專利名稱：一種基于微流控芯片的病原體檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于微流控芯片的病原體檢測(cè)方法，屬于化學(xué)及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，連續(xù)爆發(fā)非典、禽流感、手足口病、甲型HlNl流感。每一次嚴(yán)重傳染性疾病的流行都給社會(huì)、經(jīng)濟(jì)造成了巨大的損失，給人的生命帶來(lái)了極大威脅。目前常用的病原體檢測(cè)方法有PCR技術(shù)、培養(yǎng)技術(shù)、免疫酶技術(shù)(EIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。這些技術(shù)在臨床診斷中已發(fā)揮了巨大的作用，但仍存在一些缺點(diǎn)，大多比較耗時(shí)，處理過(guò)程復(fù)雜且成本高。建立一種快速、靈敏、特異的檢測(cè)病原體的方法是預(yù)防和控制傳染病的重要保證。
微流控芯片技術(shù)是在一塊幾平方厘米的芯片上構(gòu)建化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室，將化學(xué)和生物實(shí)驗(yàn)中說(shuō)涉及到的各種樣品處理，反應(yīng)，分離，檢測(cè)等集成到一起，具有微型化、自動(dòng)化、樣品消耗量小、檢測(cè)效率高等優(yōu)點(diǎn)。磁性粒子作為一個(gè)固相載體，在靶向物質(zhì)識(shí)別，分離，控制給藥，分選細(xì)胞等方面具有廣泛的用途。在微流控芯片上結(jié)合磁珠技術(shù)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。由于量子點(diǎn)具有獨(dú)特又優(yōu)越的光學(xué)性能，如消光系數(shù)大，量子產(chǎn)率高，激發(fā)光譜寬，發(fā)射光譜窄，亮度比傳統(tǒng)的熒光染料高10-100倍，光穩(wěn)定性比傳統(tǒng)的熒光染料高100-1000倍等特點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于生物熒光標(biāo)記。我們將微流控芯片、磁免疫分析及熒光檢測(cè)相結(jié)合，建立了一種快速、高效、低耗，高特異性、高靈敏度、實(shí)時(shí)的病原體檢測(cè)方法，為病原體的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了強(qiáng)有力的工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種快速、高效的病原體的檢測(cè)方法。以集成微磁場(chǎng)的微流控芯片作為反應(yīng)的容器，磁球作為固相載體，鏈酶親和素修飾的量子點(diǎn)(SA-QDs)作為熒光標(biāo)記物，在微磁場(chǎng)的作用下，在芯片通道中特定部位捕獲磁球，形成了微反應(yīng)區(qū)，通過(guò)夾心免疫反應(yīng)捕獲病原體，通過(guò)生物素與鏈酶親和素的相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的熒光免疫定量分析。在芯片上實(shí)現(xiàn)了病原體的分離、富集、免疫反應(yīng)、分析檢測(cè)。具體的技術(shù)方案包括如下步驟
(O集成微磁場(chǎng)的微流控芯片的制作用軟刻蝕的方法制得微流控芯片的陽(yáng)模；將兩個(gè)導(dǎo)磁棒固定于陽(yáng)模微通道的兩側(cè)，導(dǎo)磁棒之間的夾角是O 180°，導(dǎo)磁棒所形成的平面與微芯片的平面之間的夾角是90° ;采用原位反應(yīng)成型法，將液態(tài)預(yù)聚物倒在固定導(dǎo)磁棒的陽(yáng)模上，反應(yīng)固化后，脫模成型，打進(jìn)樣孔和出樣孔，然后與蓋片鍵合，即得到集成微磁場(chǎng)的微流控芯片(如圖1、2所示)；(2)修飾有抗特定病原體表面蛋白單抗的磁球制備用乙基-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺(EDAC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)混合物活化磁球表面的羧基，然后加入抗待測(cè)病原體表面蛋白的單抗，后將連有抗體的磁球分散在含有疊氮化鈉、BSA的PBS (pH 7. 4)緩沖液中，保存?zhèn)溆茫?br> (3)生物素化的抗病原體表面蛋白單抗的制備采用生物素化的試劑盒在HA單抗上修飾生物素，用脫鹽柱進(jìn)行純化；
