一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器及其裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，它包括工作電極、對(duì)電極、參比電極、電解池；所述工作電極為高分子固定的微生物電極，所述高分子固定的微生物電極為電極和包覆在電極外的高分子細(xì)菌混合層；所述高分子材料為明膠或殼聚糖，所述細(xì)菌為大腸桿菌和/或酵母菌，所述電極為玻碳電極、金電極、鉑電極或硼摻雜金剛石薄膜電極。本發(fā)明還公開了可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器的裝置。本發(fā)明的電化學(xué)傳感器可即時(shí)監(jiān)測(cè)水體生物毒性的改變和檢測(cè)水體生物毒性大小，達(dá)到即時(shí)、在線、連續(xù)的檢測(cè)，具有分析靈敏度高、成本低廉、操作簡單、便于攜帶等特點(diǎn)。
【專利說明】—種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器及其裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境監(jiān)測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器及其裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著近代工業(yè)的發(fā)展，日益增多的環(huán)境污染給水生態(tài)系統(tǒng)造成了很大的沖擊，對(duì)其進(jìn)行毒性檢測(cè)已經(jīng)成為評(píng)價(jià)水環(huán)境質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。目前，用于污染物毒性測(cè)試的方法主要有理化方法和生物學(xué)方法。理化方法諸如液相色譜、原子吸收光譜等，可以精確定量分析某一種或某一類污染物的含量；但污染物對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的綜合影響往往不是每種單一物質(zhì)毒性的簡單相加，因此這些方法不能直接、全面地反映有毒物質(zhì)對(duì)環(huán)境的綜合影響。生物學(xué)方法是通過檢測(cè)毒性物質(zhì)對(duì)生物生理行為的改變，進(jìn)而反映水體毒性大小，其能較全面地反映廢水中復(fù)合污染物的聯(lián)合毒性作用，并能充分了解各種環(huán)境因子(如PH值、溫度、溶解度等)對(duì)污染物毒性效應(yīng)的具體影響，有很大的優(yōu)勢(shì)。因此，在水污染研究中，作為常規(guī)理化方法的有效補(bǔ)充，使用生物學(xué)方法進(jìn)行生物毒性檢測(cè)已經(jīng)成為監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)水體環(huán)境質(zhì)量的重要手段之一。
[0003]微生物實(shí)驗(yàn)本身具有實(shí)驗(yàn)周期短、對(duì)環(huán)境變化靈敏、成本低廉等特點(diǎn)，其特別適合用來進(jìn)行生物毒性檢測(cè)。目前應(yīng)用最廣泛的微生物實(shí)驗(yàn)是，作為國標(biāo)方法的發(fā)光細(xì)菌法檢測(cè)生物毒性，通過檢測(cè)有毒物質(zhì)對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的抑制效果來反應(yīng)水體毒性大小，該方法較成熟，市場(chǎng)上也有一系列的相關(guān)儀器問世；但其檢測(cè)易于被水體本身的濁度影響，并且儀器成本較高。此外，還有通過微生物生化需氧量來判斷污染的程度；但生物需氧量通常需要將水樣充滿完全密閉的溶解氧瓶中，在20°C的暗處培養(yǎng)5d，這樣會(huì)使得生物毒性的檢測(cè)滯后，人們不能及時(shí)對(duì)疑似毒性水體進(jìn)行控制。
[0004]電化學(xué)法具有靈敏度高、易于在線檢測(cè)、與現(xiàn)代分析儀器兼容性好等特點(diǎn)，利用電化學(xué)方法來進(jìn)行即時(shí)監(jiān)測(cè)及檢測(cè)水體生物毒性有著廣泛的應(yīng)用前景，受到越來越多的關(guān)注。因此，需要提供一種新型的檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器；它包括工作電極、對(duì)電極、參比電極、電解池；所述工作電極為高分子固定的微生物電極；它可進(jìn)行即時(shí)監(jiān)測(cè)水體生物毒性的改變和檢測(cè)水體生物毒性大小，達(dá)到即時(shí)、在線、連續(xù)的檢測(cè)，具有分析靈敏度高、成本低廉、操作簡單、便于攜帶等特點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器的裝置。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，它包括工作電極、對(duì)電極、參比電極、電解池；[0008]所述工作電極為高分子固定的微生物電極，所述高分子固定的微生物電極為電極和包覆在電極外的高分子細(xì)菌混合層，所述高分子細(xì)菌混合層是高分子材料溶液、細(xì)菌和交聯(lián)劑的混合物；所述高分子材料為明膠或殼聚糖，所述細(xì)菌為大腸桿菌和/或酵母菌，所述電極為玻碳電極、金電極、鉬電極或硼摻雜金剛石薄膜電極；
[0009]所述電解池中加入細(xì)菌呼吸營養(yǎng)溶液。
[0010]對(duì)電極和參比電極可分別選自常用的對(duì)電極和參比電極。例如，對(duì)電極為鉬電極、碳對(duì)電極等；參比電極為銀/氯化銀電極、甘汞電極等。
[0011]細(xì)菌呼吸營養(yǎng)溶液為常規(guī)選取即可。例如，本申請(qǐng)中使用的細(xì)菌呼吸營養(yǎng)溶液為pH=7.0、0.01M磷酸鹽緩沖液中含有10mmol/L乳酸鈉、10mmol/L 丁二酸鈉、10mmol/L葡萄糖。
[0012]進(jìn)一步地，該電化學(xué)傳感器監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性時(shí)，通過在恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ较?，設(shè)定工作電壓，待背景電流穩(wěn)定后，加入苯醌，電流經(jīng)變化后逐漸平穩(wěn)，之后加入待檢測(cè)液記錄電流的改變，進(jìn)行即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體的生物毒性。
[0013]優(yōu)選地，加入苯醌至苯醌濃度為0.1mlTl.0mM。
[0014]進(jìn)一步地，設(shè)定工作電壓為0.2v、.7v。
[0015]優(yōu)選地，所述電極經(jīng)過特殊方法制備，使得檢測(cè)時(shí)不需要再添加任何試劑的電極，為無試劑型電極；所述無試劑型電極是將玻碳電極、金電極、鉬電極或硼摻雜金剛石薄膜電極進(jìn)行處理后得到的電極；所述處理是取0.lg^l.0g憎水性高分子材料和0.1-0.5g苯醌溶于IOml四氫呋喃或氯仿中，攪拌均勻，將該溶液滴涂在拋光過的電極上，得到無試劑型電極。
[0016]使用無試劑型電極的工作電極，稱為高分子固定的無試劑型微生物工作電極，簡稱無試劑型工作電極。
[0017]優(yōu)選地，所述憎水性高分子材料為聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯。
[0018]進(jìn)一步地，該電化學(xué)傳感器監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性時(shí)，通過在恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ较?，設(shè)定工作電壓，待背景電流穩(wěn)定后，加入待檢測(cè)液，記錄電流的改變，進(jìn)行即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體的生物毒性。
[0019]優(yōu)選地，所述高分子材料溶液是高分子材料溶解在磷酸鹽緩沖液中得到的質(zhì)量濃度為10mg/ml~100mg/ml的溶液。
