專利名稱：血管緊張素Ⅱ化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的涉及血管緊張素II (Ang II)化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
血管緊張素II (Angiotensin II，Ang II)是血管緊張素中最重要的組成部分，是由血管緊張素I在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的作用下形成的，是一種8肽物質(zhì)。血管緊張素II與人體的血管平滑機、腎上腺皮質(zhì)球狀帶細(xì)胞、心臟、腎臟器官的細(xì)胞上的血管緊張素受體結(jié)合，引起相應(yīng)的生理效應(yīng)。血管緊張素作用于血管平滑肌，可使全身微動脈收縮，動脈血壓升高。血管緊張素II是已知最強的縮血管活性物質(zhì)之一。
血管緊張素II是一種可通過內(nèi)分泌、自分泌/旁分泌以及胞內(nèi)分泌發(fā)揮作用的激素。它具有強烈收縮血管的作用，全身微動脈收縮，外周阻力增加，血壓升高；靜脈收縮，回心血量增多。Ang II介導(dǎo)交感神經(jīng)系統(tǒng)而促進去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)釋放,減少NE的再攝取，提高血管對NE的反應(yīng)性，促進腎上腺釋放兒茶酚胺，從而加強心功能同時通過血管的外周作用而提升血壓。Ang II可強烈刺激腎上腺皮質(zhì)球狀帶細(xì)胞合成和分泌醛固酮，后者促進遠(yuǎn)曲小管和集合管重吸收氯化鈉及水并排鉀；此外，Ang II尚可直接刺激近球小管重吸收氯化鈉、刺激垂體后葉釋放抗利尿激素而增加水的重吸收；引起入球及出球小動脈收縮，導(dǎo)致腎小球血流量減少，濾過系數(shù)降低。故Ang II有調(diào)節(jié)水鹽平衡、保證循環(huán)血量、維持血壓和減少尿生成的作用。所以血漿中血管緊張素II含量的測定，可為多種高血壓和腎臟疾病的分型與診斷提供依據(jù)。目前，國內(nèi)外對血管緊張素II的檢測較少，其中有放射免疫分析法，酶免法，化學(xué)發(fā)光法等。放射免疫分析法有放射性污染、標(biāo)記物半衰期短、對操作者具有放射性損傷等缺點。隨著標(biāo)記免疫技術(shù)的迅速發(fā)展，各種新的檢測方法層出不窮，例如ELISA方法、時間分辨免疫分析法、免疫熒光法、化學(xué)發(fā)光發(fā)等。其中化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有敏感性高、特異性強、檢測范圍廣、速度快等優(yōu)點，越來越受到人們的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是提供血管緊張素II的化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法，解決了靈敏度低，檢測范圍窄的缺陷。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種血管緊張素I化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒包括Ang II抗體包被板、辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ang II > Ang II校準(zhǔn)品、Ang II質(zhì)控品、發(fā)光液A液和B液、20倍濃縮洗液。。所述的血管緊張素II抗體包被板的固相載體為96孔或48孔的白色微孔板。所述的血管緊張素II化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的辣根過氧化物酶純度要求RZ彡3. 0,活性彡250U/mL。所述的發(fā)光液A包含0. IgL魯米諾和0. 165gL對碘酚；發(fā)光液B包含0.675gL過氧化脲。所述的20倍濃縮洗液包括75. 5gL Tris, 120gL NaCl,5mL / L Tween-20, IgLProclin300o一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟I) Ang II抗體包被板制備將Ang II抗體加到pH9. 6碳酸鹽緩沖液中混勻，在每個微孔板的孔中加IOOuL,于4°C冰箱中放置過夜，用洗滌液洗滌五次之后，用牛血清蛋白溶液對微孔板進行封閉，棄去孔內(nèi)液體后，將酶標(biāo)板干燥，密封，即得經(jīng)Ang II抗體包被的微孔板； 2)辣根過氧化物酶標(biāo)記Ang II,得Ang II酶結(jié)合物；利用高碘酸鈉氧化法，將Ang II與辣根過氧化物酶連接在一起，形成經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ang II ；