(4)在芯片上進(jìn)行磁性?shī)A心免疫熒光反應(yīng)檢測(cè)病原體首先用BSA溶液封閉芯片通道，同時(shí)在芯片的導(dǎo)磁棒上各放一塊永磁鐵，然后依次向通道中注入修飾有抗特定病原體表面蛋白單抗的磁球、特定病原體、生物素化的抗該病原體表面蛋白單抗、鏈酶親和素修飾的量子點(diǎn)(SA-QDs)，每步反應(yīng)后都用PBS緩沖液沖洗通道，洗掉未反應(yīng)的藥品，最后通過(guò)熒光顯微鏡與光纖光譜儀進(jìn)行熒光檢測(cè)。上述方案中步驟(I)中制備微流控芯片的材料為彈性體聚合物如聚二甲基硅氧烷(PDMS)和熱塑性材料如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)等；制 作微流控芯片用的陽(yáng)模為金屬基陽(yáng)模、單晶硅陽(yáng)?；虿Ａш?yáng)模；制作導(dǎo)磁捧材料為氧化鐵或硅鋼類軟磁性材料。本發(fā)明建立了一種基于微流控芯片、磁球、量子點(diǎn)的簡(jiǎn)單快速檢測(cè)病原體的磁性熒光免疫檢測(cè)方法。將微流控芯片、磁免疫分析及熒光檢測(cè)相結(jié)合，兼具了微流控芯片的快速、高效和樣品用量小，磁免疫分析的高特異性、強(qiáng)可操縱性，及量子點(diǎn)優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，是一種簡(jiǎn)單、快速、高效、便攜、適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的方法。本發(fā)明可更廣泛地應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)科學(xué)等領(lǐng)域。


圖I為實(shí)施例I中的微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖，圖中I.微流控芯片基片、2.微通道、3.導(dǎo)磁棒、4.永磁鐵、5.蓋片。圖2為實(shí)施例I中的縱剖面結(jié)構(gòu)示意圖，圖中I.微流控芯片基片、2.微通道、
3.導(dǎo)磁棒、4.永磁鐵、5.蓋片。圖3為實(shí)施例I中的芯片上磁性熒光免疫檢測(cè)病原體的流程示意圖。圖4為實(shí)施例2中的不同濃度H9N2磁性熒光免疫檢測(cè)的熒光圖片(a)，與對(duì)應(yīng)的光譜圖(b)。圖5為實(shí)施例2中的不同濃度H9N2與熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)圖(a)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(b)，與圖4對(duì)應(yīng)。圖6為實(shí)施例2中的檢測(cè)H9N2磁性?shī)A心免疫熒光檢測(cè)方法的特異性分析，包括試劑空白及陰性對(duì)照的熒光圖片(a)，與對(duì)應(yīng)的光譜圖(b)。圖7為實(shí)施例2中的檢測(cè)H9N2磁性?shī)A心免疫熒光檢測(cè)方法的特異性分析，包括試劑空白及陰性對(duì)照的柱狀圖，與圖6對(duì)應(yīng)。圖8為實(shí)施例3中的不同濃度NDV磁性熒光免疫檢測(cè)的熒光圖片(a)，與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(b)。圖9為實(shí)施例3中的檢測(cè)NDV磁性?shī)A心免疫熒光檢測(cè)方法的特異性分析，包括試劑空白及陰性對(duì)照的熒光圖片(a)，與對(duì)應(yīng)的柱狀圖(b)。
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例I
(I)集成芯片的制作方法
運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)的軟光刻制作技術(shù)，在潔凈平整的硅片表面甩上一層AZ50XT的光刻膠，得到一個(gè)40 μ m左右的厚度，在打印的膠片掩膜的遮蔽下用紫外線曝光，顯影，得到一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的凸出于娃片表面的掩膜。將兩個(gè)自制導(dǎo)磁棒固定于陽(yáng)模微通道的兩側(cè)，導(dǎo)磁棒之間的夾角是O 180°，導(dǎo)磁棒所形成的平面與微芯片的平面之間的夾角是90°，調(diào)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)的預(yù)聚物質(zhì)量比為10:1 (質(zhì)量比)，真空排除氣泡，傾倒于掩膜之上，然后在烘箱中75°C烘3-4小時(shí)，固化后，用手術(shù)刀切開(kāi)，從掩膜上面揭起，圖案就復(fù)制到PDMS上，用一個(gè)平頭的打孔針打進(jìn)樣和出樣口 ；將潔凈的載玻片和具有流體通道的PDMS，放于氧等離子體中處理70s活化PDMS表面，產(chǎn)生大量羥基自由基，取出，將朝上的兩面扣在一起，在烘箱中75°C烘10分鐘，實(shí)現(xiàn)永久鍵合。 (2)修飾有抗特定病原體表面蛋白單抗的磁球(Master Beads Carboxylic Acid0215, 500 nm diameter)制備