[0020]優(yōu)選地，所述細(xì)菌的菌液稀釋20倍后在600nm處的吸光度為0.4^0.8。
[0021 ] 優(yōu)選地，所述高分子材料溶液與細(xì)菌菌液按體積比為1: 3~3:1混合。
[0022]優(yōu)選地，當(dāng)所述細(xì)菌為大腸桿菌和酵母菌時(shí)，兩者的菌液體積比為5: f 1:5。
[0023]可選用常用的交聯(lián)劑對(duì)高分子材料溶膠與細(xì)菌菌液進(jìn)行交聯(lián)。優(yōu)選地，所述交聯(lián)劑是醛類交聯(lián)劑。更優(yōu)選地，所述交聯(lián)劑是戊二醛、甲醛或乙二醛。最優(yōu)選地，所述交聯(lián)劑為2.5%戊二醛。
[0024]進(jìn)一步地，所述工作電極是通過下列步驟制備的:
[0025]I)將高分子材料在20°C~80°C條件下溶解在磷酸鹽緩沖液中，得到質(zhì)量濃度為lOmg/ml^lOOmg/ml的高分子材料溶液；
[0026]2)將所述高分子材料溶液與細(xì)菌菌液按體積比為1: 3~3:1的比例混合均勻，得到高分子材料與細(xì)菌的混合液；[0027]3)取步驟2)的混合液，滴加于電極或無試劑型電極上，單位面積滴涂量為5^40 μ L/cm2,干燥，然后浸入交聯(lián)劑中進(jìn)行交聯(lián)處理，之后用磷酸鹽緩沖液清洗，干燥，得到工作電極。
[0028]所述交聯(lián)處理可選用常用的交聯(lián)劑對(duì)高分子材料溶膠與細(xì)菌菌液進(jìn)行交聯(lián)。優(yōu)選地，交聯(lián)劑是醛類交聯(lián)劑。更優(yōu)選地，交聯(lián)劑是戊二醛、甲醛或乙二醛。最優(yōu)選地，交聯(lián)處理是將滴加了混合液的電極浸入2.5%戊二醛的水溶液中3~5分鐘后取出。
[0029]選取使用的磷酸鹽緩沖液為本領(lǐng)域的公知常識(shí)，通常pH為6.0-8.0,濃度為0.01M0
[0030]若要更精準(zhǔn)的確定毒性的大小，可在加入苯醌溶液之后，待電流平穩(wěn)后，記錄此時(shí)的穩(wěn)態(tài)電流為I1，加入待檢測(cè)溶液后的穩(wěn)態(tài)電流為i2，通過計(jì)算加入待檢測(cè)溶液前后，電流的抑制率進(jìn)行判斷，抑制率公式為:
[0031]抑制率
[0032]其他條件相同，若僅改變待檢測(cè)溶液的種類，抑制率越大，表明毒性越大；抑制率越小，表明毒性越小。
[0033]在建立三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置時(shí),所述微生物電極與電解池之間用橡膠密封圈，工作電極的外徑不小于橡膠密封圈的外徑。
[0034]本發(fā)明的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器的原理是:作為電子介體的苯醌，可以被微生物的呼吸作用還原為酚，所述酚是一種具有電化學(xué)活性的物質(zhì)，能夠在一定電壓下進(jìn)行電化學(xué)氧化，再生成醌，并且產(chǎn)生電化學(xué)氧化電流信號(hào)。所述酚的電化學(xué)氧化電流信號(hào)與微生物的呼吸作用強(qiáng)度成正向關(guān)系；當(dāng)水中存在有毒物質(zhì)時(shí)，對(duì)微生物產(chǎn)生毒害作用，抑制微生物的 呼吸作用，進(jìn)而會(huì)使呼吸作用產(chǎn)生的酚的電化學(xué)氧化電流信號(hào)減弱，通過監(jiān)測(cè)電流信號(hào)的改變及其大小，便可反應(yīng)水體中毒性物質(zhì)生物毒性的改變與大小。
[0035]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器的裝置，包括:盒體1、盒蓋2、電解池3、絲網(wǎng)印刷電極4、便攜式電化學(xué)工作站5 ;其中，電解池3、絲網(wǎng)印刷電極4、便攜式電化學(xué)工作站5放置在盒體I內(nèi)；所述絲網(wǎng)印刷電極4的工作電極為高分子固定的微生物電極或高分子固定的無試劑型微生物電極。
[0036]進(jìn)一步地，該裝置還包括放置在盒體I內(nèi)的數(shù)據(jù)線6。
[0037]在使用時(shí)，將樣品經(jīng)電解池3上的樣品進(jìn)樣口加入電解池3中。絲網(wǎng)印刷電極4的一端插入電解池3中，另一端經(jīng)數(shù)據(jù)線6連接至便攜式電化學(xué)工作站5的一端。便攜式電化學(xué)工作站5的另一端連接至數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)7，以便處理數(shù)據(jù)。
[0038]更方便地，便攜式電化學(xué)工作站5為便攜式即插式工作站，即它的一端設(shè)置有與絲網(wǎng)印刷電極4相應(yīng)的接觸端，這樣無需數(shù)據(jù)線6，就可將絲網(wǎng)印刷電極4和便攜式即插式電化學(xué)工作站5相連，操作更簡便。
[0039]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0040]1、本發(fā)明的電化學(xué)傳感器可即時(shí)監(jiān)測(cè)水體生物毒性的改變和檢測(cè)水體生物毒性大小，達(dá)到即時(shí)、在線、連續(xù)的檢測(cè)，具有分析靈敏度高、成本低廉、操作簡單、便于攜帶等特點(diǎn)。
[0041]2、本發(fā)明中提出的固定電子介體-苯醌于微生物電極于一體的方法，即使用無試劑型工作電極的電化學(xué)傳感器，省去了向溶液中加入苯醌并等待電流穩(wěn)定的步驟，縮短了檢測(cè)的步驟，同時(shí)還減少了苯醌的消耗量，這樣能避免苯醌對(duì)檢測(cè)樣品或者參比電極的污染等等，且易于電化學(xué)傳感器的儀器化和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，易于檢測(cè)設(shè)備的小型化、便攜化，提高檢測(cè)的方便性及速度，可以用于無試劑的檢測(cè)，并可作成一次性電極使用。
[0042]3、與CellSense傳感器把大腸桿菌直接滴在電極上干燥后用多孔膜蓋住相比，本發(fā)明的電化學(xué)傳感器采用具有良好生物兼容性的明膠和殼聚糖作為菌體的固定物質(zhì)，使其與大腸桿菌和/或酵母菌進(jìn)行混合，提供給菌體良好的生物微環(huán)境，有效的保持了菌體活性，本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的電極壽命至少可以達(dá)到一個(gè)月。
[0043]4、從傳感器的可修飾性上來說，CellSense傳感器的可修飾性不強(qiáng)，因?yàn)榫w是直接涂在電極上的；而本發(fā)明的電化學(xué)傳感器，可以針對(duì)明膠或殼聚糖進(jìn)行一些修飾，來進(jìn)一步提高電極的性能。例如，可以通過在明膠或殼聚糖中分散納米顆粒來修飾微生物電極，以加快微生物與電極之間的電子傳遞，為微生物提供更優(yōu)良的微環(huán)境，進(jìn)一步提高傳感器的性能。
[0044]5、在進(jìn)行水體生物毒性檢測(cè)時(shí)，只需本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的裝置即可完成檢測(cè)，方便快捷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1是本發(fā)明的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器進(jìn)行即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的原理示意圖；
[0046]圖2為實(shí)施例1的水體毒性即時(shí)監(jiān)測(cè)圖；
[0047]圖3為實(shí)施例1的水體毒性檢測(cè)圖；
[0048]圖4為實(shí)施例1、2、3、4的毒性檢測(cè)結(jié)果比較；
[0049]圖5為實(shí)施例5的水體毒性檢測(cè)圖；
[0050]圖6為實(shí)施例實(shí)施例5、6、7的毒性檢測(cè)結(jié)果比較；
[0051 ]圖7為實(shí)施例8的水體毒性檢測(cè)圖；
[0052]圖8為實(shí)施例8、9、10、11的毒性檢測(cè)結(jié)果比較；
[0053]圖9為實(shí)施例12的水體毒性檢測(cè)圖；
