專利名稱：一種增加測序讀長的測序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種增加測序讀長的測序方法。
背景技術(shù)：
目前，檢測基因序列突變的金標準是測序方法，常見的是sanger測序法和焦磷酸測序法(Pyrosequencing),其中 Pyrosequencing 適用于高通量分析。Pyrosequencing在測序時，連接有測序片段的磁珠固定于蝕刻光纖玻片(PTP板)的小孔中。由于小孔較大(55iimX44iim)因此為使測序時磁珠位置固定不 變，需要向小孔中填充含有多種蛋白的復(fù)合物以保證測序及采圖的順利進行，再加上熒光素酶的使用，這些因素導(dǎo)致Pyrosequencing 的成本高。為使測序成本降低，現(xiàn)有技術(shù)采用連接測序法代替Pyrosequencing進行測序?，F(xiàn)有的一種連接測序法是利用內(nèi)切酶酶切延伸進行測序的，如圖I所示，該方法的步驟包括(I)、利用含有酶切識別位點的雙鏈寡核苷酸第一接頭與核酸片段連接，得到待測核酸片段；(2)、以識別酶切識別位點的限制性內(nèi)切酶對待測核酸片段進行酶切，得到其中一條鏈含有突出末端的雙鏈產(chǎn)物；(3)、在雙鏈產(chǎn)物上連接一組對應(yīng)特定位置含有熒光標記的雙鏈第二接頭，得到連接產(chǎn)物；通過檢測連接產(chǎn)物的熒光信號獲取該特定位置對應(yīng)的核苷酸序列信息；其中，雙鏈第二接頭含有突出末端；雙鏈第二接頭含有酶切識別位點；根據(jù)酶切識別位點與酶切位點之間的核苷酸個數(shù)，所述突出末端預(yù)先計算好一個或數(shù)個核苷酸；、分離步驟(3)中的連接產(chǎn)物，得到分離產(chǎn)物；(5)、利用能識別步驟(3)中所帶酶切識別位點的酶對分離產(chǎn)物進行酶切，得到含有酶切識別位點的一組片段；(6)、重復(fù)步驟(3)至的操作，直至測得待測核酸片段上能測的所有核苷酸序列；其中最后一次重復(fù)操作時，可以忽略步驟(5)。在上述連接測序法中，利用含有熒光標記的雙鏈寡核苷酸接頭作為檢測探針，以接頭上所帶酶切識別位點位置的變更來實現(xiàn)和控制測序位置的延伸推進。若使用該方法檢測核酸序列，會因為雙鏈寡核苷酸接頭核苷酸個數(shù)以及所使用的限制性內(nèi)切酶識別位點與酶切位點之間的核苷酸個數(shù)限制，使得所能檢測得到的核苷酸序列最多只能等于酶切識別位點與酶切位點之間的核苷酸個數(shù)，其讀長嚴重受限制，不利于核酸序列信息的檢測與分析。因此需要一種新的增加測序讀長的測序方法，能夠使得檢測核酸序列時的讀長增力口，便于核酸序列信息的檢測與分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的增加測序讀長的測序方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中利用連接測序法檢測時讀長過短而不利于核酸序列信息的檢測與分析的問題。為了實現(xiàn)發(fā)明目的，一種增加測序讀長的測序方法包括以下步驟
A.將第一錨定引物結(jié)合于待測核酸片段上的第一接頭上；B.在第一錨定引物延伸末端分別連接帶不同位置標記的熒光探針，并檢測相應(yīng)連接產(chǎn)物的熒光信號，得到第一錨定引物延伸末端后M個核苷酸的序列信息；
C.利用內(nèi)切酶將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到含有待測序片段的酶切產(chǎn)物；
D.酶切產(chǎn)物連接第二接頭得到新待測核酸片段，將第二錨定引物結(jié)合于新待測核酸片段的第二接頭上；
E.在第二錨定引物延伸末端分別連接帶不同位置標記的熒光探針，并檢測相應(yīng)連接產(chǎn)物的熒光信號，得到第二錨定引物延伸末端后N個核苷酸的序列信息；
F.更換內(nèi)切酶、接頭、錨定引物和熒光探針，對前一步驟的產(chǎn)物進行酶切、接頭連接、錨定引物結(jié)合、熒光探針連接和熒光信號檢測；
G.重復(fù)步驟F，直至得到待測核酸片段中所需的核苷酸序列信息；
其中，M、N均為正整數(shù)；所述待測核酸片段含有營養(yǎng)指導(dǎo)基因序列、常規(guī)藥物相關(guān)基因序列或易感基因序列。其中，步驟A中所述待測核酸片段固定于固相載體表面。其中，在步驟A之前還可以包括步驟
A0.利用固相載體對源核酸進行擴增，得到固定于固相載體表面的待測核酸片段。進一步的，所述步驟AO包括以下步驟
