專利名稱：高效液相色譜法測定組合物中巰基化合物含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組合物中巰基化合物含量的檢測方法，以及甲酸的新用途，更具體的，涉及甲酸作為穩(wěn)定劑，在使用高效液相色譜分析法測定組合物巰基化合物的含量及穩(wěn)定其有關(guān)物質(zhì)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
巰基化合物中以二巰基類的有機(jī)化合物的實(shí)際應(yīng)用較多見，它重要的代表是二巰丁二酸(DMSA)及其鈉鹽(Na-DMSA)、二巰丙磺酸及其鈉鹽(Na-DMPS)等，其主要的應(yīng)用之一是作為金屬、類金屬解毒藥，用于治療銻、汞、砷、鉛、銅等急、慢性中毒及肝豆?fàn)詈俗冃?銅代謝障礙)。隨著現(xiàn)代工業(yè)、交通、電子產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展以及對重金屬的大量開采和應(yīng)用，自然界中空氣、土壤、水源及食物中的生物鏈?zhǔn)艿街亟饘俚奈廴救沼鷩?yán)重，人們對重金屬，尤其 是鉛的接觸和吸收在逐漸增加。目前我國兒童鉛中毒的發(fā)生率為30% 50%。鉛中毒普遍性和嚴(yán)重性，目前已成為嚴(yán)重危害我國兒童健康的重大隱患之一，嚴(yán)重影響到兒童的發(fā)育和健康成長。目前，臨床上最有代表性的重金屬解毒劑就是二巰丙磺酸鈉(Na-DMPS)、二巰丁二酸鈉(Na-DMS)、二巰丙醇(BAL)、二巰丁二酸(DMSA)等。其中二巰丁二酸因其口服有效，療效確切，毒性低，使用方便，已被國內(nèi)外作為首選的重金屬解毒劑，用于解救鉛、汞、砷、鎳、銅等金屬中毒。國內(nèi)臨床上解毒劑使用較多的劑型是注射液，例如二巰丙醇注射液、二巰丁二鈉注射液，而口服的目前只有二巰丁二酸成人膠囊，品種極少，尚未見適合兒童口服的專用劑型，所以開發(fā)此類藥品具有現(xiàn)實(shí)而迫切的意義。與此同時，目前該類藥品在對應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)領(lǐng)域也缺乏簡便易行的方法，這可能與產(chǎn)品本身因含有巰基而導(dǎo)致不穩(wěn)定等因素有關(guān)。對臨床口服應(yīng)用最廣泛的二巰丁二酸而言，現(xiàn)行除《中國藥典》2000版和2010版有提出質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)外，各國藥典包括USP (31版)、BP (2008年)以及JP (15改正版)均未收載該品種，而且《中國藥典》上收載的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)都過于簡單，含量測定采用沉淀滴定法，因其降解的有關(guān)物質(zhì)很不穩(wěn)定而使質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的制定難度加大。因為二巰類化合物分子結(jié)構(gòu)中含有活潑的巰基官能團(tuán)，尤其在含水的溶液中不穩(wěn)定，其中一種不穩(wěn)定現(xiàn)象之一包括巰基官能團(tuán)分子內(nèi)或分子間互相縮合形成雙硫鍵，例如申請人經(jīng)質(zhì)譜分析確定，二巰丁二酸在水中部分降解成雙硫化物(R-S-S-R)這種有關(guān)物質(zhì)。而在采用反相高效液相色譜法分析該類化合物的含量和有關(guān)物質(zhì)時，樣品供試液和流動相中必然含有水，這樣就無法避開產(chǎn)品的不穩(wěn)定和有關(guān)物質(zhì)增多的問題。顯然，在采用高效液相色譜分析過程中，如果因為流動相含水的問題以及樣品分析的前處理、測試過程中導(dǎo)致了二巰化合物含量的降低和有關(guān)物質(zhì)的增大，那么很容易給二巰類解毒藥品例如膠囊、片劑等固體制劑產(chǎn)品本身固有的穩(wěn)定性造成誤會，因為固體產(chǎn)品的含量偏低或有關(guān)物質(zhì)的增大都可能是分析測試過程中造成的，進(jìn)而無法體現(xiàn)產(chǎn)品本來固有的準(zhǔn)確含量，造成測試數(shù)據(jù)的偏差。