[0054]圖10為實(shí)施例12、13、14、15的水體毒性檢測(cè)結(jié)果比較；
[0055]圖11為實(shí)施例16的水體毒性檢測(cè)曲線；
[0056]圖12為實(shí)施例16、17、18、19的水體毒性檢測(cè)結(jié)果比較；
[0057]圖13為實(shí)施例20的水體毒性檢測(cè)曲線；
[0058]圖14為實(shí)施例20、21、22、23的水體毒性檢測(cè)結(jié)果比較。
[0059]圖15為實(shí)施例26的水體毒性檢測(cè)曲線；
[0060]圖16為實(shí)施例27的水體毒性檢測(cè)曲線；
[0061]圖17為實(shí)施例28的水體毒性檢測(cè)曲線；
[0062]圖18為實(shí)施例29的水體毒性檢測(cè)曲線；
[0063]圖19為實(shí)施例30的水體毒性檢測(cè)曲線；
[0064]圖20為實(shí)施例33的電化學(xué)傳感器裝置的示意圖；
[0065]圖21為工作電極的示意圖；[0066]圖22為電化學(xué)傳感器裝置的工作連接示意圖；
[0067]圖23為使用便攜式即插式電化學(xué)工作站時(shí)的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0068]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。
[0069]圖1是本發(fā)明的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器進(jìn)行即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的原理示意圖。
[0070]實(shí)施例1
[0071]一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器:[0072]一、高分子固定的微生物電極的制備
[0073]將市售的片狀玻碳(glassy carbon,GC)用1000目金相砂紙打磨10分鐘后,依次用0.3μΜ、0.15μΜ、0.01μπι a-Al2O3拋光成鏡面，再依次用IOml的去離子水(本發(fā)明中的各實(shí)施例中所用的水均由Millipore Mill1-Q純水儀制備)、乙醇、丙酮各超聲10分鐘，置于空氣中晾干，得到拋光成鏡面的片狀玻碳(0.7cmX0.7cm)作為平板電極基底。
[0074]大腸桿菌培養(yǎng)液為在50ml去離子水中，加入0.25g氯化鈉、0.15g酵母菌提取物和0.5g蛋白胨。用0.1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)液濃度為pH=7.0后，在高壓滅菌鍋中滅菌。
[0075]用磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和水配制pH=7.0,0.01M磷酸鹽緩沖液。
[0076]用接種環(huán)取定量大腸桿菌(E.coli)純菌種(中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所抗菌中心提供)接種于50ml細(xì)菌培養(yǎng)液，在37°C恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16小時(shí)，然后在5000rpm下，離心10分鐘得到濕菌體，然后用磷酸鹽緩沖液沖洗、離心10分鐘兩次，最后得到的濕菌體根據(jù)其在紫外分光光度計(jì)測(cè)試在600nm處的吸光度值，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)，使稀釋了 20倍的菌液的吸光值達(dá)到0.4^0.8。
[0077]稱取0.05g明膠，在37°C下溶解在lml、0.01M的磷酸鹽緩沖液中，得到明膠溶液，將所述的明膠溶液與所述的菌液按1:1的比例混合均勻，得到明膠與大腸桿菌的混合溶液。取SyL所述的混合溶液，滴加于拋光過的玻碳平板電極上，在室溫下干燥。然后浸入
2.5%戊二醛的水溶液中5分鐘，取出后用pH=7.0,0.01M磷酸鹽緩沖液清洗兩次，室溫干燥，得到所述的明膠固定的大腸桿菌微生物電極。
[0078]二、電化學(xué)傳感器用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性
[0079]三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的組裝:
[0080]在一底部有圓形小孔的電解池的底部外面，通過一個(gè)不銹鋼架子固定有一所述的明膠固定微生物的電極，在該明膠固定微生物的電極的另一面相接有一不銹鋼底板；所述明膠固定微生物的電極與所述電解池之間用橡膠密封圈(橡膠密封圈的外徑不大于工作電極的邊長，墊圈直徑為3mm)進(jìn)行密封；將作為對(duì)電極的鉬電極和作為參比電極的銀/氯化銀電極置于所述電解池之中，以所述的明膠固定微生物的電極作為工作電極；電化學(xué)檢測(cè)裝置組裝完成后，由下到上依次為不銹鋼底板、工作電極、橡膠密封圈、電解池。
[0081]細(xì)菌呼吸作用的營養(yǎng)溶液為pH=7.0、0.01M磷酸鹽緩沖液中含有l(wèi)Ommol/L乳酸鈉、10mmol/L 丁二酸鈉、10mmol/L 葡萄糖。
[0082]1、對(duì)水體毒性的即時(shí)監(jiān)測(cè)
[0083]將實(shí)施例1制備的微生物電極作為工作電極，鉬電極為對(duì)電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置通過電機(jī)線與電化學(xué)工作站(美國普林斯頓Potetentiostat/Galvanostat Model 263A)連接。向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的電解池中加入IOml細(xì)菌呼吸作用的營養(yǎng)溶液，確保所述的參比電極和對(duì)電極的前端浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為0.31V (vs.Ag/AgCl)，開始恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待背景電流穩(wěn)定后，加入苯醌溶液，加入后體系中苯醌濃度為0.4mM,電流急劇上升，然后慢慢下降，待電流逐漸平穩(wěn)后，加入Cu2+至Cu2+在體系中的濃度為40 μ g/ml,記錄電流的改變。
[0084]如圖2中所示，可以看到加入Cu2+后20秒內(nèi)穩(wěn)態(tài)電流迅速降低，表明制備的電極可以在很短的時(shí)間內(nèi)顯示水體中毒性物質(zhì)濃度的突變。
[0085]2、對(duì)重金屬離子生物毒性評(píng)價(jià)
[0086]將實(shí)施例1制備的微生物電極作為工作電極，鉬電極為對(duì)電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置通過電機(jī)線與電化學(xué)工作站連接。向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的電解池中加入IOml配好的營養(yǎng)溶液，確保所述的參比電極和對(duì)電極的前端浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑瑢?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為0.31V(vs.Ag/AgCl)，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待背景電流穩(wěn)定后，加入苯醌溶液，加入后體系中苯醌濃度為0.4mM,電流急劇上升，然后慢慢下降，待電流逐漸平穩(wěn)后，加入Cu2+至Cu2+在體系中的濃度為80 μ g/ml，記錄電流的改變，如圖3中所示。
[0087]使用抑制率來計(jì)算加入的Cu2+的生物毒性大小，抑制率公式為:
[0088]抑制率(％)=1-“/%，
[0089]加入重金屬離子前的電流為I1，加入重金屬離子后的穩(wěn)態(tài)電流i2。通過計(jì)算，Cu2+的抑制率為41.92%。
[0090]實(shí)施例2
[0091]操作方法和步驟同實(shí)施例1中的對(duì)重金屬離子生物毒性評(píng)價(jià),唯一的變化是:向體系中加入Hg2+至Hg2+在體系中的濃度為80 μ g/ml，檢測(cè)80 μ g/ml的Hg2+的生物毒性大小，通過計(jì)算，Hg2+的抑制率為71.9%，
