價(jià)值(尤其是無(wú)癥狀期的早期診斷)、與疾病臨床特點(diǎn)及活動(dòng)性的關(guān)系等方面研究進(jìn)展迅速，有關(guān)自身抗體譜的研究已引起臨床高度重視，自身抗體檢測(cè)已成為自身免疫性肝病臨床診斷的常規(guī)檢查項(xiàng)目。近年來(lái)，由于臨床經(jīng)驗(yàn)的積累和實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)我國(guó)人群中自身免疫性肝病患者逐漸增多。國(guó)內(nèi)有關(guān)自身免疫性肝病的發(fā)病機(jī)制、相關(guān)自身抗體靶抗原、病例報(bào)道、臨床病例討論和臨床病理分析的文章逐漸增多，以上的工作說(shuō)明自身免疫性肝病在中國(guó)并不少見(jiàn)。ASMA (抗平滑肌抗體)是I型AIH的標(biāo)志性抗體，約有85%的I型AIH患者中可以檢測(cè)到ASMA，高滴度的ASMA對(duì)I型AIH有重要的診斷意義，可與ASMA陰性的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SIE)相鑒別。ASMA無(wú)器官及種屬特異性，主要為IgG和IgM類型。高滴度的ASMA (>1 160)對(duì)AIH診斷敏感性相當(dāng)高(至少90 % )，高滴度的ASMA還可見(jiàn)于AIH與PBC重疊綜合征患者。大多數(shù)I型AIH患者當(dāng)使用免疫抑制劑治療病情緩解后，血清ASMA的滴度也常常隨之降低，甚至消失。但抗體水平不能預(yù)示疾病的預(yù)后，這表明ASMA不參與AIH的發(fā)病機(jī)制，其診斷價(jià)值大于預(yù)后價(jià)值。臨床上常用間接免疫熒光法(HF)檢測(cè)患者中出現(xiàn)的ASMA，其實(shí)驗(yàn)基質(zhì)為通常為不同靈長(zhǎng)類肝臟、胃、腎臟組織冰凍切片，含有完整的抗原譜，但是對(duì)間接免疫熒光分析法著染得鑒定具有一定的主觀性，因而對(duì)結(jié)果的解釋可能在不同時(shí)間點(diǎn)、不同觀察者之間、新老組織切片之間存在差異，并且需要熒光顯微鏡等儀器的輔助，在一般的中小醫(yī)院難以開展。所以，目前對(duì)抗平滑肌抗體(ASMA)的診斷方法還需進(jìn)一步的改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)自身免疫性肝病相關(guān)抗體ASMA的試劑盒，使用該試劑盒可以定量和定性檢測(cè)ASMA，從而準(zhǔn)確診斷出自身免疫性肝病的類型及嚴(yán)重程度， 指導(dǎo)醫(yī)生用藥；本發(fā)明還公開了使用該試劑盒檢測(cè)ASMA的方法，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好，適用于半自動(dòng)或全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)或肉眼判讀。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案
本發(fā)明所述的檢測(cè)自身免疫性肝病相關(guān)抗體ASMA的試劑盒，包括固相載體，酶標(biāo)二抗工作液，陽(yáng)性對(duì)照品，陰性對(duì)照品，校準(zhǔn)品，樣品稀釋液，底物和洗滌液，所述固相載體為固定有ASMA靶抗原的微孔板、磁微粒或磁球，即將ASMA特異性結(jié)合的靶抗原作為捕獲抗體結(jié)合到相同固相載體上，形成抗原-載體結(jié)合物；所述酶標(biāo)二抗工作液中所用二抗為鼠或羊或兔抗人IgG或/和抗人IgM或/和抗人IgA，所用二抗標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶，吖啶酯、異魯米諾或稀土元素。所述樣品稀釋液由濃度小于10%的氯化鈉緩沖液和濃度小于1%的保護(hù)蛋白組成。所述保護(hù)蛋白為酪蛋白、白蛋白、蛋白胨、明膠、動(dòng)物血清或人血清。所述祀抗原為天然抗原、重組抗原、合成肽、HepG2細(xì)胞、Hep2細(xì)胞、Hela細(xì)胞或細(xì)胞裂解抗原。所述底物為發(fā)光底物或顯色底物。所述發(fā)光底物為發(fā)光底物A和發(fā)光底物B，所述發(fā)光底物A由O. 2M Tris-HCUO. 15mM Luminol.O. 59mM羥基香豆素、O. 35mM沒(méi)食子酸組成；所述發(fā)光底物B由O. 85mM氨基酸氧化酶、O. 8%Tween 20、O. 5mM DTPA、0. 12mM維生素C組成。本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)方法，包括下述步驟