3) Ang II 校準(zhǔn)品；將Ang II抗原用校準(zhǔn)品稀釋液配制成不同濃度的校準(zhǔn)品(濃度分別為0，20，50，150，400，1000pg/mL),分裝，貼標(biāo)簽，儲存于2 8°C。4)Ang II質(zhì)控品的配制在正常人血清中加入適量的Ang II純品，配制低值質(zhì)控品(QcL)和高值質(zhì)控品(QcH)，其濃度的平均值分別為78. 50pg/mL和492. 94pg/mL。5)配制發(fā)光液A液和B液；A 液是含有 0. 7g / L 魯米諾和 0. 165g / L 對碘酚的 pH8. 6 的 5mmol / LTris .HCl緩沖液為液是濃度為0. 675g / L的過氧化脲，用工藝用水配制。6)配制20倍濃縮洗液；20倍濃縮洗液的配方如下75. 5gL Tris, 120g / L NaCl，5mL / L Tween-20, Ig /LProclin300o7)組裝將上述試劑組裝成盒，儲存于2 8V ;其中包含發(fā)光液A、發(fā)光液B、20倍濃縮洗液、Ang II酶結(jié)合物各I瓶，Ang II抗體包被板I塊，Ang II校準(zhǔn)品6瓶、Ang II質(zhì)控品2瓶。8)對采用該方法制得的試劑盒進行物理檢查，準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品測定值和穩(wěn)定性進行測定；進一步所述的包被板為包被含有Ang II抗體的96孔或48孔白色微孔板。本發(fā)明方法制備的試劑盒采用如下具體形式，其包括Ang II抗體包被的96孔或48孔的白色微孔板、辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ang II、不同濃度的Ang II校準(zhǔn)品、發(fā)光底液A為魯米諾和對碘酚、發(fā)光底液B為過氧化脲、20倍濃縮洗液為配方為75. 5g / L Tris，120g /L NaCl,5mL / L Tween-20, Ig / LProclin300oProClin300以其廣譜活性、優(yōu)越的兼容性和穩(wěn)定性及其在使用濃度下的低毒性，ProClin300成為用于診斷試劑的理想高效防腐劑。Proclin300防腐劑可在更長的時間內(nèi)根除細(xì)菌、真菌及酵母，從而延長產(chǎn)品的儲存時間。其水溶性確保其可輕易溶入所需試劑中。特別是，ProClin300防腐對大多數(shù)的酶或抗體交聯(lián)反應(yīng)的功能無影響，所以不會干擾檢驗指示劑。本專利發(fā)明的血管緊張素II定量檢測試劑盒，采用目前最為敏感的免疫測定方法——化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，具有以下有點(1)本產(chǎn)品分析靈敏度不高于0. 05pg / mL；
(2)本產(chǎn)品的特異性良好，與血管緊張素I及血管緊張素1-7的交叉特異性均小于1%。(3)精密度良好，批內(nèi)精密度不高于15%，批間精密度不高于20%。(4)穩(wěn)定性良好，本產(chǎn)品在37°C可存放7天以上，在疒8°C可存放I年。(5)特異性強，反應(yīng)快速，可在65分鐘內(nèi)判斷檢測結(jié)果，操作簡便，安全無環(huán)境污染。此外，本發(fā)明還具有檢測樣品的濃度范圍寬、試劑有效期長、穩(wěn)定性好、等優(yōu)點。性能優(yōu)于國內(nèi)同類產(chǎn)品，達(dá)到了國際先進水平，成本較國外的產(chǎn)品低。


圖I是本發(fā)明的博奧賽斯化學(xué)發(fā)光試劑盒測定Ang II與放免試劑盒測定Ang II的測定結(jié)果比較圖，其中縱坐標(biāo)為博奧賽斯測得的Ang II值，橫坐標(biāo)為放免試劑盒測定Ang II值，兩種方法相關(guān)系數(shù)(r) =0. 9754，直線方程y=0. 9861x_0. 2961。
具體實施例方式實施例I :制備血管緊張素II化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒血管緊張素II化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括 Ang II抗體包被板、辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ang II、Ang II校準(zhǔn)品、Ang II質(zhì)控品、發(fā)光液A液和B液、20倍濃縮洗液。通過下述方法制備血管緊張素II化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒I)包被將Ang II抗體加到pH=9. 6碳酸鹽緩沖液中混勻，在每個微孔板的孔中加IOOuL,于4°C冰箱中放置過夜，用洗滌液洗滌五次之后，用牛血清蛋白溶液對微孔板進行封閉，棄去孔內(nèi)液體后，將酶標(biāo)板干燥，密封，即得經(jīng)Ang II抗體包被的微孔板。