專利名稱：一種檢測去氫甲睪酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測技術領域，具體而言，本發(fā)明涉及一種用于檢測去氫甲睪酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及使用方法。
背景技術：
去氧甲辜麗(1-dehydro-l7-methyl testosterone, DMT),又名大力補、美雄麗，分子式C2tlH28O2，分子量300. 44。DMT目前在醫(yī)學臨床上普遍用于再生障礙性貧血、男性發(fā)育遲緩、燒傷處理、手術后慢性消耗性疾病、老年骨質(zhì)疏松和腫瘤惡液汁病等。但DMT屬于蛋白質(zhì)同化激素類，長期或大量服用會對人體有很多副作用。如導致肝功能障礙，生殖功能紊舌L增加患心血管疾病的風險等。DMT還具有促進動物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)沉積和改善生產(chǎn)性能的作用，在畜牧業(yè)上常被用作動物飼料添加劑，以促進動物生長，提高產(chǎn)量。但蛋白同化激 素作為飼料添加劑應用于畜牧生產(chǎn)時，會在動物體內(nèi)殘留，當人們長期食用含有該藥物殘留的動物性食品時，同樣會造成人的生殖系統(tǒng)障礙、發(fā)育異常及某些癌癥如乳房癌、睪丸癌等，嚴重危害人類健康。目前，DMT常用的檢測方法多為儀器檢測方法，如高效液相色譜(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)等。這些儀器檢測方法需要復雜的儀器，且過程繁瑣，不適應現(xiàn)場大量樣品的篩查?；诳乖贵w免疫反應的免疫學檢測技術為小分子殘留物的分析檢測提供了一個新的途徑。因為DMT是小分子化合物，本身沒有免疫原性，必須將其與大分子載體蛋白偶聯(lián)得到具有免疫原性的人工抗原。DMT人工抗原和特異性抗體以及在此基礎上建立免疫分析方法尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測DMT的酶聯(lián)免疫試劑盒及使用方法。本發(fā)明提供了一種快速檢測DMT的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒包括DMT特異性抗體、DMT-載體蛋白偶聯(lián)物和酶標二抗，三者體積組成比例為1:2:2。其中DMT特異性抗體為鼠抗DMT的單克隆抗體，可用DMT與載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原通過免疫BALB/c小鼠制得。所述載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)，所述DMT與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將DMT和載體蛋白用活化酯法進行偶聯(lián)得到。本發(fā)明所述的一種快速檢測DMT的酶聯(lián)免疫試劑盒，還進一步包括用于固定DMT與載體蛋白偶聯(lián)物的載體物質(zhì)很多，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。載體的形式是微量反應板凹孔。為方便現(xiàn)場檢測和大量樣本篩查，所述的試劑盒還可以進一步包括DMT標準溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液和濃縮樣品稀釋液。 所述的洗滌液為0. 5%吐溫-20磷酸鹽緩沖液。所述的顯色劑由顯色劑A液和顯色劑B液組成(例如，體積比為1:19)，顯色劑A液為過氧化氫，顯色劑B液為四甲基聯(lián)苯胺。所述的濃縮樣品稀釋液為0. 01M, PH7. 4的磷酸鹽緩沖液。另一方面，本發(fā)明還提供了利用上述試劑盒檢測樣品中DMT含量的方法，按照下述步驟進行
(I)樣品前處理取10 g (其中肉5 g，精確至0.01 g)絞碎的豬肉的空白樣品(肉與水同等重量攪勻)置于50 mL離心管中；添加一定量的DMT標準液后加入叔丁基甲醚20 mL,渦旋混勻器混勻I min，置于超聲波發(fā)生器中超聲波提取10 min，取出8000 r/min離心5min，有機相轉(zhuǎn)移至另一支50 mL離心管中；下層再用20 mL叔丁基甲醚分2次提取，有機相轉(zhuǎn)移至對應離心管中；40 1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加2 %甲醇-PBS定容至10 mL ;進行ELISA測定。(2)用試劑盒進行檢測，向包被有去氫甲睪酮抗原的酶標板孔中加入標準品或樣品溶液，再加入去氫甲睪酮單克隆抗體，孵育后洗滌排干，加入酶標記二抗，孵育后洗滌排干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值。
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(3)分析檢測結(jié)果。本發(fā)明試劑盒的檢測原理為
將DMT抗原吸附于固相載體上，加入樣本或DMT標準品溶液并加入DMT抗體工作液，待測樣品中DMT和固相載體上包被的DMT抗原競爭DMT抗體，再加入酶標記抗抗體進行酶活性的放大作用，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中DMT的量呈負相關，與標準曲線比較即可得出DMT濃度范圍。有益效果