10 μ L表面為羧基功能團(tuán)的超順磁性球(首先用0.01 mo I/L pH 7.4的PBS洗三次。然后將磁球分散在含 O. 10 mol/L EDAC 和 O. I mol/L NHS 的 O. 01 mol/L pH 7. 4 的 PBS 溶液中，37°C搖床上振蕩反應(yīng)30 min，活化磁性球表面的羧基。接著用O. 01 mol/L pH 7.4的PBS洗三次后，將其分散在180 μ L 0.01 mol/L pH 7.4的PBS溶液中，然后加入20 μ L
0.59 mg/mL的抗特定病原體表面蛋白單抗溶液，搖床上振蕩反應(yīng)2 h。反應(yīng)后用0. 01 mol/L pH 7.4的PBS洗三次，除去沒(méi)有反應(yīng)的鏈霉親和素，然后將其分散在I mL 2%的BSA中，封閉30 min。最后用0.01 mol/L pH 7.4的PBS洗三次，將其分散在含0. 05 %疊氮化鈉2% BSA 的 0. 01 mol/L pH 7. 4 PBS 中，4 °C 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?3)生物素化的抗特定病原體表面蛋白單抗的制備
利用生物素化試劑Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo),通過(guò)與該病原體表面蛋白單抗的氨基反應(yīng)，將生物素連接到抗體上。具體操作如下取0. Img生物素化試劑3111作-順5-1^(-8丨0衍11，加入到8(^1^超純水中，然后再加入20 μ L 0. 59 mg/mL的抗該病原體表面蛋白單抗溶液，室溫?fù)u床反應(yīng)2h。多余的生物素化試劑利用NAP-5 (GEHealthcare)的脫鹽柱除掉,獲得體積為500 μ L標(biāo)記好的抗該病原體表面蛋白單抗溶液。(4)在芯片上進(jìn)行磁性?shī)A心免疫熒光反應(yīng)檢測(cè)病原體。實(shí)驗(yàn)方案如圖3所示，首先用BSA溶液封閉通道，30min后，用PBS緩沖液洗lmin，同時(shí)在集成芯片的導(dǎo)磁棒上各放一塊永磁鐵(“NS”磁極對(duì))，然后注入2μ L修飾有抗特定病原體表面蛋白單抗修飾的磁球(圖3 - a)，在微磁場(chǎng)的作用下形成了微反應(yīng)區(qū)(圖3 - b)；PBS緩沖液洗后，再注入2μ L該病原體顆粒(圖3 - C)，停流孵育5min (圖3 — d);接著PBS緩沖液洗通道，注入2μ L生物素化的抗該病原體表面蛋白的單抗(圖3 - e)，停流孵育5min (圖3 — f) ；PBS緩沖液洗通道，然后注入2 μ L鏈酶親和素修飾的量子點(diǎn)(圖3 — g)，停流孵育5min (圖3 — h);最后用PBS緩沖液洗掉沒(méi)有反應(yīng)上的SA-QDs，通過(guò)熒光顯微鏡與光纖光譜儀進(jìn)行熒光檢測(cè)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中泵的流速為luL/min。該技術(shù)可以快速、高效實(shí)現(xiàn)對(duì)很多病原體的檢測(cè)。如H9N2 (實(shí)施例1)，新城疫(Newcastle Disease Virus NDV )(實(shí)施例 2), H1N1, H5N1 等病毒顆粒。
實(shí)施例2
利用實(shí)施例I的方法制作了集成芯片，制備了修飾有抗H9N2禽流感病毒表面蛋白HA單抗的磁球和生物素化的抗H9N2禽流感病毒表面蛋白HA單抗。然后在芯片上進(jìn)行磁性?shī)A心免疫熒光反應(yīng)檢測(cè)H9N2。圖4為不同濃度H9N2磁性熒光免疫檢測(cè)的熒光圖片(a)，與對(duì)應(yīng)的光譜圖(b)。圖5為不同濃度H9N2與熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)圖(a)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(b)，與圖4對(duì)應(yīng)。圖6為檢測(cè)H9N2磁性?shī)A心免疫熒光檢測(cè)方法的特異性分析，熒光圖片(a)，與對(duì)應(yīng)的光譜圖(b)。圖7為檢測(cè)H9N2磁性?shī)A心免疫熒光檢測(cè)方法的特異性分析，包括試劑空白及陰性對(duì)照的柱狀圖，與圖6對(duì)應(yīng)。實(shí)施例3