2)利用高碘酸鈉氧化法，將Ang II與辣根過氧化物酶連接在一起，形成經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ang II。3 ) Ang II校準(zhǔn)品的配制將Ang II抗原用校準(zhǔn)品稀釋液配制成不同濃度的校準(zhǔn)品(濃度分別為0，20，50，150，400，1000pg/mL),分裝，貼標(biāo)簽，儲存于2 8°C。4)Ang II質(zhì)控品的配制在正常人血清中加入適量的Ang II純品，配制低值質(zhì)控品(QcL)和高值質(zhì)控品(QcH)，其濃度的平均值分別為78. 50pg/mL和492. 94pg/mL。5 )配制發(fā)光液A液和B液；A 液是含有 0. 7g / L 魯米諾和 0. 165g / L 對碘酚的 pH8. 6 的 5mmol / LTris .HCl緩沖液為液是濃度為0. 675g / L的過氧化脲，用工藝用水配制。6)配制20倍濃縮洗液；20 倍濃縮洗液的配制方法如下75. 5g / L Tris, 120gL NaCl，5mL / LTween-20，lgLProclin300o7)組裝將上述試劑組裝成盒，儲存于2 8°C ;其中包含發(fā)光液A、發(fā)光液B、20倍濃縮洗液、Ang II酶結(jié)合物各I瓶，Ang II抗體包被板I塊，Ang II校準(zhǔn)品6瓶、Ang II質(zhì)控品2瓶。8)對采用該方法制得的試劑盒進行物理檢查，準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品測定值和穩(wěn)定性進行測定。說明指標(biāo)檢測準(zhǔn)確性試劑盒校準(zhǔn)品與企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品系列同時進行分析測定，用Log(X)-Logit(Y)數(shù)學(xué)模型擬合，要求兩條劑量-反應(yīng)曲線不明顯偏離平行(t檢驗，11|〈2. 447);以企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品為對照品，用Log(X)-Logit(Y)數(shù)學(xué)模型擬合，試劑盒校準(zhǔn)品的實測值與標(biāo)示值比值的平均值應(yīng)在0. 90 1. 10范圍內(nèi)。企業(yè)校準(zhǔn)品的配制將高純度的Ang II用稀釋液(含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液)稀釋為系列梯度，經(jīng)WHO標(biāo)準(zhǔn)品(NIBSC編號86/538)標(biāo)定，其濃度分別為20、50、150、400、1000pg/mL，并以不含Ang II的稀釋液作為零值對照。劑量-反應(yīng)曲線的線性用Log(X)-Logit(Y)數(shù)學(xué)模型擬合，劑量-反應(yīng)曲線在(Tl2ng/mL濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r絕對值不低于0. 9900。分析靈敏度分析靈敏度不高于0. 05ng/mL。精密度批內(nèi)不精密度(CV%)應(yīng)不高于15.0%;批間不精密度(CV%)應(yīng)不高于20. 0%。
質(zhì)控品測定值平行測定10孔高值和低值的質(zhì)控品，用Log(X)-Logit(Y)數(shù)學(xué)模型擬合，質(zhì)控品測值應(yīng)在允許范圍內(nèi)，QcL和QcH的允許范圍分別為62. 80 94. 21pg/mL和394. 36 591. 53pg/mL。特異性交叉反應(yīng)應(yīng)符合下表要求。
權(quán)利要求
1.血管緊張素II化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:AngII抗體包被板、辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ang II、Ang II校準(zhǔn)品、Ang II質(zhì)控品、發(fā)光液A液和B液、20倍濃縮洗液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述 的血管緊張素II化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的血管緊張素II抗體包被板為包被含有Ang II抗體的96孔或48孔白色微孔板。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血管緊張素II化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的辣根過氧化物 酶純度要求RZ ^ 3. 