A01.將用于擴增的源核酸固定于固相載體表面，得到表面含有至少一個核酸片段的固相載體；
A02.將引物結(jié)合于固相載體表面上的引物結(jié)合位點，得到固定有引物的擴增載體； A03.對擴增載體上的源核酸進行擴增，得到固定于固相載體表面的待測核酸片段。其中，步驟A02中所述引物包括用于對所述源核酸進行擴增的上游引物和/或下游引物，所述上游引物是與源核酸5’端互補結(jié)合的核酸序列，所述下游引物是與源核酸3’端序列相同的核酸序列。其中，步驟A03中所述的擴增是單分子擴增。其中，所述步驟A02中引物結(jié)合于固相載體表面的方式為引物與固相載體表面攜帶的基團進行配對連接，實現(xiàn)直接結(jié)合；或通過連接子攜帶的基團分別與引物和固相載體表面攜帶的基團進行配對連接，實現(xiàn)間接結(jié)合。進一步的，所述配對連接的方式采用生物素-親和素/鏈霉親和素、納米金/碘乙酰-巰基、氨基-醛基/羧基/異硫氰基、丙烯酰胺-硅烷基/聚丙烯酰胺中的至少一種。其中，步驟A中所述第一錨定引物含有至少一個酶切識別位點。其中，所述步驟C可以包括以下步驟
Cl.將步驟B中連接的熒光探針與第一錨定引物洗脫，重置第一錨定引物并進行鏈延伸，與待測核酸片段形成雙鏈核酸分子；
C2.內(nèi)切酶通過識別第一錨定引物上所帶的酶切識別位點并進行酶切，將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到含有待測序片段的酶切產(chǎn)物。其中，步驟C可以包括以下步驟
Cl’.在第一錨定引物的另一端連接雙鏈的接頭三，該接頭三含有至少一個酶切識別位占.C2’.利用內(nèi)切酶識別接頭三所帶的酶切識別位點，將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到含有待測序片段的酶切產(chǎn)物。上述任一方案中，所述第一錨定引物含有至少一個特異性殘基和/或一端是封閉的。其中，所述步驟B包括以下步驟
BI.在含有特異性殘基的第一錨定引物延伸末端連接帶特定位置標記的熒光探針，檢測相應(yīng)連接產(chǎn)物的熒光信號，得到對應(yīng)位置的核苷酸序列信息 ；
B2.以特異性切割劑切割特異性殘基，將前一步驟中連接的熒光探針及第一錨定引物洗脫，重置第一錨定引物；
B3.在第一錨定引物延伸末端重復(fù)帶特定位置標記的熒光探針的連接和相應(yīng)熒光信號檢測的操作，得到第一錨定引物延伸末端后M個核苷酸的序列信息。其中，所述營養(yǎng)指導(dǎo)基因包括抗自由基清除基因、嗜酒基因、抗吸煙損傷基因、解毒能力基因、DNA修復(fù)基因、葉酸及維生素B吸收能力基因、維生素D吸收能力基因、膽固醇代謝能力基因、低密度脂蛋白代謝能力基因、鈣及磷吸收能力基因、黑色素沉積與代謝基因和牛奶消化與吸收基因中的至少一個。其中，所述常規(guī)藥物相關(guān)基因包括CYP1A2、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、ABCB1、ADRB1、ADRB2、CACNA1C、NPPA, OPRMl 和 VKORCl 的至少一個。其中，所述易感基因包括腫瘤易感基因、心血管易感基因、代謝系統(tǒng)易感基因和免疫系統(tǒng)易感基因中的至少一個。進一步的，所述腫瘤易感基因包括乳腺癌易感基因、肺癌易感基因、結(jié)直腸癌易感基因、鼻咽癌易感基因、胃癌易感基因、肝癌易感基因、胰腺癌易感基因、皮膚癌易感基因、卵巢癌易感基因、如列腺癌易感基因和白血病易感基因中的至少一種；所述心血管易感基因包括動脈粥樣硬化易感基因、冠狀動脈性心臟病易感基因、原發(fā)性高血壓易感基因、帕金森綜合癥易感基因和老年性癡呆癥易感基因中的至少一種；所述代謝系統(tǒng)易感基因包括I型糖尿病易感基因、II型糖尿病易感基因、脂肪肝易感基因和低血糖癥易感基因中的至少一種；免疫系統(tǒng)易感基因包括骨質(zhì)疏松癥易感基因、貧血易感基因、全身炎癥反應(yīng)綜合癥易感基因和銀屑病易感基因中的至少一種。由上可知，本發(fā)明的增加測序讀長的測序方法，利用內(nèi)切酶將待測核酸片段上已經(jīng)得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，然后再連接新的接頭，錨定新的錨定引物并進行熒光探針的連接和熒光信號的檢測，向前延伸讀取核苷酸序列，從而增加了測序讀長。


