專利名稱：一種高通量法檢測人免疫球蛋白Fc段生物學(xué)活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種高通量法檢測人免疫球蛋白Fe段生物學(xué)活性的方法。
背景技術(shù)：
人免疫球蛋白G(Human Immunoglobulin G, IgG),抗體分子,血衆(zhòng)免疫球蛋白中占75%,由血衆(zhòng)B細胞合成和分泌。免疫球蛋白Fe片段(Fragment crystallizable region),是細胞表面受體和某些補體系統(tǒng)蛋白相互作用的抗體尾部區(qū)域部分，能激活免疫系統(tǒng)，與人IgG的藥物有效性相關(guān)。生產(chǎn)過程中的純化、病毒滅活、超濾、過濾，以及制品存放都能夠?qū)е翴gG分子生物活性降低和退化。主要表現(xiàn)為IgG的Fe功能改變，并最終導(dǎo)致抗體活性包括中和病毒、細菌和毒素(白喉、破傷風(fēng))及調(diào)理作用和誘發(fā)吞噬作用衰減。一般通過特異性抗體(免疫球蛋白)Fab段與紅細胞上已包被的相應(yīng)抗原結(jié)合，抗體暴露出Fe段補體Clq的結(jié)合位點，從而激活后續(xù)的補體各成分，最終導(dǎo)致紅細胞的細胞膜受到攻擊、破裂，釋放出血紅蛋白。通過溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線，計算IgG激活補體活性的功能指數(shù)(IFc)，以此測定IgG供試品Fe段生物學(xué)活性。據(jù)統(tǒng)計，2011年我國各種人IgG制品市場銷售額占血液制品總額的約50%，大于60億元。2008-2011年，我國血液制品各種人IgG市場批簽發(fā)供應(yīng)量大于5100萬瓶，但是對于人IgG活性功能檢測暫時還未開展。IgG的最主要的生物學(xué)功能是對微生物的調(diào)理作用，正常的調(diào)理作用需要IgG能識別吞噬細胞表面Fe受體，這首先要求IgG要有完整的Fe段功能，與微生物特異結(jié)合的抗體(Fab)通過IgG完整的Fe段與吞噬細胞的受體相結(jié)合，形成抗原-抗體-吞噬細胞的連鎖結(jié)合，促成吞噬細胞對微生物的接觸及吞噬(調(diào)理作用)。IgG對自身免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)機制也往往通過Fe片段來完成，包括效應(yīng)細胞Fe受體的競爭性抑制、抑制性Fe Y R IIB受體的誘導(dǎo)及FcRn受體飽和作用等。目前文獻報道的方法無論從檢測成本還是檢測通量都不適合實現(xiàn)人IgG的Fe段生物學(xué)活性測定可行性和普及性?，F(xiàn)行人IgG的Fe段生物學(xué)活性測定情況，例如歐洲藥典7. O用風(fēng)疹抗原和鞣酸化的壓積紅細胞制備敏化紅細胞用于人IgG的Fe生物學(xué)活性檢測，該法要求風(fēng)疹抗原凝血単位要求大于256個單位，而濃縮的風(fēng)疹抗原國內(nèi)難以購買，國外產(chǎn)品Aalto BioAW6088風(fēng)疹病毒抗原Img價格大約是15000人民幣，其檢測成本非常驚人；2010版中華人民共和國藥典用白喉類毒素或腮腺炎病毒鞣酸化的壓積紅細胞用于人IgG生物學(xué)活性檢測，該法缺點ー是沒有辦法提高檢測通量只能單個樣品檢測，浪費人力和物力，不利于IgG活性檢測的普及；缺點ニ是白喉類毒素使用和購買存在原料試劑來源的問題，而腮腺炎病毒使用需要安全級別BSL-2生物安全實驗室，對于專業(yè)技術(shù)操作和實驗室硬件條件要求較高，也不利于人IgG的Fe段生物學(xué)活性檢測的普及；2000年Ramasamy I等發(fā)現(xiàn)了流式細胞方法評估IgG的Fe片段功能活性檢測，對于專業(yè)技術(shù)操作和實驗室硬件條件要求較高，也不利于人IgG的Fe段生物學(xué)活性檢測的普及；2004年Vrdoljak A等用破傷風(fēng)類毒素作為抗原代替難以獲得的高滴度的風(fēng)疹病毒抗原，測定人IgG制劑Fe段生物學(xué)功能的方法；2009年Georgakopoulos T等用冰凍的紅細胞代替需要連續(xù)的新鮮人紅細胞測定人IgG制劑Fe段生物學(xué)功能的方法；2012年，Georgakopoulos T等用Kodecyte技術(shù)將CMV抗原包被到紅細胞上，得到標(biāo)準化制備敏化紅細胞，用于快速檢測人IgG制劑Fe段的方法。