以二巰丁二酸為例，現(xiàn)有的分析方法包括沉淀滴定法、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜熒光法(HPLC-FR)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)等。其中的沉淀滴定法，是中國藥典采用的方法，不但誤差大，對降解的雜質(zhì)的測定也無能為力。熒光衍生化法是基于HPLC的方法，但是對樣品的熒光化處理程序繁瑣，還需要配備專門的熒光檢測器。液質(zhì)聯(lián)用法操作成本高，也不便捷，不能普適于一般性藥廠對產(chǎn)品的質(zhì)控要求。一些文獻(xiàn)中也盡管采用單獨(dú)的HPLC法，但是經(jīng)申請人試驗發(fā)現(xiàn)，對樣品測試的穩(wěn)定性難以達(dá)到滿意的水平，在含水的流動相中巰基化合物容易部分降解，特別是隨著測定時間的延長，巰基化合物不斷的降解，容易導(dǎo)致測得的含量比實(shí)際的含量偏低
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是公開一種高效液相色譜法測定組合物中巰基化合物含量的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。本發(fā)明還涉及甲酸的新用途，在使用高效液相色譜分析法測定組合物中巰基化合物的含量時作為穩(wěn)定劑的應(yīng)用。本發(fā)明所述的高效液相色譜法測定組合物中巰基化合物含量的方法，其特征在于，流動相為含有甲酸的水相與有機(jī)相的混合物，色譜柱為反相色譜柱，檢測器為紫外檢測器；所述有機(jī)相為甲醇或乙腈；所述水相是磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、離子對試液或純水；有機(jī)相水相甲酸=50 500 949 460 I 40，體積比；以樣品供試液的體積計，樣品供試液中，甲酸體積百分比為O. 5 10. 0% ；樣品供試液的存儲環(huán)境優(yōu)選為O 8°C的低溫存儲；所述磷酸鹽緩沖液為I 100mmol/L的磷酸鹽溶液、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，磷酸二氫銨中的一種或幾種；所述醋酸鹽緩沖液為I lOOmmol/L的醋酸鈉、醋酸銨、醋酸鉀的一種或幾種；所述離子對試劑溶液為I lOOmmol/L的離子對試劑四丁基溴化銨、四丁基硫酸氫銨、四甲基溴化銨或四甲基硫酸氫銨；所述的巰基化合物是所有含兩個或多個巰基官能團(tuán)的有機(jī)化合物，優(yōu)選為2，3- 二巰基丁二酸及其鈉鹽、2，3- 二巰基丙烷磺酸及其鈉鹽、2，3- 二巰基-I-丙醇或1，4- 二巰基-2，3- 丁二醇。進(jìn)一步優(yōu)選為2，3- 二巰基丁二酸；所述反相色譜柱為C18或C8填料的反相色譜柱,檢測波長是200 285nm，流速是0. 5ml/min I. 5ml/min ;流動相的洗脫方式為等度洗脫或梯度洗脫,優(yōu)選為等度洗脫；采用上述的色譜柱、流動相和檢測器進(jìn)行檢測的過程，為常規(guī)的，如《天麻飲片中天麻素的含量測定方法的研究》(徐金章、楊水新，《中成藥》2011,23(11)，P795-797)等文獻(xiàn)報導(dǎo)的過程；優(yōu)選的，包括如下步驟(I)色譜條件
色譜柱填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠(250mmX4. 6mm, 5 μ m)；流動相將甲醇、水和甲酸按以下體積比混合甲醇水甲酸= 200 400 796 588 4 12 ;洗脫方式單通道等度洗脫；流速0.8ml/min I. 2ml/min ；檢測波長210 254nm ；柱溫25 35°C ;進(jìn)樣量:10 50 μ I ； (2)稀釋溶劑的配制向所述的流動相中添加甲酸，按體積計，甲酸添加量為流動相的O. 5 2. 0%，為稀釋用的溶液A ；(3)供試品溶液和對照品溶液的配制取含巰基化合物的樣品，用甲醇溶解，并用溶液A稀釋，配制成每ImL中含巰基化合物O. 05 3. Omg的供試品溶液；另取對應(yīng)的含巰基化合物對照品，同法配制成每ImL中含巰基化合物O. 