圖I是現(xiàn)有技術(shù)中一種利用內(nèi)切酶酶切延伸測序的連接測序法示意圖。圖2是本發(fā)明一個實施例中增加測序讀長的測序方法流程圖。圖3是本發(fā)明一個實施例中利用固相載體擴增得到待測核酸片段的方法流程圖。圖4是本發(fā)明一個實施例中所用第一 anchor的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5是本發(fā)明一個實施例中利用圖4所不的第一 anchor得到其延伸末端后M個核苷酸的序列信息的方法流程圖。圖6是本發(fā)明一個具體實施方式
中第一 anchor的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖7是本發(fā)明一個具體實施方式
中利用圖6所示的第一 anchor得到其延伸末端后M個核苷酸的序列信息的方法流程圖。圖8是本發(fā)明另一個具體實施方式
中第一 anchor的結(jié)構(gòu)示意圖。圖9是本發(fā)明一個具體實施方式
中利用圖8所不的第一 anchor得到其延伸末端后M位核苷酸序列信息的方法流程圖。圖10是本發(fā)明一個實施例中得到含有待測序片段的酶切產(chǎn)物的方法流程圖。
圖11是本發(fā)明另一個實施例中得到含有待測序片段的酶切產(chǎn)物的方法流程圖。圖12是本發(fā)明一個實施例中得到第二 anchor延伸末端后N個核苷酸的序列信息的方法流程圖。圖13是本發(fā)明另一個實施例中得到第二 anchor延伸末端后N個核苷酸的序列信息的方法示意圖。圖14是本發(fā)明一個實施例中利用酶切延伸測序增加測序讀長的測序方法示意圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。本發(fā)明提供了一種增加測序讀長的測序方法，包括以下步驟首先利用第一錨定引物(第一 anchor)與待測核酸片段上的第一接頭錨定結(jié)合，利用不同位置標記的熒光探針與第一 anchor的延伸末端相連接，并檢測相應(yīng)連接產(chǎn)物的熒光信號，根據(jù)熒光信號讀取常規(guī)藥物相關(guān)基因待測核酸片段中第一anchor延伸末端后M個核苷酸的序列信息；利用內(nèi)切酶進行酶切，將之前已經(jīng)讀取過的核苷酸序列部分或完全切除，保留含有待測序核苷酸序列的待測序核酸片段，并使其與新的接頭連接，進而錨定新的錨定引物(anchor)，然后通過新的anchor的延伸末端連接帶不同位置標記的突光探針,讀取新的anchor的延伸末端后N個核苷酸的序列信息；通過上述步驟完成一個檢測循環(huán)，然后重復(fù)之前所述的內(nèi)切酶酶切切除、接頭更換連接、新的anchor錨定、新熒光探針的連接和熒光信號檢測的步驟，循環(huán)讀取，從而獲得待測核酸片段上的核苷酸序列信息。利用本發(fā)明所記載的增加測序讀長的測序方法,可以增加測序的讀長。需要說明的是，本發(fā)明的增加測序讀長的測序方法可用于檢測營養(yǎng)指導(dǎo)基因序列、常規(guī)藥物相關(guān)基因型序列和易感基因序列。所述營養(yǎng)指導(dǎo)基因是指在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達過程中發(fā)生突變后對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝產(chǎn)生影響的基因，其中營養(yǎng)物質(zhì)的代謝過程包括消化、轉(zhuǎn)運、吸收和排泄。營養(yǎng)指導(dǎo)基因能夠用以指導(dǎo)建立個性化營養(yǎng)食譜，調(diào)節(jié)營養(yǎng)吸收。對營養(yǎng)指導(dǎo)基因進行檢測，可以了解個體的遺傳獨特性，并通過調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)，制定個性化的營養(yǎng)食譜，有利于個體化的營養(yǎng)補充和均衡，實現(xiàn)個體化營養(yǎng)的合理吸收。藥物反應(yīng)的個體差異是臨床上極其普遍的現(xiàn)象，產(chǎn)生這種差異的原因有許多，主要分為非遺傳性因素和遺傳性因素，兩者結(jié)合可以導(dǎo)致不同病人對同一種藥物的反應(yīng)出現(xiàn)量與質(zhì)的差別。非遺傳性因素包括性別、年齡、體重、疾病狀況在內(nèi)的多種因素；遺傳因素，也即常規(guī)藥物的代謝、釋放、信號傳導(dǎo)和受體的基因多態(tài)性導(dǎo)致其編碼蛋白的功能改變。