以上各種方法在敏化紅細胞的病毒抗原標(biāo)記和人IgG的Fe段生物學(xué)活性檢測通量方面均作了不同程度的探索，但是均未能成功建立一種廉價且高通量檢測人IgG的Fe段生物學(xué)活性的方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種高通量法檢測人免疫球蛋白Fe段生物學(xué)活性的方法，用于替代現(xiàn)行2010年版第3部中華人民共和國藥典 附錄X P人免疫球蛋白Fe段生物學(xué)活性測定法。具體而言，通過修改原測定法中敏化紅細胞標(biāo)記抗原選用品種，降低測定過程中各種樣品上樣量，另外樣品檢測用全自動酶聯(lián)免疫檢測儀替代紫外分光光度計單個樣品的測定。該方法有效降低檢測成本，縮短樣品檢測時間，提高檢測樣品的通量，為實現(xiàn)人免疫球蛋白Fe段生物學(xué)活性測定可行性和普及性奠定基礎(chǔ)。具體技術(shù)方案為一種高通量法檢測人免疫球蛋白Fe段生物學(xué)活性的方法，包括以下步驟I)敏化紅細胞的制備A液，取健康人抗凝O型血3人份以上混合，用PBS洗滌3次，最后一次以每分鐘2000轉(zhuǎn)離心10分鐘分離紅細胞。取適量積壓紅細胞懸浮于I. 3mg/L鞣酸PBS (I 40)，置于37°C水浴中輕搖30分鐘后再用PBS洗滌3次，最后用PBS制備成2. 5%紅細胞懸浮液；B液，用吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗與I %氯化鉻溶液O. 25ml (10 I)混合后，置于37 °C水浴中輕搖15分鐘；將A液、B液按I : 4混合，置于37°C水浴中輕搖30分鐘。離心，去上清液，用PBS將沉淀(敏化紅細胞)洗滌3次，用牛白蛋白-巴比妥緩沖液懸浮紅細胞，調(diào)節(jié)至適宜濃度；2)參考品和供試品溶液的制備用O. 5mol/L氫氧化鈉溶液將參考品和樣品pH調(diào)節(jié)至6. 8 7. 0，再用牛白蛋白-巴比妥緩沖液將供試品IgG濃度稀釋至每Iml含40mg蛋白含量；3)取供試品溶液O. 225ml，加入敏化紅細胞懸液O. 025ml，混勻，置于37°C水浴中輕搖30分鐘；4)離心，去上清液，用牛白蛋白-巴比妥緩沖液Iml洗滌紅細胞，共洗3次，末次離心后棄上清液200 μ 1，向沉淀中加入150 μ I預(yù)熱到37°C的牛白蛋白-巴比妥緩沖液，充分混勻，加入到96孔酶標(biāo)板上；6) 2分鐘后，再加入已稀釋至每Iml含150units的CH5tl的豚鼠補體50 μ 1，混勻后在波長541nm處測定起始吸光度(As)；7)每隔I分鐘測定I次，即得供試品在波長541nm處的吸光度與時間的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線，當(dāng)吸光度越過了曲線的內(nèi)曲點后即可停止測量；8)按公式S’ = Sexp/As分別計算出參考品、供試品和陰性對照曲線斜率；