第一步，將待檢測(cè)血清用樣品稀釋液稀釋成血清樣本，分別將陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、校準(zhǔn)品和血清樣本加入到固相載體中孵育，使待測(cè)血清樣本與抗原-載體結(jié)合物接觸，使得血清樣本中的ASMA (如果存在的話)被捕獲，形成抗體-抗原-載體結(jié)合物；如果樣品是血漿時(shí)，需要離心后進(jìn)行檢測(cè)；
第二步，樣本反應(yīng)結(jié)束后，棄去反應(yīng)液，用洗滌液洗板；
第三步，將酶標(biāo)二抗工作液于第二步洗板后加入固相載體的每一反應(yīng)孔中，孵育；該步驟可使酶標(biāo)二抗和上述的抗體-抗原-載體結(jié)合物接觸，反應(yīng)；第四步，反應(yīng)結(jié)束后，棄去反應(yīng)液，用洗滌液洗板；
第五步，加入相應(yīng)的底物(如發(fā)光底物或顯色底物)檢測(cè)，儀器檢測(cè)信號(hào)值來(lái)定性或定量判斷樣本中被測(cè)抗體，或通過(guò)免疫層析或免疫滲濾法肉眼或儀器讀取樣本定性或定量結(jié)果O本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于通過(guò)化學(xué)發(fā)光法或酶標(biāo)法或金標(biāo)法或時(shí)間分辨法或熒光法可以定量和定性檢測(cè)ASMA，當(dāng)ASMA濃度大于或等于lAU/ml時(shí)，可判斷為I型AIH陽(yáng)性，病情嚴(yán)重度與檢測(cè)樣本濃度值正相關(guān)，適用于半自動(dòng)或全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)或肉眼判讀結(jié)果，從而準(zhǔn)確診斷出自身免疫性肝病的類型以及嚴(yán)重程度，指導(dǎo)醫(yī)生用藥，為病人早期診斷、早期治療提供保障。
具體實(shí)施方式

下面分別舉出板式結(jié)構(gòu)試劑盒和磁微粒結(jié)構(gòu)試劑盒，并說(shuō)明其檢測(cè)使用方法。應(yīng)該理解的是，下述實(shí)施例僅用于例證的目的，絕不僅限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I :
本發(fā)明檢測(cè)自身免疫性肝病相關(guān)抗體ASMA的試劑盒(板式)包括
1、靶抗原-載體結(jié)合物的制備將不高于10ug/ml的靶抗原(天然抗原、重組抗原、合成肽、HepG2細(xì)胞、H印2細(xì)胞、Hela細(xì)胞或細(xì)胞裂解抗原)100 μ I加入到96孔板中，4°C包被16-24h或37°C包被2h，之后用配制好的(PBST)洗滌液洗滌兩遍；
2、封閉用50-200 μ I 的含 O. 05-0. 5%Tween20,1_5%BSA，l_5%Casein，1-5% 蛋白胨，5-10%的蔗糖的O. 01-0. IM的磷酸緩沖液，4°C封閉16_24h或37°C封閉2h，之后甩去多余的緩沖液，置于干燥的環(huán)境中晾干，晾干后，密封于2-8°C保存；
3、校準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品的配制取臨床上定值的高值樣本，用校準(zhǔn)品稀釋液(PBS+3%BSA)按不低于I :50倍稀釋，取線性較好的4 8個(gè)點(diǎn)作為校準(zhǔn)品，選擇不低于2AU/ml濃度的校準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照品，選擇OAU/ml濃度的校準(zhǔn)品作為陰性對(duì)照品；