利用實(shí)施例I的方法制作了集成芯片，制備了修飾有抗新城疫病毒(NDV)表面蛋白HA單抗的磁球和生物素化的抗新城疫病毒表面蛋白HA單抗。然后在芯片上進(jìn)行磁性?shī)A心免 疫熒光反應(yīng)檢測(cè)H9N2。圖8為不同濃度NDV磁性熒光免疫檢測(cè)的熒光圖，光譜圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖9為檢測(cè)NDV磁性?shī)A心免疫熒光檢測(cè)方法的特異性分析，包括試劑空白及陰性對(duì)照的熒光圖，光譜圖，柱狀圖。
權(quán)利要求
1.一種基于微流控芯片的病原體檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)集成微磁場(chǎng)的微流控芯片的制作用軟刻蝕的方法制得微流控芯片的陽(yáng)模；將兩個(gè)導(dǎo)磁棒固定于陽(yáng)模微通道的兩側(cè)，導(dǎo)磁棒之間的夾角是O 180°，導(dǎo)磁棒所形成的平面與微芯片的平面之間的夾角是90° ;采用原位反應(yīng)成型法，將液態(tài)預(yù)聚物倒在固定導(dǎo)磁棒的陽(yáng)模上，反應(yīng)固化后，脫模成型，打進(jìn)樣孔和出樣孔，然后與蓋片鍵合，即得到集成微磁場(chǎng)的微流控芯片； (2)修飾有抗特定病原體表面蛋白單抗的磁球制備用こ基-[3-(ニ甲胺基)丙基]碳ニ亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺混合物活化磁球表面的羧基，然后加入抗待測(cè)病原體表面蛋白的單抗，后將連有抗體的磁球分散在含有疊氮化鈉、BSA的PBS緩沖液中，保存?zhèn)溆茫? (3)生物素化的抗病原體表面蛋白單抗的制備采用生物素化的試劑盒在HA單抗上修飾生物素，用脫鹽柱進(jìn)行純化； (4)在芯片上進(jìn)行磁性?shī)A心免疫熒光反應(yīng)檢測(cè)病原體首先用BSA溶液封閉芯片通道，同時(shí)在芯片的導(dǎo)磁棒上各放ー塊永磁鐵，然后依次向通道中注入修飾有抗特定病原體表面蛋白單抗的磁球、特定病原體、生物素化的抗該病原體表面蛋白單抗、鏈酶親和素修飾的量子點(diǎn)，每步反應(yīng)后都用PBS緩沖液沖洗通道，洗掉未反應(yīng)的藥品，最后通過(guò)熒光顯微鏡與光纖光譜儀進(jìn)行熒光檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，制備微流控芯片的材料為聚ニ甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酷、聚碳酸酷、聚苯こ烯。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在干，制作微流控芯片用的陽(yáng)模為金屬基陽(yáng)模、單晶硅陽(yáng)?；虿Ａш?yáng)模。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在干，制作導(dǎo)磁捧材料為氧化鐵或硅鋼類軟磁性材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于微流控芯片的病原體檢測(cè)方法。該方法以集成微磁場(chǎng)的微流控芯片作為反應(yīng)的容器，磁球作為固相載體，鏈酶親和素修飾的量子點(diǎn)(SA-QDs)作為熒光標(biāo)記物，在微磁場(chǎng)的作用下，在芯片通道中特定部位捕獲磁球，形成了微反應(yīng)區(qū)，通過(guò)夾心免疫反應(yīng)捕獲病原體，通過(guò)生物素與鏈酶親和素的相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的熒光免疫定量分析。該檢測(cè)方法將微流控芯片、磁免疫分析及熒光檢測(cè)相結(jié)合，兼具了微流控芯片的快速、高效和樣品用量小，磁免疫分析的高特異性、強(qiáng)可操縱性，及量子點(diǎn)優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，是一種多目標(biāo)的，實(shí)時(shí)的病原體檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102854304SQ20121023229
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者張志凌, 張瑞巧, 李安珺, 龐代文 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)