所述常規(guī)藥物相關(guān)基因是指與常規(guī)藥物在生物體內(nèi)代謝、釋放、信號傳導(dǎo)和受體蛋白編碼相關(guān)的基因或等位基因。對常規(guī)藥物相關(guān)基因進行檢測，可以得到具體的常規(guī)藥物相關(guān)基因的核酸序列信息。所得核酸序列信息，即遺傳性因素，與非遺傳性因素相結(jié)合，可以得出藥物在不同個體之間藥效的差異，實現(xiàn)個性化用藥。非遺傳因素的確定方法包括但不限于進一步的分子生物學(xué)試驗、臨床試驗、臨床觀察及綜合分析等。所以利用本發(fā)明的方法對常規(guī)藥物相關(guān)基因進行檢測，得到的僅是常規(guī)藥物相關(guān)基因的核酸序列信息，而并不能用以判斷藥物的療效。所述易感基因是指和人體特定表征具有一定關(guān)聯(lián)，能 揭示人體遺傳體質(zhì)對健康利弊以及疾病易感性狀況的基因或等位基因。對復(fù)雜疾病的易感基因進行檢測，可得到具體的核酸序列信息。在此基礎(chǔ)上，可以結(jié)合后續(xù)進一步的分子生物學(xué)試驗、臨床試驗、臨床觀察及綜合數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，建立疾病模型，從而實現(xiàn)早期評估疾病的易感性并采取相應(yīng)預(yù)防措施降低疾病的發(fā)生幾率。利用本發(fā)明的方法對易感基因進行檢測得到的檢測結(jié)果只是易感基因的核酸序列信息，并不用以直接判斷患病與否。本發(fā)明在對營養(yǎng)指導(dǎo)基因、常規(guī)藥物相關(guān)基因或易感基因進行檢測時，其初始樣本是針對已經(jīng)脫離人體或動物體的組織、體液或排泄物的樣品進行處理或檢測。這些樣品包括但不限于血液、口腔上皮刮取樣、唾液、尿液、石蠟包埋組織和穿刺組織。其中，本發(fā)明所述錨定引物即為anchor，是指與待測核酸片段上的接頭進行錨定結(jié)合的單鏈寡核苷酸；所述anchor的延伸末端,是指能夠用于繼續(xù)連接并進行核苷酸鏈延伸的anchor末端，可以是anchor的5 ’端，也可以是anchor的3 ’端。本發(fā)明中所述熒光探針分為不同組別類型，同組類型中不同熒光標記對應(yīng)同一特定位置的不同核苷酸序列，而不同組類型的熒光探針熒光標記對應(yīng)的特定位置不同。每次連接反應(yīng)中，加入同一組類型的熒光探針，根據(jù)所采集的熒光信號，可以讀取該組熒光探針標記特定位置對應(yīng)的核苷酸序列信息。本發(fā)明中所述熒光探針的熒光標記種類不限，包括但不限于一種、兩種、四種，或更多。當熒光標記只有一種時，為了區(qū)分同一位置上的不同堿基，對同一位置上的堿基，需在錨定引物的延伸末端重復(fù)進行4次連接反應(yīng)和熒光信號檢測，每次連接反應(yīng)中，熒光探針是對應(yīng)某一特定位置上的某一種堿基(A、G、C或T)而含有熒光標記的探針。為了實現(xiàn)對X個位置的堿基的檢測，則需要重復(fù)進行4XX次連接反應(yīng)和熒光探針的檢測。當熒光標記有兩種時，為了區(qū)分同一位置上的不同堿基，對同一位置上的堿基，需在錨定引物的延伸末端重復(fù)進行2次連接反應(yīng)和熒光信號檢測，每次連接反應(yīng)中，熒光探針是對應(yīng)某一特定位置上的某兩種堿基(A、G、C或T)而含有熒光標記的探針。為了實現(xiàn)對X個位置的堿基的檢測，則需要重復(fù)進行2Xx次連接反應(yīng)和熒光探針的檢測。當熒光標記有四種時，為了區(qū)分同一位置上的不同堿基，對同一位置上的堿基，需在錨定引物的延伸末端進行I次連接反應(yīng)和熒光信號檢測，每次連接反應(yīng)中，熒光探針是對應(yīng)某一特定位置上的某四種堿基(A、G、C或T)而含有熒光標記的探針。為了實現(xiàn)對X個位置的堿基的檢測，則需要重復(fù)進行X次連接反應(yīng)和熒光探針的檢測。當熒光標記的種類更多時，可參考上述方案進行序列檢測。優(yōu)選的，熒光標記的種類可被4整除或能把4整除，以簡化熒光探針的設(shè)計及后續(xù)的檢測實驗。
此外，本發(fā)明中，在anchor的延伸末端連接熒光探針時，主要有兩種實現(xiàn)形式，它們之間的區(qū)別主要在于每次連接熒光探針之前，是否重新錨定anchor :若不重新錨定anchor，則在完成每次熒光探針的連接和相應(yīng)的熒光信號檢測之后，將連接產(chǎn)物上的熒光探針切除，保留anchor,然后連接新的熒光探針,再進行熒光信號檢測；若重新錨定anchor，則在完成每次熒光探針的連接和相應(yīng)的熒光信號檢測之后，將整個連接產(chǎn)物(熒光探針和anchor的連接物)去除,然后重新錨定anchor,連接新的突光探針,并進一步采集連接產(chǎn)物的熒光信號。圖2示出了本發(fā)明一個實施例中增加測序讀長的測序方法流程，該方法包括以下步驟