05 3. Omg的對照品溶液，并且均放置于4 8°C的低溫環(huán)境中待測；(5)取供試品溶液和對照品溶液各10 50 μ I注入液相色譜儀，進(jìn)行檢測分析；檢測分析的過程，是公知的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員，可以根據(jù)《HPLC測定二巰丁二酸的有關(guān)物質(zhì)》(樂健等，《中國藥學(xué)雜質(zhì)》2011，46(13) ,Ρ1030-1033)等文獻(xiàn)報導(dǎo)的方法，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析檢測，本發(fā)明不再贅述；本發(fā)明所述的高效液相色譜法是指高效液相色譜法的單獨(dú)使用，不包括與質(zhì)譜法的聯(lián)合使用，高效液相色譜-質(zhì)譜法的聯(lián)合使用方法不在本專利約束的范圍內(nèi)。本發(fā)明具有以下有益的效果與僅僅包含有磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、離子對試液或單獨(dú)的純水作流動相相比較而言，這些流動相中如果加入了適量的甲酸，可以明顯解決或減緩巰基化合物在供試液和流動相中的極端不穩(wěn)定現(xiàn)象而造成的含量測定誤差，對二巰丁二酸而言，還可避免磷酸鹽緩沖液的色譜圖峰形造成分叉的影響，起到優(yōu)化色譜圖峰形的好處。而且，同時在樣品供試液中也加入適量的甲酸，結(jié)合流動相中加入的甲酸，那么，在整個樣品前處理和色譜分析測試過程，可以很好的保證巰基化合物的含量測定的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，為起草含巰基官能團(tuán)化合物的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供了可靠的保證。同時為巰基化合物降解出的有關(guān)物質(zhì)的精密測定提供了重要的參考價值。


圖I為實(shí)施例I的檢測結(jié)果。圖2為對比實(shí)施例I的檢測結(jié)果。圖3為實(shí)施例2的檢測結(jié)果之一。圖4為實(shí)施例2的檢測結(jié)果之二。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I二巰丁二酸的有關(guān)物質(zhì)液相分析方法儀器和色譜條件
色譜儀Angilent 1100型高效液相色譜儀；色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，Angilent SB C184. 6 X 250mm, 5 μ m ；檢測波長234nm，流速I. Oml/min ;洗脫方式為單通道等度洗脫；柱溫35°C。流動相和溶液A :流動相為甲醇、水和甲酸的混合物，體積比為，甲醇水甲酸=240 752 8 ；溶液A :采用流動相。實(shí)施步驟測定方法
取二巰丁二酸顆粒劑I. O克，約相當(dāng)于二巰丁二酸66. 7mg,置于25ml量瓶中，加甲醇適量超聲約5min后，甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過后取續(xù)濾液作為母液，量取母液2ml，置于IOml量瓶中，加溶液A稀釋至刻度，搖勻，制成每ImL中約含二巰丁二酸530 μ g的溶液，作為供試品溶液；另量取該供試品溶液適量，加流動相制成每Iml中約含二巰丁二酸10. 6 μ g的溶液，作為對照品溶液。取對照品溶液50μ I注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的20% ;再準(zhǔn)確量取上述兩種溶液各50 μ I注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的4倍。靈敏度試驗方法逐級稀釋供試品溶液濃度，按信噪比3 1測定。實(shí)驗結(jié)果本方法具備較好的靈敏度，二巰丁二酸的最低檢出量為55ng。專屬性試驗堿破壞取本品適量，置25ml量瓶中，加入O. lmol/L氫氧化鈉溶液適量，漩渦振蕩混勻，并置室溫下過夜24小時后，用甲醇定容到刻度后，照測定方法項下的方法及色譜條件進(jìn)行測定，并記錄HPLC色譜圖。酸破壞取本品適量，置25ml量瓶中，加入4mol/L鹽酸溶液適量，漩渦振蕩混勻，并置室溫下過夜24小時后，用甲醇定容到刻度后，照測定方法項下的方法及色譜條件進(jìn)行測定，并記錄HPLC色譜圖。氧化破壞取本品適量，置25ml量瓶中，加入5%過氧化氫溶液適量，漩渦振蕩混勻片刻后，加甲醇定容到刻度后，照測定方法項下的方法及色譜條件進(jìn)行測定。