[0092]實(shí)施例3
[0093]操作方法和步驟同實(shí)施例1中的對(duì)重金屬離子生物毒性評(píng)價(jià)，唯一的變化是:向體系中加入Zn2+至Zn2+在體系中的濃度為80 μ g/ml，檢測(cè)80 μ g/ml的Zn2+的生物毒性大小，通過計(jì)算，Zn2+的抑制率為31.17%，
[0094]實(shí)施例4
[0095]操作方法和步驟同實(shí)施例2中的對(duì)重金屬離子生物毒性評(píng)價(jià)，唯一的變化是:向體系中加入Ni2+至Ni2+在體系中的濃度為80 μ g/ml，檢測(cè)80 μ g/ml的Ni2+的生物毒性大小，通過計(jì)算，Ni2+的抑制率為28.4%，。
[0096]圖4為實(shí)施例1、2、3、4中Cu2+、Hg2+、Zn2+、Ni2+的毒性檢測(cè)結(jié)果比較，從圖中可以看出，相同條件下，Hg2+造成的生物毒性最大，Cu2+次之，Zn2+和Ni2+較小。
[0097]實(shí)施例5
[0098]操作方法和步驟同實(shí)施例1中的對(duì)重金屬離子生物毒性評(píng)價(jià)，唯一的變化是:向體系中加入Cu2+與Zn2+的混合物(Cu2+與Zn2+的濃度都為40 μ g/ml)檢測(cè)Cu2+與Zn2+的混合物的生物毒性大小，通過計(jì)算，抑制率為66.2%，如圖5中所示。
[0099]實(shí)施例6
[0100]操作方法和步驟同實(shí)施例1中的對(duì)重金屬離子生物毒性評(píng)價(jià)，唯一的變化是:向體系中加入Cu2+與Ni2+的混合物(Cu2+與Ni2+的濃度都為40 μ g/ml)檢測(cè)Cu2+與Ni2+的混合物的生物毒性大小,通過計(jì)算,抑制率為60.6%,
[0101]實(shí)施例7
[0102]操作方法和步驟同實(shí)施例1中的對(duì)重金屬離子生物毒性評(píng)價(jià),唯一的變化是:向體系中加入Zn2+與Ni2+的混合物(Zn2+與Ni2+的濃度都為40 μ g/ml)檢測(cè)Zn2+與Ni2+的混合物的生物毒性大小，通過計(jì)算，抑制率為27.6%，
[0103]圖6為實(shí)施例5、6、7中Cu2+和Zn2+、Cu2+和Ni2+、Zn2+和Ni2+的毒性檢測(cè)結(jié)果比較，從圖中可以看出，相同條件下，Cu2+和Zn2+造成的生物毒性最大，Cu2+和Ni2+次之，Zn2+和Ni2+較小。
[0104]實(shí)施例8
[0105]一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器:
[0106]一、高分子固定的微生物電極的制備
[0107]將市售的片狀金用1000目金相砂紙打磨10分鐘后，依次用0.3 μ Μ、0.15 μ M、0.01 μ Hia-Al2O3打磨，再依次用IOml的去離子水、乙醇、丙酮各超聲10分鐘，置于空氣中晾干，然后在lmol/L硫酸溶液中，在-0.5v到2v范圍內(nèi)，掃速lOOmv/s進(jìn)行循環(huán)伏安掃描3分鐘，以消除表面可能存在的金的氧化物，最后用去離子水沖洗干凈，室溫下晾干，得到的片狀金(0.7cmX0.7cm)作為平板電極基底。
[0108]細(xì)菌培養(yǎng)液為在50ml去離子水中，加入0.25g氯化鈉、0.15g酵母菌提取物和0.5g蛋白胨，用0.1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)液濃度為pH=7.0后，在高壓滅菌鍋中滅菌。
[0109]用磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和水配制pH=7.0,0.0lM磷酸鹽緩沖液。
[0110]用接種環(huán)取定量大腸桿菌(E.coli)純菌種接種于50ml細(xì)菌培養(yǎng)液，37°C下，在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16小時(shí)，然后在5000rpm下，離心10分鐘得到濕菌體，然后用磷酸鹽緩沖液沖洗、離心10分鐘兩次，最后得到的濕菌體根據(jù)其在紫外分光光度計(jì)測(cè)試在600nm處的吸光度值，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)，使菌液的密度達(dá)到固定值。
[0111]稱取0.05g明膠，在37 °C下溶解在Iml、0.0lM磷酸鹽緩沖液中，得到明膠溶液，將所述明膠溶液與所述菌液按1:1的比例混合均勻，得到明膠與大腸桿菌的混合溶液。取8 μ L所述的混合溶液，滴加于清洗過的金平板電極上，在室溫下干燥。然后浸入2.5%戊二醛的水溶液中5分鐘，取出后用pH=7.0,0.0lM磷酸鹽緩沖液清洗兩次，室溫干燥，得到明膠固定的大腸桿菌微生物電極。
[0112]二、電化學(xué)傳感器用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性
[0113]三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的組裝:同實(shí)施例1。
[0114]細(xì)菌呼吸作用的營養(yǎng)溶液:同實(shí)施例1。
[0115]將實(shí)施例8制備的微生物電極作為工作電極，鉬電極為對(duì)電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置通過電機(jī)線與電化學(xué)工作站連接。向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的電解池中加入IOml配好的營養(yǎng)溶液，確保所述的參比電極和對(duì)電極的前端浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為0.31V(vs.Ag/AgCl)，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待背景電流穩(wěn)定后，加入苯醌溶液，加入后體系中苯醌濃度為0.4mM,電流急劇上升，然后慢慢下降，待電流逐漸平穩(wěn)后，
[0116]加入Ni2+，加入后Ni2+離子在體系中的濃度為80μ g/ml，記錄電流的改變。使用抑制率來計(jì)算加入的Ni2+的生物毒性大小，抑制率計(jì)算公式和方法與實(shí)施例1中相同。通過計(jì)算，Ni2+的抑制率為30.1%，如圖7所示。
[0117]實(shí)施例9
[0118]操作方法和步驟同實(shí)施例8，唯一的變化是:向體系中加入Hg2+至Hg2+在體系中的濃度為80 μ g/ml，檢測(cè)80 μ g/ml的Hg2+的生物毒性大小，通過計(jì)算，Hg2+的抑制率為79.8%。
[0119]實(shí)施例10
[0120]操作方法和步驟同實(shí)施例8，唯一的變化是:向體系中加入Zn2+至Zn2+在體系中的濃度為80 μ g/ml，檢測(cè)80 μ g/ml的Zn2+的生物毒性大小，通過計(jì)算，Zn2+的抑制率為43.2%。
[0121]實(shí)施例11
[0122]操作方法和步驟同實(shí)施例8，唯一的變化是:向體系中加入Cu2+至Cu2+在體系中的濃度為80 μ g/ml，檢測(cè)80 μ g/ml的Cu2+的生物毒性大小，通過計(jì)算，Cu2+的抑制率為51.3%。
[0123]圖8為實(shí)施例8、9、10、11中Cu2+、Hg2+、Zn2+、Ni2+的毒性檢測(cè)結(jié)果比較，從圖中可以看出，相同條件下，Hg2+造成的生物毒性最大，Cu2+次之，Zn2+和Ni2+較小。
[0124]實(shí)施例12
[0125]一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器:
[0126]一、高分子固定的微生物電極的制備
[0127]將市售的鉬片用1000目金相砂紙打磨10分鐘后，依次用(λ 3μΜ、(λ 15 μ Μ、0.01 μ ma-Al2O3打磨，再依次用IOml的去離子水、乙醇、丙酮各超聲10分鐘，置于空氣中晾干，然后在0.5mol/L硫酸溶液中，在-0.3v到1.3v范圍內(nèi)，掃速lOOmv/s進(jìn)行循環(huán)伏安掃描3分鐘，以消除表面可能存在的氧化物。最后用去離子水沖洗干凈，室溫下晾干，得到的片狀鉬作為平板電極基底。