本發(fā)明檢測DMT的試劑盒主要采用間接競爭酶聯(lián)免疫法定性或定量樣品中DMT含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品。本發(fā)明該試劑盒采用高特異性的DMT單克隆抗體，主要試劑以工作液形式提供，可以減少試劑盒的操作步驟，為使用者節(jié)省時間并降低因操作步驟冗繁造成的誤差，本發(fā)明具有靈敏度高、特異性強、高精密度、高準確度、對儀器要求低、試劑保存時間長、自動化程度高、無放射性同位素污染的等優(yōu)點，可在飼料及動物源性產(chǎn)品檢測中發(fā)揮重要作用。


圖I. DMT酶聯(lián)免疫檢測試劑盒結(jié)構(gòu)圖，其中I為試劑盒盒體，2為包被了 DMT-BSA抗原的酶標板，3為系列標準溶液,4為顯色劑A, 5為顯色劑B, 6為抗體溶液,7為酶標二抗溶液，9為濃縮洗滌液，10為濃縮樣品稀釋液，11為試劑瓶架。圖2. DMT抑制曲線。
具體實施例方式DMT-載體蛋白偶聯(lián)物的制備方法參見專利201010213218. 7 (董英、張勛、王云、儲
曉剛)。本發(fā)明使用的酶標二抗為商品化的羊抗鼠IgG抗體，購自Genescript公司。本發(fā)明下面的實施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例I DMT與載體蛋白偶聯(lián)物及單克隆抗體的制備及純化1.I DMT與載體蛋白的偶聯(lián)物的制備
將DMT和牛血清白蛋白(BSA)采用活化酯法進行偶聯(lián)得到偶聯(lián)物。I. 2 DMT單克隆抗體的制備及純化
(I)單克隆抗體的制備取6 8周齡的健康BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0. 5 m經(jīng)高壓滅菌的液體石蠟；約10天后，收集對數(shù)期的雜交瘤細胞1D6F10B4 (由實驗室前期工作制備，已申請專利)，I 000 r/min離心10 min，棄上清液；用1640不完全培養(yǎng)液將細胞懸起，取少量加入同等體積的臺盼藍染色后進行計數(shù)，每只小鼠注射細胞5. OX IO5個；接種雜交瘤細胞7 10天后,用注射器抽取腹水,將得到的腹水經(jīng)12 000 r/min離心15 min,棄沉淀，收集上清液。(2)采用正辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，純化步驟具體如下取適量經(jīng)預處理的小鼠腹水，用0.06 mol/L、pH 4. 8的醋酸緩沖液稀釋2倍；按33 ML /mL原始腹水的比例， 30 min內(nèi)逐滴加入正辛酸，邊滴邊攪拌；于4 °C靜置2 h后，12 000 r/min離心20 min,取上清液濾紙過濾；加入1/10上清液體積的0. I mol/L、pH 7. 4的PBS，并用NaOH調(diào)pH至7. 4;上清在4 °C冰浴條件下，按277 g/L的比例加入硫酸銨粉末，同時攪拌，30 min內(nèi)加完，靜置2 h以上或4 °C過夜；在4°C下12 000 r/min離心30 min，棄上清液，收集沉淀，將沉淀溶于一定體積的PBS，并于4°C下置于對5(Tl00倍的PBS中透析除鹽2 3天，期間更換3次以上透析液。之后凍存于-20 1下備用。實施例2 檢測DMT的酶聯(lián)免疫試劑盒
2.I檢測DMT的酶聯(lián)免疫試劑盒的結(jié)構(gòu)
檢測DMT酶聯(lián)免疫試劑盒結(jié)構(gòu)如圖I.所示其中I為試劑盒盒體，2為包被了 DMT-BSA抗原的酶標板，3為系列標準溶液,4為顯色劑A, 5為顯色劑B, 6為抗體溶液,7為酶標二抗溶液，9為濃縮洗滌液，10為濃縮樣品稀釋液，11為試劑瓶架。試劑瓶架11上制有凹孔，上述試劑瓶3-10安放在試劑瓶架的凹孔內(nèi)，試劑瓶架11及酶標板2安放在盒體內(nèi)。其中酶標板2由塑料支架和可拆分的酶標條組成。2. 2所用試劑的配制
a. DMT標準溶液DMT系列標準溶液6瓶，1_3 mL/瓶。b.包被緩沖液pH 9. 6,0. 05 mL的碳酸鹽緩沖液。c.封閉液3%聚乙二醇。d.濃縮洗滌液含I %吐溫的磷酸鹽緩沖液(0.01 M，pH 7. 4)，為正常使用濃度的 20 倍，30-50 mL，l 瓶。2.3酶標板的制備
用包被緩沖液將DMT與載體蛋白的偶聯(lián)物用包被緩沖液稀釋成I呢/mL，每孔100 ML，37°C溫浴2h，傾出包被液，用洗滌液洗滌3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200 ML封閉液，4 0C過夜,傾去孔內(nèi)液體,干燥后用保鮮膜密封保存。實施例3 免疫檢測方法的建立
3.I ELISA方法確定最佳包被濃度與抗體工作濃度
將 4 u g/mL>2 u g/mL> I u g/mL>0. 5 u g/mL>0. 25 u g/mL>0. 125 Ug/mL 系列濃度的牛血清白蛋白DMT-BSA偶聯(lián)物按每孔100 u L包被酶標板，每行一種濃度，4°C包被過夜，洗滌3次，拍干，按每孔200 UL封閉液37 °C封閉2 h，洗滌3次，拍干。加入1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:12000、1:16000、1:24000、1:32000 稀釋的抗體 100 u L，每列一