高溫破壞取本品適量，置25ml量瓶中，加入去離子水約2ml，漩渦振蕩混合均勻，并置烘箱100°c的溫度下15min，取出，放冷，加甲醇定容到刻度后，照測定方法項下的方法及色譜條件進(jìn)行測定，并記錄HPLC色譜圖。結(jié)果表明本品經(jīng)強(qiáng)氧化劑、高溫、酸和堿破壞后，各降解產(chǎn)物之間和降解產(chǎn)物與主藥之間，在有關(guān)物質(zhì)項下的HPLC色譜條件下均能被檢出，且得到較好的分離。另外，二巰丁二酸的色譜峰形對稱性極好，出峰時間在4. 879min,其部分降解的有關(guān)物質(zhì)(雙硫物R-S-S-R)的出峰時間在8. 639min,與二巰丁二酸之間得到良好的分離，且能被有效檢測出。按面積歸一化看，有關(guān)物質(zhì)為O. 13%，沒有出現(xiàn)二巰丁二酸明顯的向該雙硫物部分降解的跡象，甲酸對促進(jìn)二巰丁二酸穩(wěn)定性起到重要作用。具體見附圖I。對比實(shí)施例I
儀器和色譜條件基本同實(shí)施例1，除了流動相和溶液A不同外。流動相甲醇-O. 04mol/l磷酸二氫鈉水溶液(加I. 6g/L硫酸氫四丁基銨，并以磷酸調(diào)pH至3. 2) =900-100，體積比。溶液A :采用流動相。實(shí)施步驟取實(shí)施例I中由甲醇稀釋制成的母液，加本流動相制成每Iml中約含二巰丁二酸530 μ g的溶液作為供試品溶液,另量取該供試品溶液適量,加流動相制成每Iml中約含二巰丁二酸10. 6 μ g的溶液，作為對照品溶液。同實(shí)施例I的方式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在沒有向流動相和溶液A中添加促穩(wěn)定劑甲酸的情況下，二巰丁二酸的色譜峰的尾端有明顯的分叉，與實(shí)施例I比較，含量略低，而有關(guān)物質(zhì)偏高達(dá)0.9%。具體見附圖2。實(shí)施例2 二巰丁二酸的液相分析的含量穩(wěn)定性試驗儀器和色譜條件Angilent 1100型高效液相色譜儀及Angilent LC ChemStation色譜工作站；色譜柱Angilent C18 4. 6X250mm,5ym ;流速為I. Oml/min,單泵單通道走流動相；檢測波長為234nm ;柱溫35°C ;進(jìn)樣量為50 μ I。流動相一(供含量測定和各項方法學(xué)驗證)為甲醇、水和甲酸的混合物，體積比，甲醇水甲酸=240 753 7 ；流動相二(供穩(wěn)定性試驗項下的參照對比)體積比，甲醇25mmol/l醋酸鈉緩沖液(含lOmmol/1的四丁基硫酸氫銨，以乙酸調(diào)pH3. 5) = 350 650 ；含量測定的方法取二巰丁二酸顆粒劑I. O克(約相當(dāng)于二巰丁二酸66. 7mg)，置于25ml量瓶中，力口甲醇適量，超聲5min后，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，量取續(xù)濾液1ml，置于25ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成每Iml中約含二巰丁二酸106. 7μ g的溶液。精密量取50 μ 1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取二巰丁二酸對照品適量，用甲醇適量溶解，并用流動相定量稀釋制成每Iml中約含二巰丁二酸106. 7μ g的溶液，同法測定，按外標(biāo)法以峰面積計算。標(biāo)準(zhǔn)曲線取二巰丁二酸對照品適量，加甲醇配成濃度2. 88mg/ml的對照品貯備液。精密吸取上述貯備液適量，置25ml量瓶中，用流動相配成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取50 μ I注入液相色譜儀。照含量測定項下的方法和色譜條件測定，測定結(jié)果見表I。表I標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.甲酸在使用高效液相色譜分析法測定組合物中巰基化合物的含量時作為穩(wěn)定劑的應(yīng)用。