51.將第一anchor結(jié)合于待測核酸片段上的第一接頭上；
52.在第一anchor延伸末端分別連接帶不同位置標記的突光探針,并檢測相應(yīng)連接產(chǎn)物的突光信號，得到第一 anchor延伸末端后M個核苷酸的序列信息；
53.利用內(nèi)切酶將步驟S2中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到含有待測序片段的酶切產(chǎn)物；
54.酶切產(chǎn)物連接第二接頭得到新待測核酸片段，將第二anchor結(jié)合于新待測核酸片段的第二接頭上；
55.在第二anchor延伸末端分別連接帶不同位置標記的突光探針,并檢測相應(yīng)連接產(chǎn)物的突光信號，得到第二 anchor延伸末端后N個核苷酸的序列信息；
56.更換內(nèi)切酶、接頭、anchor和熒光探針，對前一步驟的產(chǎn)物進行酶切、接頭連接、anchor結(jié)合、突光探針連接和突光信號檢測；
57.重復(fù)步驟S6，直至得到待測核酸片段中所需的核苷酸序列信息；
其中，M、N均為正整數(shù)；所述待測核酸片段含有營養(yǎng)指導(dǎo)基因序列、常規(guī)藥物相關(guān)基因序列或易感基因序列。本發(fā)明所記載的增加測序讀長的測序方法，其優(yōu)勢在于，在進行測序反應(yīng)檢測核酸序列時，利用內(nèi)切酶將待測核酸片段上已經(jīng)讀取過序列信息的核苷酸部分或完全切除，然后再在含有待測序核酸序列的核酸片段上連接新的接頭，錨定新的anchor并進行新熒光探針的連接和相應(yīng)熒光信號的檢測，實現(xiàn)向前延伸讀取更多的核苷酸序列，從而增加了運用連接測序法檢測核酸序列的測序讀長。針對本發(fā)明所記載的技術(shù)方案，需要說明的是，步驟SI中所述第一 anchor是根據(jù)堿基互補配對原則，與待測核酸片段上的第一接頭進行錨定結(jié)合的錨定引物，是單鏈寡核苷酸，用于在步驟S2中連接熒光探針。除此之外，第一 anchor還可以根據(jù)具體需要，進行不同的設(shè)計。在本發(fā)明的一個實施方案中，第一 anchor與待測核酸片段一端的第一接頭通過堿基互補配對進行錨定結(jié)合。該方案中，第一 anchor可以不進行封閉處理，以降低第一anchor的合成成本；也可以在第一 anchor的一端進行封閉處理,避免第一 anchor相互之間發(fā)生自連，保證第一 anchor與熒光探針的定向連接。將第一 anchor的一端進行封閉,可以是第一 anchor的3’端,也可以是5’端,經(jīng)過封閉處理既可以控制連接的方向，又可以避免第一 anchor之間相互連接。在本步驟的一個具體實施方式
中，將第一 anchor的3’端進行封閉，封閉的方法包括但不限于雙脫氧、氨基化反應(yīng)、酰胺化，第一 anchor被封閉的3’端無法繼續(xù)連接，即第一 anchor的連接只能發(fā)生在5’端；而在本步驟的另一個具體實施方式
中，將第一 anchor的5’端進行封閉，封閉的方法包括但不限于去磷酸化或酰胺化，即第一 anchor的連接只能發(fā)生在3’端。在本發(fā)明的另一個實施方案中,第一 anchor含有至少一個特異性殘基,所述特異性殘基是指其本身或其所帶的化學(xué)鍵能被特異性切割的殘基，它能使其所在的核苷酸片段由于被切割而更易于洗脫。用于切割特異性殘基的物質(zhì)稱為特異性切割劑。所述特異性殘基包括但不限于脫氧尿卩密唳核苷酸(deoxy-Uracil, dU)、脫氧肌苷(deoxy Inosine, dl)、含有硫代磷酸酯鍵的核苷酸和切口酶的酶切識別位點。其相應(yīng)的特異性切割劑包括但不限于尿嘧啶-DNA糖基化酶(Uracil-DNA Glycocasylase，UDG酶)、大腸桿菌核酸內(nèi)切酶V、含有Ag、Hg、Cu、Mn、Zn或Cd離子的化合物和切口酶。所述切口酶，是指能識別雙鏈核酸分子中一條核苷酸鏈所攜帶的酶切識別位點，而在含有該酶切識別位點的核苷酸 鏈上進行酶切形成切口的II型限制酶；本發(fā)明所述切口酶,包括但不限于Nt. Alw I內(nèi)切酶、Nt. BsmA I內(nèi)切酶、Nt. BspQ I內(nèi)切酶、Nt. BstNB I內(nèi)切酶。