種濃度，37 °C作用50 min，洗滌3次，立即加入100 UL酶標羊抗鼠抗體，37°C作用lh，洗滌3次，加入100 u L底物液，37 1避光作用15 min, 50 u L終止液終止反應，酶標儀檢測A值(450nm)。同時設置平行重復孔，取OD值為I. 0左右時的包被濃度與抗體工作濃度為最佳濃度。實驗數(shù)據(jù)列于表I?？梢源_定，最佳包被濃度為I U g/mL,最佳抗體工作濃度為稀釋8000倍。表I.棋盤法確定最佳包被濃度與抗體工作濃度
權利要求
1.一種快速檢測DMT的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于包括DMT特異性抗體、DMT-載體蛋白偶聯(lián)物和酶標二抗。
2.根據(jù)權利要求I所述一種快速檢測DMT的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于DMT特異性抗體、DMT-載體蛋白偶聯(lián)物和酶標二抗三者體積組成比例為1:2:2。
3.根據(jù)權利要求I所述一種快速檢測DMT的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于其中DMT特異性抗體為鼠抗DMT的單克隆抗體，用DMT與載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原通過免疫BALB/c小鼠制得；所述載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)，所述DMT與載體蛋白的偶聯(lián)物通過將DMT和載體蛋白用活化酯法進行偶聯(lián)得到。
4.根據(jù)權利要求I所述一種快速檢測DMT的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于還進一步包括用于固定DMT與載體蛋白偶聯(lián)物的載體物質(zhì)，如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯；載體的形式是微量反應板凹孔。
5.根據(jù)權利要求I所述一種快速檢測DMT的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還可以進一步包括DMT標準溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液和濃縮樣品稀釋液； 所述的洗滌液為O. 5%吐溫-20磷酸鹽緩沖液； 所述的顯色劑由體積比為1:19的顯色劑A液和顯色劑B液組成，顯色劑A液為過氧化氫，顯色劑B液為四甲基聯(lián)苯胺； 所述的濃縮樣品稀釋液為O. 01M, PH7. 4的磷酸鹽緩沖液。
6.權利要求I所述一種快速檢測DMT的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測樣品中DMT含量的方法，其特征在于按照下述步驟進行 (1)樣品前處理取10g絞碎的豬肉的空白樣品置于50 mL離心管中；添加一定量的DMT標準液后加入叔丁基甲醚20 mL，渦旋混勻器混勻I min，置于超聲波發(fā)生器中超聲波提取10 min，取出8000 r/min離心5 min，有機相轉(zhuǎn)移至另一支50 mL離心管中；下層再用20mL叔丁基甲醚分2次提取，有機相轉(zhuǎn)移至對應離心管中；40 °〇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加2 %甲醇-PBS定容至10 mL ;進行ELISA測定； (2)用試劑盒進行檢測，向包被有去氫甲睪酮抗原的酶標板孔中加入標準品或樣品溶液，再加入去氫甲睪酮單克隆抗體，孵育后洗滌排干，加入酶標記二抗，孵育后洗滌排干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值； (3)分析檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測去氫甲睪酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及使用方法，涉及酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測技術領域。本發(fā)明所提供的去氫甲睪酮的酶聯(lián)免疫試劑盒包括去氫甲睪酮特異性抗體、去氫甲睪酮與載體蛋白的偶聯(lián)物和酶標二抗。本發(fā)明的檢測去氫甲睪酮的酶聯(lián)免疫試劑盒靈敏、快速、準確，主要用于大批樣品的篩查；盒中的主要試劑均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏性、高精確性、高準確性等特點，可快速檢測飼料及畜產(chǎn)品中殘留的去氫甲睪酮。
文檔編號G01N33/74GK102707073SQ20121020669
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月21日 優(yōu)先權日2012年6月21日
發(fā)明者姚萍, 董英 申請人:江蘇大學