[0128]細(xì)菌培養(yǎng)液為在50ml去離子水中，加入0.25g氯化鈉、0.15g酵母菌提取物和0.5g蛋白胨。用0.1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)液濃度為pH=7.0后，在高壓滅菌鍋中滅菌。
[0129]用磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和水配制pH=7.0、0.0lM磷酸鹽緩沖液。
[0130]用接種環(huán)取定量大腸桿菌(E.coli)純菌種接種于50ml細(xì)菌培養(yǎng)液，37°C下，在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16小時(shí)，然后在5000rpm下，離心10分鐘得到濕菌體，然后用磷酸鹽緩沖液沖洗、離心10分鐘兩次，最后得到的濕菌體根據(jù)其在紫外分光光度計(jì)測(cè)試在600nm處的吸光度值，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)，使菌液的密度達(dá)到固定值。
[0131]稱取0.05g明膠，在37°C下溶解在Iml 0.0lM磷酸鹽緩沖液中，得到明膠溶液，將所述明膠溶液與所述菌液按1:1的比例混合均勻，得到明膠與大腸桿菌的混合溶液。取8μ L所述的混合溶液，滴加于清洗過的鉬平板電極上，在室溫下干燥。然后浸入2.5%戊二醛的水溶液中5分鐘，取出后用pH=7.0,0.0lM磷酸鹽緩沖液清洗兩次，室溫干燥，得到所述的明膠固定的大腸桿菌微生物電極。
[0132]二、電化學(xué)傳感器用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性[0133]三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的組裝:同實(shí)施例1。
[0134]細(xì)菌呼吸作用的營養(yǎng)溶液:同實(shí)施例1。
[0135]將實(shí)施例12制備的微生物電極作為工作電極，鉬電極為對(duì)電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置通過電機(jī)線與電化學(xué)工作站連接。向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的電解池中加入IOml配好的營養(yǎng)溶液，確保所述的參比電極和對(duì)電極的前端浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑瑢?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為0.31V(vs.Ag/AgCl)，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待背景電流穩(wěn)定后，加入苯醌溶液，加入后體系中苯醌濃度為0.4mM,電流急劇上升，然后慢慢下降，待電流逐漸平穩(wěn)后，
[0136]加入Zn2+，加入后Zn2+離子在體系中的濃度為80μ g/ml，記錄電流的改變。依靠抑制率來計(jì)算加入的Zn2+的生物毒性大小，抑制率計(jì)算公式和方法與實(shí)施例1中相同。通過計(jì)算，Zn2+的抑制率為57.2%，如圖9所示。
[0137]實(shí)施例13
[0138]操作方法和步驟同實(shí)施例12，唯一的變化是:向體系中加入Hg2+至Hg2+在體系中的濃度為80 μ g/ml,檢測(cè)80 μ g/ml的Hg2+的生物毒性大小,通過計(jì)算，Hg2+的抑制率為76.7%。
[0139]實(shí)施例14
[0140]操作方法和步驟同實(shí)施例12，唯一的變化是:向體系中加入Cu2+至Cu2+在體系中的濃度為80 μ g/ml，檢測(cè)80 μ g/ml的Cu2+的生物毒性大小，通過計(jì)算，Cu2+的抑制率為57.2%,
[0141]實(shí)施例15
[0142]操作方法和步驟同實(shí)施例12，唯一的變化是:向體系中加入Ni2+至Ni2+在體系中的濃度為80 μ g/ml，檢測(cè)80 μ g/ml的Ni2+的生物毒性大小，通過計(jì)算，Ni2+的抑制率為35.1%。
[0143]圖10為實(shí)施例12、13、14、15中Cu2+、Hg2+、Zn2+、Ni2+的毒性檢測(cè)結(jié)果比較，從圖中可以看出，相同條件下，Hg2+造成的生物毒性最大，Cu2+次之，Zn2+和Ni2+較小。
[0144]實(shí)施例16
[0145]一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器:
[0146]一、高分子固定的微生物電極的制備
[0147]硼摻雜金剛石薄膜是通過熱絲化學(xué)氣相沉積方法(熱絲化學(xué)氣相沉積裝置由上海交通大學(xué)交友鉆石涂層有限公司、上海東貝真空設(shè)備有限公司聯(lián)合研制)，在硅(100)片上沉積硼摻雜微米級(jí)金剛石顆粒而成，所述硼摻雜金剛石薄膜被切割成5_*5_的正方形。將上述硼摻雜金剛石薄膜依次在IOml的水、乙醇、丙酮中各超聲10分鐘洗凈后，在空氣中晾干，得到的硼摻雜金剛石薄膜電極作為平板電極基底。
[0148]細(xì)菌培養(yǎng)液為在50ml去離子水中，加入0.25g氯化鈉、0.15g酵母菌提取物和0.5g蛋白胨。用0.1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)液濃度為pH=7.0后，在高壓滅菌鍋中滅菌。
[0149]用磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和水配制pH=7.0,0.0lM磷酸鹽緩沖液。
[0150]用接種環(huán)取定量大腸桿菌純菌種接種于50ml細(xì)菌培養(yǎng)液，37°C下，在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16小時(shí)，然后在5000rpm下，離心10分鐘得到濕菌體，然后用磷酸鹽緩沖液沖洗、離心10分鐘兩次，最后得到的濕菌體根據(jù)其在紫外分光光度計(jì)測(cè)試在600nm處的吸光度值，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)，使菌液的密度達(dá)到固定值。
[0151]稱取0.05g明膠，在37°C下溶解在Iml 0.0lM磷酸鹽緩沖液中，得到明膠溶液，將所述明膠溶液與所述菌液按1:1的比例混合均勻，得到明膠與大腸桿菌的混合溶液。取8 μ L所述的混合溶液，滴加于清洗過的硼摻雜金剛石薄膜平板電極上，在室溫下干燥。然后浸入2.5%戊二醛的水溶液中5分鐘，取出后用pH=7.0,0.0lM磷酸鹽緩沖液清洗兩次，室溫干燥，得到所述的明膠固定的大腸桿菌微生物電極。
[0152]二、電化學(xué)傳感器用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性
[0153]三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的組裝:同實(shí)施例1。
[0154]細(xì)菌呼吸作用的營養(yǎng)溶液:同實(shí)施例:1。
[0155]將實(shí)施例16制備的微生物電極作為工作電極，鉬電極為對(duì)電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置通過電機(jī)線與電化學(xué)工作站連接。向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的電解池中加入IOml配好的營養(yǎng)溶液，確保所述的參比電極和對(duì)電極的前端浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為0.31V(vs.Ag/AgCl)，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待背景電流穩(wěn)定后，加入苯醌溶液，加入后體系中苯醌濃度為0.4mM,電流急劇上升，然后慢慢下降，待電流逐漸平穩(wěn)后，加入Hg2+，加入后Hg2+離子在體系中的濃度為80 μ g/ml，記錄電流的改變。依靠抑制率來計(jì)算加入的Hg2+的生物毒性大小，抑制率計(jì)算公式和方法與實(shí)施例1中相同。通過計(jì)算，Hg2+的抑制率為68.24%，如圖11所示。
[0156]實(shí)施例17