本實施方案的第一 anchor設(shè)計方式可以使得在后續(xù)的洗脫更換過程中更加便利。在本發(fā)明的另一個實施方案中,第一 anchor含有至少一個酶切識別位點，該酶切識別位點可被直接利用于部分或完全切除步驟S2中所讀取過的核苷酸序列，使得整個發(fā)明技術(shù)方案步驟簡化，操作簡便。步驟SI中述第一接頭為待測核酸片段一端上的一段已知序列，位于待測核酸片段的3’端或5’端，用于使第一 anchor錨定結(jié)合到待測核酸片段上。該第一接頭可以是得到待測序的樣品之后進行測序文庫構(gòu)建過程中自行設(shè)計合成連接上去的，也可以是得到的待測序樣品本身已經(jīng)含有的。所述營養(yǎng)指導(dǎo)基因，是指在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達過程中發(fā)生突變后對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝產(chǎn)生影響的基因，營養(yǎng)指導(dǎo)基因能夠用以指導(dǎo)建立個性化營養(yǎng)食譜，調(diào)節(jié)營養(yǎng)吸收。所述營養(yǎng)指導(dǎo)基因包括但不限于抗自由基清除基因、嗜酒基因、抗吸煙損傷基因、解毒能力基因、DNA修復(fù)基因、葉酸及維生素B吸收能力基因、維生素D吸收能力基因、膽固醇代謝能力基因、低密度脂蛋白代謝能力基因、鈣及磷吸收能力基因、黑色素沉積與代謝基因和牛奶消化與吸收基因。其中，所述抗自由基清除基因包括但不限于CAT、CYBA、N0S3、S0D3和PONl ;所述嗜酒基因包括但不限于ADH2、ADH3、ALDH2和CYP2E1 ;所述抗吸煙損傷基因及解毒能力基因包括但不限于CYPlAl ;所述DNA修復(fù)基因包括但不限于PARPUXRCC1和ERCC2 ;所述葉酸及維生素B吸收能力基因包括但不限于MTHFR、MTR和MTRR ;所述維生素D吸收能力基因包括但不限于VDR;所述膽固醇代謝能力基因及低密度脂蛋白代謝能力基因包括但不限于ABCB1、LPL、APOE和APOB ;所述鈣及磷吸收能力基因包括但不限于VDR ;所述黑色素沉積與代謝基因包括但不限于MC1R、0CA2和TYRPl ;所述牛奶消化與吸收基因包括但不限于LCT和MCM6。其中，所述營養(yǎng)指導(dǎo)基因包括但不限于ABCBI、ADH2、ADH3、ALDH2、APOB、APOE、CAT、CYBA, CYPlAl、CYP2EI、ERCC2、LCT、LPL、MC1R、MCM6、MTHFR、MTR、MTRR、N0S3、0CA2、PARPl、P0N1、S0D3、TYRP1、VDR和 XRCCl。其中，所述易感基因包括但不限于腫瘤易感基因、心血管易感基因、代謝系統(tǒng)易感基因和免疫系統(tǒng)易感基因。
所述腫瘤易感基因包括但不限于乳腺癌易感基因、肺癌易感基因、結(jié)直腸癌易感基因、鼻咽癌易感基因、胃癌易感基因、肝癌易感基因、胰腺癌易感基因、皮膚癌易感基因、卵巢癌易感基因、前列腺癌易感基因和白血病易感基因。所述乳腺癌易感基因包括但不限于FGFR2、GSTP1、IL-I ^、MTHFR和GSTMl ;所述肺癌易感基因包括但不限于 APEI、CASP7、CASP8、CASP9、CHEK2、C0X-2、CYPIAI、CYP2EI、ERCCI、ERCC2、ERCC6、ExoI、GSTPI、HmlhI、IL-1P、MDM2、MTHFR、OGGl、P73、TERT、TGFBI、TP53、TP63和 XRCCl。所述結(jié)直腸癌易感基因包括但不限于MMP2、SMAD7、ADH2、ALDH2、CYP1A2、MMP-I、MTHFR、TP53、VEGF, C0X-2、DNMT3B、hMLHl、L0C727677、MMP9、MTRR 和 TGF- 3 I。
所述鼻咽癌易感基因包括但不限于IL-2、MDM2、HLA-A、HLA-B/C、HLA-F、MDSl-EVI I、CDNK2A/2B、TNFRSF19、HCG9、GABBRl 和 ITGA9。所述胃癌易感基因包括但不限于￡6 40)112、]\0'冊1 453、11-8、11-10、？504、了即八、PLCEU CYPlAU XRCCI、CYP2EI、TGFBI、CDHl、MDM2 和 VEGF。所述肝癌易感基因包括但不限于IL1-B、TNF-a、EGF、TGF-^ I、DEPDC5、MICA和KIFlB0所述胰腺癌易感基因包括但不限于MTHFR、C0X-2、FasL, CASP8、THSD7B、ARL4C、LTF、FOXQl、PARK2、FAM91A1、RNF5P1、RNF43、BICDl、NDFIP2、PRPSAP2、MYOlD 和 L0C。