2.高效液相色譜法測定組合物中巰基化合物含量的方法，其特征在于，流動相為含有甲酸的水相與有機(jī)相的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，色譜柱為反相色譜柱，檢測器為紫外檢測器。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)相為甲醇或こ腈；所述水相是磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、離子對試液或純水。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，有機(jī)相水相甲酸=50 500 949 460 I 40，體積比。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，以樣品供試液的體積計，樣品供試液中，甲酸體積百分比為0. 5 10. 0%。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液為I lOOmmol/L的磷酸鹽溶液、磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鈉、磷酸ニ氫鉀、磷酸氫ニ鉀，磷酸ニ氫銨中的一種或幾種； 所述醋酸鹽緩沖液為I lOOmmol/L的醋酸鈉、醋酸銨、醋酸鉀的ー種或幾種； 所述離子對試劑溶液為I lOOmmol/L的離子對試劑四丁基溴化銨、四丁基硫酸氫銨、四甲基溴化銨或四甲基硫酸氫銨。
8.根據(jù)權(quán)利要求2 7任一項所述的方法，其特征在于，所述的巰基化合物是所有含兩個或多個巰基官能團(tuán)的有機(jī)化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的巰基化合物為2，3-ニ巰基丁ニ酸及其鈉鹽、2，3- ニ疏基丙燒橫酸及其鈉鹽、2，3- ニ疏基-I-丙醇或1，4- ニ疏基-2，3- 丁ニ醇。進(jìn)ー步優(yōu)選為2，3-ニ巰基丁ニ酸。
10.高效液相色譜法測定組合物中巰基化合物含量的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)色譜條件 色譜柱填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠(250mmX4. 6mm, 5 u m)； 流動相將甲醇、水和甲酸按以下體積比混合甲醇水甲酸=200 400 796 -588 4 12 ; 洗脫方式單通道等度洗脫；流速0. 8ml/min I. 2ml/min ； 檢測波長:210 254nm ； 柱溫25 35°C ； 進(jìn)樣量10 50ii I ; (2)稀釋溶劑的配制向所述的流動相中添加甲酸，按體積計，甲酸添加量為流動相的-0.5 2. 0%，為稀釋用的溶液A ； (3)供試品溶液和對照品溶液的配制取含巰基化合物的樣品，用甲醇溶解，并用溶液A稀釋,配制成姆ImL中含巰基化合物0. 05 3. Omg的供試品溶液； 另取對應(yīng)的含巰基化合物對照品，同法配制成姆ImL中含巰基化合物0. 05 3. Omg的對照品溶液， 并且均放置于4 8°C的低溫環(huán)境中待測；(5)取供試品溶液和對照品溶液各10 50iU注入液相色譜儀，進(jìn)行檢測分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效液相色譜法測定組合物中巰基化合物含量的方法，公開了甲酸在使用高效液相色譜分析法測定組合物中巰基化合物的含量時作為穩(wěn)定劑的應(yīng)用，流動相為含有甲酸的水相與有機(jī)相的混合物。本發(fā)明與僅僅包含有磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、離子對試液或單獨(dú)的純水作流動相相比較而言，可以明顯解決或減緩巰基化合物在供試液和流動相中因極端不穩(wěn)定現(xiàn)象而造成的含量測定誤差，對有些巰基化合物還可避免磷酸鹽緩沖液的色譜圖峰形造成分叉的影響，起到優(yōu)化色譜圖峰形的好處?？梢院芎玫谋ＷC巰基化合物的含量測定的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。
文檔編號G01N30/06GK102759586SQ20121022592
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月2日
發(fā)明者倪睿, 史家駿, 陳志明, 馬晉隆 申請人:上海現(xiàn)代藥物制劑工程研究中心有限公司