[0157]操作方法和步驟同實(shí)施例16，唯一的變化是:向體系中加入Cu2+至Cu2+在體系中的濃度為80 μ g/ml，檢測(cè)80 μ g/ml的Cu2+的生物毒性大小，通過計(jì)算，Cu2+的抑制率為37.2%。
[0158]實(shí)施例18
[0159]操作方法和步驟同實(shí)施例16，唯一的變化是:向體系中加入Zn2+至Zn2+在體系中的濃度為80 μ g/ml，檢測(cè)80 μ g/ml的Zn2+的生物毒性大小，通過計(jì)算，Zn2+的抑制率為26.79%ο
[0160]實(shí)施例19
[0161]操作方法和步驟同實(shí)施例16，唯一的變化是:向體系中加入Ni2+至Ni2+在體系中的濃度為80 μ g/ml，檢測(cè)80 μ g/ml的Ni2+的生物毒性大小，通過計(jì)算，Ni2+的抑制率為22.7%。
[0162]圖12為實(shí)施例16、17、18、19中Cu2+、Hg2+、Zn2+、Ni2+的毒性檢測(cè)結(jié)果比較，從圖中可以看出，相同條件下，Hg2+造成的生物毒性最大，Cu2+次之，Zn2+和Ni2+較小。
[0163]實(shí)施例20
[0164]一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器:
[0165]—、高分子固定的無試劑型微生物電極的制備
[0166]將市售的片狀玻碳用1000目金相砂紙打磨10分鐘后，依次用0.3μΜ、0.15 μ Μ、
0.01 μ Hia-Al2O3拋光成鏡面，再依次用IOml的去離子水、乙醇、丙酮各超聲10分鐘，置于空氣中晾干，得到拋光成鏡面的片狀玻碳(0.7cmX0.7cm)作為平板電極基底。
[0167]細(xì)菌培養(yǎng)液為在50ml去離子水中，加入0.25g氯化鈉、0.15g酵母菌提取物和
0.5g蛋白胨。用0.1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)液濃度為pH=7.0后，在高壓滅菌鍋中滅菌。
[0168]用磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和水配制pH=7.0、0.0lM磷酸鹽緩沖液。
[0169]用接種環(huán)取定量大腸桿菌(E.coli)純菌種接種于50ml細(xì)菌培養(yǎng)液，37°C下，在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16小時(shí)，然后在5000rpm下，離心10分鐘得到濕菌體，然后用磷酸鹽緩沖液沖洗、離心10分鐘兩次，最后得到的濕菌體根據(jù)其在紫外分光光度計(jì)測(cè)試在600nm處的吸光度值，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)，使菌液的密度達(dá)到固定值。
[0170]取0.2g聚氯乙烯和0.2g苯醌溶于IOml四氫呋喃中，攪拌得到均勻液體后，取10 μ L該溶液，滴涂在拋光過的玻碳平板電極上，在室溫下晾干。稱取0.05g明膠，在37°C下溶解在lml、0.0lM磷酸鹽緩沖液中，得到明膠溶液，將所述的明膠溶液與所述的菌液按1:1的比例混合均勻，得到明膠與大腸桿菌的混合溶液。取8 μ L所述的混合溶液，滴加于修飾過聚氯乙烯和苯醌的玻碳平板電極上，在室溫下干燥。然后浸入2.5%戊二醛的水溶液中3分鐘，取出后用pH=7.0,0.0lM磷酸鹽緩沖液清洗兩次，室溫干燥，得到所述的明膠固定微生物電極。
[0171]二、電化學(xué)傳感器用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性
[0172]三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的組裝:同實(shí)施例1。
[0173]細(xì)菌呼吸作用的營養(yǎng)溶液:同實(shí)施例:1。
[0174]1、對(duì)水體毒性的即時(shí)監(jiān)測(cè)
[0175]將實(shí)施例20制備的微生物電極作為工作電極，鉬電極為對(duì)電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置通過電機(jī)線與電化學(xué)工作站連接。向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的電解池中加入IOml配好的細(xì)菌營養(yǎng)溶液，確保所述的參比電極和對(duì)電極的前端浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為0.5V(vs.Ag/AgCl )，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待背景電流逐漸穩(wěn)定后，加入Cu2+，加入后Cu2+在體系中的濃度為120 μ g/ml，記錄電流的改變?？梢钥吹郊尤隒u2+后20秒內(nèi)穩(wěn)態(tài)電流迅速降低，表明制備的電極可以在很短的時(shí)間內(nèi)顯示水體中毒性物質(zhì)濃度的突變，如圖13中所示。
[0176]2、對(duì)重金屬離子生物毒性評(píng)價(jià)
[0177]將實(shí)施例20制備的微生物電極作為工作電極，鉬電極為對(duì)電極，銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極作為參比電極的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置通過電機(jī)線與電化學(xué)工作站連接。向所述的三電極體系的電化學(xué)檢測(cè)裝置的電解池中加入IOml的配好的營養(yǎng)溶液，確保所述的參比電極和對(duì)電極的前端浸入液面下，在穩(wěn)定的電磁攪拌下進(jìn)行恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)工作站設(shè)定為恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，?shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定工作電壓為0.5V (vs.Ag/AgCl)，開始所述的恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)，待背景電流逐漸穩(wěn)定后，加入Cu2+，加入后Cu2+離子在體系中的濃度為120 μ g/ml，記錄電流的改變依靠抑制率來計(jì)算加入的Cu2+的生物毒性大小，抑制率計(jì)算公式和方法與實(shí)例I相同。通過計(jì)算，Cu2+的抑制率為30.14%，如圖13所示。
[0178]實(shí)施例21[0179]操作方法和步驟同實(shí)施例20，唯一的變化是:向體系中加入Hg2+至Hg2+在體系中的濃度為120μ g/ml，檢測(cè)120 μ g/ml的Hg2+的生物毒性大小，通過計(jì)算，Hg2+的抑制率為43.37%
[0180]實(shí)施例22
[0181]操作方法和步驟同實(shí)施例20，唯一的變化是:向體系中加入Zn2+至Zn2+在體系中的濃度為120μ g/ml，檢測(cè)120 μ g/ml的Zn2+的生物毒性大小，通過計(jì)算，Zn2+的抑制率為
14.55%
[0182]實(shí)施例23
[0183]操作方法和步驟同實(shí)施例20，唯一的變化是:向體系中加入Ni2+至Ni2+在體系中的濃度為120μ g/ml，檢測(cè)120 μ g/ml的Ni2+的生物毒性大小，通過計(jì)算，Ni2+的抑制率為
13.62%
[0184]圖14為實(shí)施例20、21、22、23中Cu2+、Hg2+、Zn2+、Ni2+的毒性檢測(cè)結(jié)果比較。從圖中可以看出，相同條件下，Hg2+造成的生物毒性最大，Cu2+次之，Zn2+和Ni2+較小。
[0185]實(shí)施例24
[0186]一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器:
[0187]一、高分子固定的微生物電極的制備
[0188]將市售的片狀玻碳用1000目金相砂紙打磨10分鐘后，依次用0.3μΜ、0.15 μ Μ、
0.Ο?μπι α-Al2O3拋光成鏡面，再依次用IOml的去離子水、乙醇、丙酮各超聲10分鐘，置于空氣中晾干，得到拋光成鏡面的片狀玻碳作為平板電極基底。
[0189]酵母菌培養(yǎng)液為在50ml去離子水中，加入0.5g酵母膏，Ig蛋白胨，Ig葡萄糖，用