4、酶標(biāo)二抗工作液的配制所述酶標(biāo)二抗工作液中所用二抗為抗人IgG或/和抗人IgM或/和抗人IgA，用酶稀釋液(PBS+l%Casein)按不高于1:200倍稀釋制備酶標(biāo)二抗工作液；所用二抗標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、吖啶酯、異魯米諾或稀土元素。5、組裝將上述96孔抗原包被板一塊，校準(zhǔn)品6X1. Oml,陰性對(duì)照1X1. Oml,陽(yáng)性對(duì)照1X1. Oml,酶標(biāo)二抗工作液IX 12ml，樣品稀釋液(PBS+3%BSA) IX 100ml，濃縮洗液20X50ml(PBST),發(fā)光底物Α(0· 2Μ Tris-HCl.O. 15mM Luminol.O. 59mM羥基香豆素、O. 35mM沒(méi)食子酸)和發(fā)光底物B (O. 85mM氨基酸氧化酶、O. 8%Tween 20、O. 5mM DTPA、0. 12mM維生素C)各lX7ml組裝在一起形成完整的試劑盒。檢測(cè)方法
測(cè)試樣本的處理
血清使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管取靜脈血2-5ml,操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)/min離心IOmin,將血清和紅細(xì)胞迅速小心的分離,血清標(biāo)本保存于2-8 V，在24h內(nèi)不能測(cè)試的標(biāo)本應(yīng)放在-20 V冰箱內(nèi)保存，嚴(yán)重溶血、有絮狀物的血清標(biāo)本會(huì)影響測(cè)試結(jié)果。血漿使用EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝，3000轉(zhuǎn)/min離心30min取上清，保存方法同血清。I、加樣用樣品稀釋液(含有BSA的Tris-NaCl緩沖液)按照1:100稀釋待檢樣本，之后各加入100 μ I不同濃度(I 100AU/ml)的校準(zhǔn)品和100 μ I稀釋后的待檢樣本到靶抗原-載體結(jié)合物中，放入37°C恒溫箱中孵育30min ；
2、洗板樣本反應(yīng)結(jié)束后，棄去反應(yīng)液，用配制好的洗液手工或在自動(dòng)洗板機(jī)洗滌6XImin ；
3、加入酶標(biāo)二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體1:500倍稀釋，向每一反應(yīng)孔中加入100 μ 1，放入37°C恒溫箱中孵育30min ； 4、洗板樣本反應(yīng)結(jié)束后，棄去反應(yīng)液，用配制好的洗液手工或在自動(dòng)洗板機(jī)洗滌6XImin ；
5、加入底物檢測(cè)向每一反應(yīng)孔中加入配制好的發(fā)光底物A和B各50μ1，震蕩混勻后，室溫5min用發(fā)光儀檢測(cè)結(jié)果，以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)發(fā)光值為縱坐標(biāo)，繪制出校準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算待測(cè)樣本的濃度值。當(dāng)計(jì)算出的濃度值小于lAU/ml時(shí)，標(biāo)本呈陰性，說(shuō)明診斷I型AIH陽(yáng)性的可能性比較小。當(dāng)計(jì)算出的濃度值大于或等于lAU/ml時(shí)，標(biāo)本呈陽(yáng)性，說(shuō)明診斷I型AIH陽(yáng)性的可能性比較大。實(shí)施例2:
本發(fā)明所述的檢測(cè)自身免疫性肝病相關(guān)抗體ASMA的試劑盒(磁微粒)包括
1、革巴抗原-載體結(jié)合物的制備取IOmg磁微粒,用磷酸鹽緩沖液洗漆5遍,加入一定量的活化劑活化2h后，洗滌3遍，之后加入O. Img的靶抗原，室溫震蕩包被2h ；
2、封閉用Iml 的含 O. 05-0. 5%Tween20, 1_5%BSA，l_5%Casein，1-5% 蛋白胨，5-10% 的蔗糖的O. 01-0. IM的磷酸緩沖液，室溫振蕩封閉lOmin，連續(xù)封閉四次，之后加入2ml封閉液于2-8°C保存；