0，活性> 250U/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的所述的血管緊張素II化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的Ang II質(zhì)控品包括低值質(zhì)控品和聞質(zhì)質(zhì)控品兩種，其中低值質(zhì)控品的濃度范圍是62. 80 94. 21pg/mL,高質(zhì)質(zhì)控品的濃度范圍是394. 36 591. 53pg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血管緊張素II化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的發(fā)光液A包含0. 7g / L魯米諾和0. 165gL對碘酚；發(fā)光液B包含0. 675g / L過氧化脲。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血管緊張素II化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的 20 倍濃縮洗液包括 75. 5g / L Tris，120g/L NaCl,5mL / LTween-20，Ig /LProclin300o
7.一種制備所述權(quán)利要求I的試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟 1)Ang II抗體包被板制備 將Ang II抗體加到pH9. 6碳酸鹽緩沖液中混勻，在每個微孔板的孔中加IOOuL,于4°C冰箱中放置過夜，用洗滌液洗滌五次之后，用牛血清蛋白溶液對微孔板進行封閉，棄去孔內(nèi)液體后，將酶標(biāo)板干燥，密封，即得經(jīng)Ang II抗體包被的微孔板； 2)辣根過氧化物酶標(biāo)記AngII,得Ang II酶結(jié)合物 利用高碘酸鈉氧化法，將Ang II與辣根過氧化物酶連接在一起，形成經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ang II ； 3)Ang II校準(zhǔn)品 將Ang II抗原用校準(zhǔn)品稀釋液配制成不同濃度的校準(zhǔn)品，濃度分別為0，20，50，150，·400，1000pg/mL,分裝，貼標(biāo)簽，儲存于2 8°C ； 4)AngII質(zhì)控品的配制在正常人血清中加入適量的Ang II純品，配制低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品，其濃度的平均值分別為78. 50pg/mL和492. 94pg/mL ； 5)配制發(fā)光液A液和B液 A液是含有0. 7g / L魯米諾和0. 165g / L對碘酚的pH8. 6的5mmol / LTris *HC1緩沖液為液是濃度為0. 675g / L的過氧化脲，用工藝用水配制； 6)配制20倍濃縮洗液 ·20 倍濃縮洗液的配方如下75. 5g/L Tris, 120g / L NaCl,5mL / L Tween-20,1g/LProclin300 ； 7)組裝 將上述試劑組裝成盒，儲存于2 8°C ; 8)對采用該方法制得的試劑盒進行物理檢查，準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品測定值和穩(wěn)定性進行測定。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述的包被板為包被含有有Ang II抗體的96孔或48孔白色微孔板。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種血管緊張素Ⅱ化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒，所述試劑盒包括AngII抗體包被板、辣根過氧化物酶標(biāo)記的AngII、AngII校準(zhǔn)品、AngⅡ質(zhì)控品、發(fā)光液A液和B液、20倍濃縮洗液。另外本發(fā)明還公開了一種血管緊張素Ⅱ化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測試劑盒的制備方法。本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有試劑盒相比操作簡便，安全無環(huán)境污染。此外，本發(fā)明還具有檢測樣品的濃度范圍寬、試劑有效期長、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/68GK102749455SQ20121021401
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月26日
發(fā)明者劉萍, 宋啟超, 張影, 范利花 申請人:博奧賽斯(天津)生物科技有限公司