0.1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)液濃度為pH=6.5后，在高壓滅菌鍋中滅菌。
[0190]用接種環(huán)取定量酵母菌純菌種接種于50ml細(xì)菌培養(yǎng)液，在28°C恒溫?fù)u床中培養(yǎng)20小時(shí)，然后在5000rpm下，離心10分鐘得到濕菌體，然后用磷酸鹽緩沖液沖洗、離心10分鐘兩次，最后得到的濕菌體根據(jù)其在紫外分光光度計(jì)測(cè)試在600nm處的吸光度值，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)，使菌液的密度達(dá)到固定值。
[0191]稱取0.05g明膠，在37°C下溶解在lml、0.01M磷酸鹽緩沖液中，得到明膠溶液，將所述明膠溶液與所述菌液按1:1的比例混合均勻，得到明膠與酵母菌的混合溶液。取SyL所述的混合溶液，滴加于拋光過的玻碳平板電極上，在室溫下干燥。然后浸入2.5%戊二醛的水溶液中5分鐘，取出后用pH=7.0,0.01M磷酸鹽緩沖液清洗兩次，室溫干燥，得到所述的明膠固定的酵母菌微生物電極。
[0192]二、電化學(xué)傳感器用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性
[0193]操作方法和步驟同實(shí)施例20。
[0194]實(shí)施例25
[0195]一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器:
[0196]一、高分子固定的微生物電極的制備
[0197]將市售的片狀玻碳用1000目金相砂紙打磨10分鐘后，依次用0.3μΜ、0.15 μ Μ、
0.01 μ Hia-Al2O3拋光成鏡面，再依次用IOml的去離子水、乙醇、丙酮各超聲10分鐘，置于空氣中晾干，得到拋光成鏡面的片狀玻碳(0.7cmX0.7cm)作為平板電極基底。
[0198]大腸桿菌和酵母菌培養(yǎng)方法分別與實(shí)施例1和實(shí)施例21相同，以1:1的比例混合大腸桿菌和酵母菌得到混合菌液。
[0199]取0.05g明膠，在37°C下溶解在lml、0.0lM磷酸鹽緩沖液中，得到明膠溶液，將所述的明膠溶液與所述的混合菌液按1:1的比例混合均勻，得到明膠與混合菌液的混合溶液。取SyL所述的混合溶液，滴加于拋光過的玻碳平板電極上，在室溫下干燥。然后浸入
2.5%戊二醛的水溶液中5分鐘，取出后用pH=7.00.0lM磷酸鹽緩沖液清洗兩次，室溫干燥，得到所述的明膠固定的大腸桿菌酵母菌微生物電極。
[0200]二、電化學(xué)傳感器用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性
[0201]操作方法和步驟同實(shí)施例20。
[0202]實(shí)施例26
[0203]操作方法與實(shí)施步驟同實(shí)施例1中的對(duì)重金屬離子生物毒性評(píng)價(jià)，唯一的變化是:向體系中加入對(duì)硝基苯酹至對(duì)硝基苯酹在體系中的濃度為300 μ g/ml,檢測(cè)300 μ g/ml的對(duì)硝基苯酚的生物毒性大小，通過計(jì)算，對(duì)硝基苯酚的抑制率為20.3%。結(jié)果見圖15。
[0204]實(shí)施例27
[0205]操作方法與實(shí)施步驟同實(shí)施例1中的對(duì)重金屬離子生物毒性評(píng)價(jià)，唯一的變化是:向體系中加入對(duì)氯苯酹至對(duì)氯苯酹在體系中的濃度為300μ g/ml,檢測(cè)300 μ g/ml的對(duì)氯苯酚的生物毒性大小，通過計(jì)算，對(duì)氯苯酚的抑制率為12.5%。結(jié)果見圖16。
[0206]實(shí)施例28
[0207]操作方法與實(shí)施步驟同實(shí)施例1中的對(duì)重金屬離子生物毒性評(píng)價(jià)，唯一的變化是:向體系中加入乙酰甲胺磷(一種有機(jī)磷殺蟲劑)至乙酰甲胺磷在體系中的濃度為50μ g/ml，檢測(cè)50 μ g/ml的乙酰甲胺磷的生物毒性大小，通過計(jì)算，乙酰甲胺磷的抑制率為34.75%。結(jié)果見圖17。
[0208]實(shí)施例29
[0209]操作方法與實(shí)施步驟同實(shí)施例1中的對(duì)重金屬離子生物毒性評(píng)價(jià)，唯一的變化是:向體系中加入莠滅凈(一種除草劑)至莠滅凈在體系中的濃度為50μ g/ml，檢測(cè)50μ g/ml的莠滅凈的生物毒性大小，通過計(jì)算，莠滅凈的抑制率為52.83%。結(jié)果見圖18。
[0210]實(shí)施例30
[0211]操作方法與實(shí)施步驟同實(shí)施例1中的對(duì)重金屬離子生物毒性評(píng)價(jià)，唯一的變化是:向體系中同時(shí)加入Cu2+和乙酰甲胺磷至Cu2+在體系中的濃度為40 μ g/ml、乙酰甲胺磷在體系中的濃度為50μ g/ml,檢測(cè)40μ g/ml的Cu2+和50 μ g/ml乙酰甲胺磷的混合生物毒性大小，通過計(jì)算，抑制率為37.58%。
[0212]實(shí)施例31
[0213]一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，
[0214]包括工作電極、對(duì)電極、參比電極、電解池；所述工作電極為高分子固定的無試劑型微生物電極，所述高分子固定的微生物電極為電極和包覆在電極外的高分子細(xì)菌混合層，所述高分子細(xì)菌混合層是高分子材料溶液(質(zhì)量濃度為10mg/ml的磷酸鹽溶液)、細(xì)菌和交聯(lián)劑的混合物；所述高分子材料為明膠或殼聚糖，所述細(xì)菌為大腸桿菌，所述電極為無試劑型玻碳電極，取0.1g聚甲基丙烯酸甲酯和0.1苯醌溶于IOml四氫呋喃或氯仿中，攪拌均勻，將該溶液滴涂在拋光過的玻碳電極上，得到無試劑型玻碳電極。所述細(xì)菌菌液稀釋20倍后在600nm處的吸光度為0.4。[0215]該電化學(xué)傳感器監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性時(shí)，通過在恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ较拢O(shè)定工作電壓0.2v，待背景電流穩(wěn)定后，加入待檢測(cè)液，記錄電流的改變，進(jìn)行即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體的生物毒性。
[0216]所述工作電極是通過下列步驟制備的:1)將高分子材料在20°C條件下溶解在磷酸鹽緩沖液中，得到質(zhì)量濃度為10mg/ml的高分子材料溶液；2)將所述高分子材料溶液與細(xì)菌菌液按體積比為1:3的比例混合均勻，得到高分子材料與細(xì)菌的混合液；3)取步驟2)的混合液，滴加于無試劑型電極上，單位面積滴涂量為5 μ L/cm2,干燥，然后浸入交聯(lián)劑中進(jìn)行交聯(lián)處理，之后用磷酸鹽緩沖液清洗，干燥，得到工作電極。
[0217]實(shí)施例32
[0218]一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，
[0219]包括工作電極、對(duì)電極、參比電極、電解池；所述工作電極為高分子固定的無試劑型微生物電極，所述高分子固定的微生物電極為電極和包覆在電極外的高分子細(xì)菌混合層，所述高分子細(xì)菌混合層是高分子材料溶液(質(zhì)量濃度為100mg/ml的磷酸鹽溶液)、細(xì)菌和交聯(lián)劑的混合物；所述高分子材料為明膠或殼聚糖，所述細(xì)菌為大腸桿菌，所述電極為無試劑型玻碳電極，取1.0g聚氯乙烯和0.5g苯醌溶于IOml四氫呋喃或氯仿中,攪拌均勻,將該溶液滴涂在拋光過的玻碳電極上，得到無試劑型玻碳電極。所述細(xì)菌的菌液稀釋20倍后在600nm處的吸光度為0.8。
[0220]該電化學(xué)傳感器監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性時(shí)，通過在恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ较?，設(shè)定工作電壓0.7v，待背景電流穩(wěn)定后，加入待檢測(cè)液，記錄電流的改變，進(jìn)行即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體的生物毒性。