3、校準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品的配制取臨床上定值的高值樣本，用校準(zhǔn)品稀釋液(PBS+3%BSA)按不低于I :50倍稀釋，取線性較好的4 8個(gè)點(diǎn)作為校準(zhǔn)品，選擇不低于2AU/ml濃度的校準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照品，選擇OAU/ml濃度的校準(zhǔn)品作為陰性對(duì)照品；
4、酶標(biāo)二抗工作液的配制所述酶標(biāo)二抗工作液中所用二抗為抗人IgG或/和抗人IgM或/和抗人IgA，用酶稀釋液(PBS+l%Casein)按不高于1:200倍稀釋制備酶標(biāo)二抗工作液；所用二抗標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、吖啶酯、異魯米諾或稀土元素。5、試劑盒的組裝將2ml靶抗原-磁微粒結(jié)合物，校準(zhǔn)品6X1. Oml,陰性對(duì)照I X I. Oml,陽(yáng)性對(duì)照I X I. Oml,酶標(biāo)二抗工作液I X 12ml、樣品稀釋液I X 100ml、濃縮洗液20X50ml(PBST)、發(fā)光底物Α((λ 2M Tris-HCl.O. 15mM Luminol.O. 59mM羥基香豆素、O. 35mM沒(méi)食子酸)和發(fā)光底物B (0. 85mM氨基酸氧化酶、0. 8%Tween 20、0. 5mM DTPA、0. 12mM維生素C)各lX7ml組裝在一起即可。檢測(cè)方法
測(cè)試樣本的處理同實(shí)施例I。I、加樣用樣品稀釋液(含有BSA的Tris-NaCl緩沖液)按照1:100稀釋待檢樣本，之后各加入100 μ I不同濃度(I 100AU/ml)的校準(zhǔn)品和100 μ I稀釋后的待檢樣本到反應(yīng)孔中，之后每個(gè)反應(yīng)孔中各加入20 μ I靶抗原-磁微粒結(jié)合物，放入37 °C恒溫箱中孵育15min ；
2、洗板樣本反應(yīng)結(jié)束后，棄去反應(yīng)液，用配制好的洗液手工或在自動(dòng)洗板機(jī)洗滌6XImin ；
3、加入酶標(biāo)二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體1:500倍稀釋，向每一反應(yīng)孔中加入100 μ 1，放入37°C恒溫箱中孵育15min ；
4、洗板樣本反應(yīng)結(jié)束后，棄去反應(yīng)液，用配制好的洗液手工或在自動(dòng)洗板機(jī)洗滌6XImin ；
5、加入底物檢測(cè)向每一反應(yīng)孔中加入配制好的發(fā)光底物A和B各50μ 1，震蕩混勻后，室溫5min用發(fā)光儀檢測(cè)結(jié)果，以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)發(fā)光值為縱坐標(biāo)，繪制出校準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算待測(cè)樣本的濃度值。當(dāng)計(jì)算出的濃度值小于lAU/ml時(shí)，標(biāo)本呈陰性，說(shuō)明診斷I型AIH的可能性比較小。當(dāng)計(jì)算出的濃度值大于或等于lAU/ml時(shí)，標(biāo)本呈陽(yáng)性，說(shuō)明診斷I型AIH的可能性比較大。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)自身免疫性肝病相關(guān)抗體ASMA的試劑盒，包括固相載體，酶標(biāo)二抗工作液，陽(yáng)性對(duì)照品，陰性對(duì)照品，樣品稀釋液，底物和洗滌液，其特征在于所述固相載體為固定有抗ASMA型抗體靶抗原的微孔板、磁微?