按公式IF。= 100% X [(Ss^ -sc，)/(s/ -sc，)]計算供試品激活補體的功能指數(shù)(Ifc)公式中S’為用As修正Sexp得到的曲線斜率；As分別為供試品、參考品及陰性對照在波長541nm處測定的起始吸光度；Sexp分別為根據(jù)供試品、參考品及陰性對照各自的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線分別計算出相鄰3點間的曲線最大斜率；Ifc為供試品激活補體的功能指數(shù)；Ss’為供試品曲線斜率；S。’為陰性對照曲線斜率； S/為參考品曲線斜率。本發(fā)明所述方法中，數(shù)據(jù)采集處理選用MD公司M2e軟件softMax pro 5. 3或Bio-Tek Synergy Hl軟件Gen5,輔助數(shù)據(jù)分析處理選用originlab origin V8. 6和微軟Office excel2003o步驟2)所述參考品及陰性對照(牛白蛋白-巴比妥緩沖液)可平行處理，同法操作。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的技術(shù)方案使現(xiàn)行人IgG Fe段生物學(xué)活性測定，降低檢測成本，縮短檢測時間，檢測通量從原來單個樣品檢測提高32倍以上，而且其檢測結(jié)果和2010版第3部中華人民共和國藥典附錄X P人免疫球蛋白Fe段生物學(xué)活性測定法數(shù)據(jù)比較，新發(fā)明的檢測結(jié)果在合理的理論范圍內(nèi)。在一種廉價高通量檢測人IgG Fe段生物學(xué)活性的方法發(fā)明中，用吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗替代歐洲藥典7. O提及的風(fēng)疹抗原或2010版第3部中華人民共和國藥典提及的白喉類毒素或腮腺炎病毒，用MD公司M2e或Bio-Tek SynergyHl全自動酶聯(lián)免疫檢測儀測定替代紫外分光光度計單個樣品的測定，既能有效降低用于敏化紅細胞標(biāo)記抗原成本，又能提高人IgG Fe段生物學(xué)活性檢測的通量32倍以上。該方法有效降低檢測成本，縮短樣品檢測時間，提高檢測樣品的通量，為實現(xiàn)人免疫球蛋白Fe段生物學(xué)活性測定可行性和普及性奠定基礎(chǔ)。


圖lUltrospec 6300pro紫外分光光度法和全自動酶聯(lián)免疫檢測法比較圖；圖2Ultrospec 6300pro紫外分光光度法反應(yīng)動カ曲線圖；圖3全自動酶聯(lián)免疫檢測法反應(yīng)動カ曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖具體實施方式
對本發(fā)明的方法作進ー步詳細地說明。實施例lUltrospec 6300pro紫外分光光度法I.敏化紅細胞的制備A液，取健康人抗凝O型血3人份以上混合，用PBS洗滌3次，最后一次以每分鐘2000轉(zhuǎn)離心10分鐘分離紅細胞。取適量積壓紅細胞懸浮于I. 3mg/L鞣酸PBS (I 40)，置于37°C水浴中輕搖30分鐘后再用PBS洗滌3次，最后用PBS制備成2. 5%紅細胞懸浮液。B液，用吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗與I %氯化鉻溶液0.25ml (10 I)混合后，置于37 °C水浴中輕搖15分鐘。將A液、B液按I : 4混合，置于37°C水浴中輕搖30分鐘。離心，去上清液，用PBS將沉淀(敏化紅細胞)洗滌3次，用牛白蛋白-巴比妥緩沖液懸浮紅細胞，調(diào)節(jié)至適宜濃度。2.參考品和供試品溶液的制備用O. 5mol/L氫氧化鈉溶液將參考品和樣 品pH調(diào)節(jié)至6. 8 7. 0，再用牛白蛋白-巴比妥緩沖液將供試品IgG濃度稀釋至每Iml含40mg蛋白含量(根據(jù)溶液實際情況操作)。3.測定法取供試品溶液O. 9ml，加入敏化紅細胞懸液O. 1ml，混勻，置于37°C水浴中輕搖30分鐘。離心，去上清液，用牛白蛋白-巴比妥緩沖液Iml洗滌紅細胞，共洗3次。末次離心后棄上清液800 μ 1，向沉淀中加入600 μ I預(yù)熱到37°C的牛白蛋白-巴比妥緩沖液，充分混勻，2分鐘后再加入已稀釋至每Iml含150units的CH5tl的豚鼠補體200 μ 1，混勻后立即照紫外-可見光分光光度法在波長541nm處測定起始吸光度(As)，每隔I分鐘測定I次，既得供試品在波長541nm處的吸光度與時間的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線。