[0221]所述工作電極是通過下列步驟制備的:1)將高分子材料在80°C條件下溶解在磷酸鹽緩沖液中，得到質(zhì)量濃度為100mg/ml的高分子材料溶液；2)將所述高分子材料溶液與細(xì)菌菌液按體積比為3:1的比例混合均勻，得到高分子材料與細(xì)菌的混合液；3)取步驟2)的混合液，滴加于無試劑型電極上，單位面積滴涂量為40 μ L/cm2，干燥，然后浸入交聯(lián)劑中進(jìn)行交聯(lián)處理，之后用磷酸鹽緩沖液清洗，干燥，得到工作電極。
[0222]實(shí)施例33
[0223]一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器的裝置，如圖20中所示，包括:盒體1、盒蓋2、電解池3、絲網(wǎng)印刷電極4、便攜式電化學(xué)工作站5、數(shù)據(jù)線6;其中，電解池3、絲網(wǎng)印刷電極4、便攜式電化學(xué)工作站5和數(shù)據(jù)線6放置在盒體I內(nèi)。所述絲網(wǎng)印刷電極4是把工作電極、參比電極、對(duì)電極都集成在一個(gè)電極片上的電極。工作電極采用本發(fā)明的高分子固定的微生物電極或高分子固定的無試劑型微生物電極。參比電極和對(duì)電極為常規(guī)使用的參比電極和對(duì)電極。電化學(xué)工作站是向外界提供電流和電壓的裝置。
[0224]圖21是絲網(wǎng)印刷電極4的示意圖。
[0225]如圖22中所示，在使用時(shí)，將樣品經(jīng)電解池3上的樣品進(jìn)樣口 11加入電解池3中。將絲網(wǎng)印刷電極4的一端插入電解池3中，另一端經(jīng)數(shù)據(jù)線6連接至便攜式電化學(xué)工作站5的一端。便攜式電化學(xué)工作站5的另一端連接至數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)7，以便處理數(shù)據(jù)。
[0226]更方便地，便攜式電化學(xué)工作站5為便攜式即插式工作站(如圖23中所示)，即它的一端設(shè)置有與絲網(wǎng)印刷電極4相應(yīng)的接觸端，這樣無需數(shù)據(jù)線6，就可將絲網(wǎng)印刷電極4和便攜式即插式電化學(xué)工作站5相連，操作更簡便。[0227]顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
【權(quán)利要求】
1.一種可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，包括工作電極、對(duì)電極、參比電極、電解池；其特征在于， 所述工作電極為高分子固定的微生物電極，所述高分子固定的微生物電極為電極和包覆在電極外的高分子細(xì)菌混合層，所述高分子細(xì)菌混合層是高分子材料溶液、細(xì)菌和交聯(lián)劑的混合物；所述高分子材料為明膠或殼聚糖，所述細(xì)菌為大腸桿菌和/或酵母菌，所述電極為玻碳電極、金電極、鉬電極或硼摻雜金剛石薄膜電極； 所述電解池中加入細(xì)菌呼吸營養(yǎng)溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述電化學(xué)傳感器監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性時(shí)，通過在恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ较?，設(shè)定工作電壓，待背景電流穩(wěn)定后，加入苯醌，電流經(jīng)變化后逐漸平穩(wěn)，之后加入待檢測(cè)液記錄電流的改變，進(jìn)行即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體的生物毒性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，其特征在于，加入苯醌至苯醌濃度為0.1mM^l.0mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述電極經(jīng)過特殊方法制備，使得檢測(cè)時(shí)不需要再添加任何試劑的電極，為無試劑型電極，所述無試劑型電極是將玻碳電極、金電極、鉬電極或硼摻雜金剛石薄膜電極進(jìn)行處理后得到的電極；所述處理是取0.lg^l.0g憎水性高分子材料和0.1^0.5g苯醌溶于IOml四氫呋喃或氯仿中，攪拌均勻，將該溶液滴涂在拋光過的電極上，得到無試劑型電極。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述憎水性高分子材料為聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，其特征在于，該電化學(xué)傳感器監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性時(shí)，通過在恒電壓計(jì)時(shí)電流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ较?，設(shè)定工作電壓，待背景電流穩(wěn)定后，加入待檢測(cè)液，記錄電流的改變，進(jìn)行即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體的生物毒性。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，其特征在于，設(shè)定工作電壓為0.2v^0.7v。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述高分子材料溶液是高分子材料溶解在磷酸鹽緩沖液中得到的質(zhì)量濃度為10mg/ml~100mg/ml 的溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述高分子材料溶液與細(xì)菌菌液按體積比為1:3~3:1混合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述細(xì)菌的菌液稀釋20倍后在600nm處的吸光度為0.4^0.8。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，其特征在于，當(dāng)所述細(xì)菌為大腸桿菌和酵母菌時(shí)，兩者的菌液體積比為5: 1^ 1: 5。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述工作電極是通過下列步驟制備的: 1)將高分子材料在20°C~80°C條件下溶解在磷酸鹽緩沖液中，得到質(zhì)量濃度為10mg/ml^lOOmg/ml的高分子材料溶液；2)將所述高分子材料溶液與細(xì)菌菌液按體積比為1:3~3:1的比例混合均勻，得到高分子材料與細(xì)菌的混合液； 3)取步驟2)的混合液，滴加于電極或無試劑型電極上，單位面積滴涂量為5~40μ?7cm2,干燥，然后浸入交聯(lián)劑中進(jìn)行交聯(lián)處理，之后用磷酸鹽緩沖液清洗，干燥，得到工作電極。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述步驟3)中交聯(lián)處理是將滴加了混合液的電極浸入2.5%戊二醛的水溶液中3~5分鐘后取出。
14.如權(quán)利f13任一所述的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器的裝置，其特征在于，它包括:盒體(1)、盒蓋(2)、電解池(3)、絲網(wǎng)印刷電極(4)、便攜式電化學(xué)工作站(5);其中，電解池(3)、絲網(wǎng)印刷電極(4)、便攜式電化學(xué)工作站(5)放置在盒體(O內(nèi)；所述絲網(wǎng)印刷電極(4)的工作電極為高分子固定的微生物電極或高分子固定的無試劑型微生物電極。
15.根據(jù)權(quán)利14所述的可用于即時(shí)監(jiān)測(cè)和檢測(cè)水體生物毒性的電化學(xué)傳感器的裝置，其特征在于，該裝置還包括放置在`盒體(1)內(nèi)的數(shù)據(jù)線(6 )。
【文檔編號(hào)】G01N27/26GK103512938SQ201210201707
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月15日
【發(fā)明者】只金芳, 李久銘, 王鈺寧, 錢俊 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所