；虼徘颍凰雒笜?biāo)二抗工作液中所用二抗為鼠或兔或羊抗人IgG或/和抗人IgM或/和抗人IgA，所用二抗標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶，吖啶酯、異魯米諾或稀土元素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)自身免疫性肝病相關(guān)抗體ASMA的試劑盒，其特征在于所述樣品稀釋液由濃度小于10%的氯化鈉緩沖液和小于1%保護(hù)蛋白組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)自身免疫性肝病相關(guān)抗體ASMA的試劑盒，其特征在于所述保護(hù)蛋白為酪蛋白、白蛋白、蛋白胨、明膠、動(dòng)物血清或人血清。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)自身免疫性肝病相關(guān)抗體ASMA的試劑盒，其特征在于所述IE抗原為天然抗原、重組抗原、合成肽、HepG2細(xì)胞、Hep2細(xì)胞、Hela細(xì)胞或細(xì)胞裂解抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)自身免疫性肝病相關(guān)抗體ASMA的試劑盒，其特征在于所述底物為發(fā)光底物或顯色底物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)自身免疫性肝病相關(guān)抗體ASMA的試劑盒，其特征在于所述發(fā)光底物為發(fā)光底物A和發(fā)光底物B，所述發(fā)光底物A由O. 2M Tris-HCUO. 15mMLuminol、O. 59mM輕基香豆素、O. 35mM沒(méi)食子酸組成；所述發(fā)光底物B由O. 85mM氨基酸氧化酶、O. 8%Tween 20、O. 5mM DTPA、0. 12mM 維生素 C 組成。
7.如權(quán)利要求I所述試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于包括下述步驟 第一步，將待檢測(cè)血清用樣品稀釋液稀釋成血清樣本，分別將陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、校準(zhǔn)品和血清樣本加入到固相載體中孵育； 第二步，樣本反應(yīng)結(jié)束后，棄去反應(yīng)液，用洗滌液洗板； 第三步，將酶標(biāo)二抗工作液加入每一反應(yīng)孔中，孵育； 第四步，反應(yīng)結(jié)束后，棄去反應(yīng)液，用洗滌液洗板； 第五步，加入底物檢測(cè)，儀器檢測(cè)信號(hào)值來(lái)定性或定量判斷樣本中被測(cè)抗體，或通過(guò)免疫層析或免疫滲濾法肉眼或儀器讀取樣本定性或定量結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)自身免疫性肝病相關(guān)抗體ASMA的試劑盒，本發(fā)明還公開了使用該試劑盒定量和定性檢測(cè)抗ASMA抗體的方法。通過(guò)使樣品與連有標(biāo)記物的IgG或/和抗人IgM或/和抗人IgA與檢測(cè)抗體所對(duì)應(yīng)的特異性抗原結(jié)合，加入發(fā)光系統(tǒng)或顯色系統(tǒng)或激發(fā)光系統(tǒng)底物后，讀取待檢樣品信號(hào)值，計(jì)算定量或定性結(jié)果或通過(guò)免疫層析或免疫滲濾法肉眼或儀器讀取樣本定量或定性結(jié)果，從而準(zhǔn)確診斷出自身免疫性肝病的類型及嚴(yán)重程度，指導(dǎo)醫(yī)生用藥，該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好，適用于半自動(dòng)或全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)或肉眼判讀。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102955026SQ201210190230
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月11日
發(fā)明者吳學(xué)煒, 何麗, 張學(xué)東, 于林, 楊皓宇, 魯清月, 付光宇, 馬建軍, 劉功成, 項(xiàng)立紅, 渠海, 李桂林 申請(qǐng)人:鄭州安圖綠科生物工程有限公司