所述心血管易感基因包括但不限于動脈粥樣硬化易感基因、冠狀動脈性心臟病易感基因、原發(fā)性高血壓易感基因、帕金森綜合癥易感基因和老年性癡呆癥易感基因。所述動脈粥樣硬化易感基因包括但不限于AL0X5AP、ApoE, LDLR、HUMARA, DCC和Rb。所述冠狀動脈性心臟病易感基因包括但不限于MEF2A、roGF、FGF、EGF、VEGF、C0X-l和 T-PA。所述原發(fā)性高血壓易感基因包括但不限于AGT、ACE、AT1R、CYP11B2、G-P 3、eN0S、RnBO、LDLR和 LL。所述帕金森綜合癥易感基因包括但不限于SNCA、LRRK2、PINK1、UCH-L1和Parkin。所述老年性癡呆癥易感基因包括但不限于APP、PS-U PS-2、ApoE, ACE、CH25H、CST3、CHRNB2 和 SORLl。所述代謝系統(tǒng)易感基因包括但不限于I型糖尿病易感基因、II型糖尿病易感基因、脂肪肝易感基因和低血糖癥易感基因。所述免疫系統(tǒng)易感基因包括但不限于骨質(zhì)疏松癥易感基因、貧血易感基因、全身炎癥反應(yīng)綜合癥易感基因和銀屑病易感基因。所述常規(guī)藥物相關(guān)基因，是指與常規(guī)藥物在生物體內(nèi)代謝、釋放、信號傳導(dǎo)和受體蛋白編碼相關(guān)的基因或等位基因。其中，所述常規(guī)藥物包括但不限于呼吸系統(tǒng)相關(guān)病變藥物中的鎮(zhèn)咳藥可待因和右美沙芬，平喘藥茶堿；抗病原微生物藥物中的抗感染藥伏立康唑、伊曲康唑、氨苯砜、甲硝唑、新諾明和利福平，抗HIV病毒藥奈非那韋，抗瘧疾藥硫酸奎寧和氯胍；內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)病變藥物中的治療糖尿病藥格列本脲、格列吡嗪、格列美脲和那格列奈，激素類藥物黃體酮和地塞米松，抗雄性激素藥氟他胺；神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的鎮(zhèn)痛藥美沙酮、芬太尼、嗎啡和鹽酸曲馬多，中樞骨骼肌松弛藥替扎尼定，解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥雙氯芬酸、替諾西康、布洛芬(依布洛芬)、萘普生、吡羅昔康(吡氧噻嗪)、氟比洛芬、吲哚美辛、氯諾昔康、賽來昔布、阿司匹林和對乙酰氨基酚，抗抑郁藥去甲替林、丙咪嗪(依米帕明)、氯丙咪嗪、鹽酸氟西汀、舍曲林、帕羅西汀、文法拉辛、托莫西汀、西酞普蘭、嗎氯貝胺、氯巴占、曲米帕明、依替唑侖、曲唑酮、氟伏沙明和度洛西汀，抗神經(jīng)病藥奮乃靜、氟哌啶醇、利培酮、阿立哌唑、氯丙嗪和氯氮平，抗癲癇藥苯妥英、安定(地西泮)、苯巴比妥、丙戊酸鈉和卡馬西平，治偏頭痛藥佐米曲普坦，抗痛風(fēng)藥秋水仙堿；消化系統(tǒng)相關(guān)病變藥物中的胃腸不適藥，止吐藥屈大麻酚、西沙必利和昂丹司瓊，抗消化性潰瘍藥奧美拉唑、蘭索拉唑和半托拉唑；循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)病變藥物中的@受體阻斷藥丁呋洛爾、美托洛爾和比索洛爾，抗高血壓藥卡維地洛、異喹胍、氯沙坦、纈沙坦和厄貝沙坦，抗心律失常藥奎尼丁、恩卡尼、司巴丁、氟卡尼、普羅帕酮、安博律定、美西律和利多卡因，抗心絞痛藥派克昔林 (心舒寧)，抗凝血藥華法林，血脂調(diào)節(jié)藥辛伐他汀、洛伐他汀和氟伐他汀，鈣拮抗藥非洛地平、硝苯地平、尼群地平、氨氯地平、尼莫地平、維拉帕米和地爾硫卓，抗血小板藥氯吡格雷，以及免疫抑制藥環(huán)孢素。所述常規(guī)藥物相關(guān)基因包括但不限于CYP1A2、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、ABCB1、ADRB1、ADRB2、CACNA1C、NPPA、OPRMl 和 VKORCl。其中，呼吸系統(tǒng)相關(guān)病變藥物相關(guān)基因包括但不限于CYP1A2、CYP2D6?？共≡⑸锼幬锵嚓P(guān)基因包括但不限于CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9和CYP3A5。內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)病變藥物相關(guān)基因包括但不限于CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4和CYP1A2。