當(dāng)吸光度越過了曲線的內(nèi)曲點后即可停止測量。分別取參考品及陰性對照(牛白蛋白-巴比妥緩沖液)O. 9ml，自“加敏化紅細胞懸液O. lml”起，同法操作。按公式(I)分別計算出參考品、供試品和陰性對照曲線斜率。按公式(2)計算供試品激活補體的功能指數(shù)(IF。)S，= Sexp/As(I)Ifc = 100% X [(Ss，_SC，)/(S/ -Sc，)] (2)公式中S’為用As修正Sexp得到的曲線斜率；As分別為供試品、參考品及陰性對照在波長541nm處測定的起始吸光度；Sexp分別為根據(jù)供試品、參考品及陰性對照各自的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線分別計算出相鄰3點間的曲線最大斜率；Ifc為供試品激活補體的功能指數(shù)；Ss’為供試品曲線斜率；S?！癁殛幮詫φ涨€斜率；S/為參考品曲線斜率。實施例2全自動酶聯(lián)免疫測定法I.敏化紅細胞的制備同實施例I2.參考品和供試品溶液的制備同實施例I3.測定法全自動酶聯(lián)免疫測定法取供試品溶液O. 225ml，加入敏化紅細胞懸液O. 025ml,混勻，置于37°C水浴中輕搖30分鐘。離心，去上清液，用牛白蛋白-巴比妥緩沖液Iml洗滌紅細胞，共洗3次。末次離心后棄上清液200 μ 1，向沉淀中加入150 μ I預(yù)熱到37°C的牛白蛋白-巴比妥緩沖液，充分混勻，加入到96孔酶標(biāo)板上，2分鐘后再加入已稀釋至每Iml含150units的CH5tl的豚鼠補體50 μ 1，混勻后立即在波長541nm處測定起始吸光度(As)，之后，每隔I分鐘測定I次，既得供試品在波長541nm處的吸光度與時間的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線。當(dāng)吸光度越過了曲線的內(nèi)曲點后即可停止測量。參考品及陰性對照(牛白蛋白-巴比妥緩沖液)可平行處理，同法操作。按公式(I)分別計算出參考品、供試品和陰性對照曲線斜率。按公式(2)計算供試品激活補體的功能指數(shù)(IF。)S，= Sexp/As(I)Ifc = 100% X [(Ss，_SC，)/(S/ -Sc，)] (2)公式中S，為用As修正Sexp得到的曲線斜率；As分別為供試品、參考品及陰性對照在波長541nm處測定的起始吸光度；Sexp分別為根據(jù)供試品、參考品及陰性對照各自的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線分別計算出相鄰3點間的曲線最大斜率；Ifc為供試品激活補體的功能指數(shù)；Ss’為供試品曲線斜率； S?！癁殛幮詫φ涨€斜率；S/為參考品曲線斜率。4.全自動酶聯(lián)免疫檢測法數(shù)據(jù)驗證我們?yōu)榱蓑炞C全自動酶聯(lián)免疫檢測法可行性和準確性，一共做過四次實驗，設(shè)計16個檢測樣本(包括ー個空白對照)，分別計算相關(guān)實驗數(shù)據(jù)。通過Ultrospec 6300pro紫外分光光度法檢測法數(shù)據(jù)和全自動酶聯(lián)免疫檢測法比較，對我們新建實驗方法可行性和準確性進行數(shù)學(xué)統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果見表I。表lUltrospec 6300pro紫外分光光度法和全自動酶聯(lián)免疫檢測法數(shù)據(jù)比較表

Octaga Oclaiia
201 201 201 201 201 m-A10 m-B14 201020102010 2010 20102010 2011 201權(quán)利要求
1.一種高通量法檢測人免疫球蛋白Fe段生物學(xué)活性的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)敏化紅細胞的制備 A液，取健康人抗凝O型血3人份以上混合，用PBS洗滌3次，最后一次以每分鐘2000轉(zhuǎn)離心10分鐘分離紅細胞，取積壓紅細胞以I : 40的比例懸浮于I. 3mg/L鞣酸PBS，置于37°C水浴中輕搖30分鐘后再用PBS洗滌3次，最后用PBS制備成2. 5%紅細胞懸浮液； B液，用吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗與I %氯化鉻溶液O. 25ml以10 : I的比例混合后，置于37°C水浴中輕搖15分鐘； 將A液、B液按I : 4混合，置于37°C水浴中輕搖30分鐘，離心，去上清液，用PBS將敏化紅細胞沉淀洗滌3次，用牛白蛋白-巴比妥緩沖液懸浮紅細胞，調(diào)節(jié)至適宜濃度； 2)參考品和供試品溶液的制備 用O. 5mol/L氫氧化鈉溶液將參考品和樣品pH調(diào)節(jié)至6. 8 7. 0，再用牛白蛋白-巴比妥緩沖液將供試品IgG濃度稀釋至每Iml含40mg蛋白含量； 3)取供試品溶液O.225ml，加入敏化紅細胞懸液O. 025ml，混勻，置于37°C水浴中輕搖30分鐘； 4)離心，去上清液，用牛白蛋白-巴比妥緩沖液Iml洗滌紅細胞，共洗3次，末次離心后棄上清液200 μ 1，向沉淀中加入150 μ I預(yù)熱到37°C的牛白蛋白-巴比妥緩沖液，充分混勻,加入到96孔酶標(biāo)板上； 6)2分鐘后，再加入已稀釋至每Iml含150units的CH5tl的豚鼠補體50 μ 1，混勻后在波長541nm處測定起始吸光度(As)； 7)每隔I分鐘測定I次，即得供試品在波長541nm處的吸光度與時間的溶血反應(yīng)動カ學(xué)曲線，當(dāng)吸光度越過了曲線的內(nèi)曲點后即可停止測量； 8)按公式S’=Sexp/As分別計算出參考品、供試品和陰性對照曲線斜率； 按公式Ifc = 100% X [(S/-S/)/(S/-S/)]計算供試品激活補體的功能指數(shù)(Ifc) 公式中S’為用As修正Sexp得到的曲線斜率； As分別為供試品、參考品及陰性對照在波長541nm處測定的起始吸光度； Sraip分別為根據(jù)供試品、參考品及陰性對照各自的溶血反應(yīng)動力學(xué)曲線分別計算出相鄰3點間的曲線最大斜率； Ifc為供試品激活補體的功能指數(shù)； S/為供試品曲線斜率； S?！癁殛幮詫φ涨€斜率； S/為參考品曲線斜率。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高通量法檢測人免疫球蛋白Fe段生物學(xué)活性的方法，其特征在于，步驟2)所述參考品及牛白蛋白-巴比妥緩沖液陰性對照可平行處理，同法操作。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高通量法檢測人免疫球蛋白Fc段生物學(xué)活性的方法，包括以下步驟1)敏化紅細胞的制備；2)參考品和供試品溶液的制備；3)測定。具體而言，通過修改原測定法中敏化紅細胞標(biāo)記抗原選用品種，降低測定過程中各種樣品上樣量，另外樣品檢測用全自動酶聯(lián)免疫檢測儀替代紫外分光光度計單個樣品的測定。該方法有效降低檢測成本，縮短樣品檢測時間，提高檢測樣品的通量，為實現(xiàn)人免疫球蛋白Fc段生物學(xué)活性測定可行性和普及性奠定基礎(chǔ)。
文檔編號G01N33/68GK102721817SQ20121021400
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月27日
發(fā)明者喻洪躍, 張學(xué)俊, 李長清, 肖小璞 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所