神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物相關(guān)基因包括但不限于 CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19、ABCB1 和 OPRMl。消化系統(tǒng)相關(guān)病變藥物相關(guān)基因包括但不限于CYP2C9、CYP3A4、CYP2D6、CYP1A2和CYP2C19。循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)病變藥物相關(guān)基因包括但不限于CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP1A2、CYP3A4、CYP3A5、ABCBl、VKORCl、CACNA1C、ADRBl、ADRB2 和 NPPA。步驟SI中所述的待測核酸片段，可以是DNA、RNA或cDNA中的任一種，且至少其兩端含有接頭，為使測序時操作便利，優(yōu)選將其中一端接頭與固相載體連接，所述用于連接的固相載體可以是不同材質(zhì)和不同形狀的剛性物質(zhì)，其材質(zhì)包括但不限于玻璃、娃、陶瓷、塑料和金屬；其形狀包括但不限于板層形、平板形、圓片形和球形；對于固相載體，本發(fā)明優(yōu)選磁珠以及玻片。所述含有接頭的待測核酸片段，其來源可以是得到的已經(jīng)連接好接頭的待測核酸片段，可直接用于測序；也可以是通過對構(gòu)建測序文庫得到。若通過構(gòu)建測序文庫得到待測核酸片段，則在步驟SI之前需要進行測序文庫構(gòu)建的操作，本發(fā)明優(yōu)選采用以下步驟進行so.利用固相載體對源核酸進行擴增，得到固定于固相載體表面的待測核酸片段。所述步驟SO中的操作如圖3所示，具體包括以下步驟
501.將用于擴增的源核酸固定于固相載體表面，得到表面含有至少一個核酸片段的固相載體；
502.將引物結(jié)合于固相載體表面上的引物結(jié)合位點，得到固定有引物的擴增載體；
503.對擴增載體上的源核酸進行擴增，得到固定于固相載體表面的待測核酸片段。運用本技術(shù)方案進行測序文庫構(gòu)建，將用于擴增的源核酸和用于擴增核酸片段的引物同時結(jié)合于固相載體表面，能夠?qū)U增產(chǎn)物固定于固相載體表面，提高固相載體在擴增時的利用率，提高固相載體表面的擴增產(chǎn)物結(jié)合量；利用該方法擴增得到的擴增產(chǎn)物進行測序，因為固相載體表面的擴增產(chǎn)物結(jié)合量的提高，能進一步的增強測序的檢測信號，降低對檢測儀器的要求。針對本技術(shù)方案，需要說明的是，所述源核酸為單鏈核酸分子，可以是DNA、RNA或cDNA，可以是直接從生物體、組織或細胞中提取獲得的核酸分子，也可以是對直接從生物體、組織或細胞中提取獲得的核酸分子進行PCR擴增后的產(chǎn)物。其中，本技術(shù)方案所述固相載體，可以是由不同材質(zhì)構(gòu)成的，其材質(zhì)可以采用玻璃、硅膠、陶瓷、塑料和金屬中的任意一種，而固相載體的表面無特殊要求，優(yōu)選含有平滑表面的固相載體，固相載體的具體類型可以是現(xiàn)有技術(shù)中常用的固 相載體，包括但不限于塑料珠、玻璃珠、玻片、磁珠和納米金顆粒。本發(fā)明中優(yōu)選采用磁珠作為固相載體，以使得擴增反應(yīng)結(jié)束后擴增產(chǎn)物的分離純化更加方便。上述只是本發(fā)明對于固相載體的一些具體實施例，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，直接在擴增之前對所要擴增的源核酸進行片段化，然后利用接頭與片段化得到的核酸片段兩端連接，且固相載體表面進行相應(yīng)的修飾處理，再將接完接頭之后的核酸片段固定于固相載體表面。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，用于擴增的源核酸最初位于臨床待測血液樣品中。首先對固相載體表面進行鏈霉親和素修飾，然后連接經(jīng)過生物素修飾的捕獲探針，得到含有捕獲探針的固相載體。將含有捕獲探針的固相載體直接與臨床待測血液樣品混合，從中進行源核酸的捕獲。捕獲結(jié)束后，利用離心分離，即可得到表面固定有源核酸的固相載體。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，用于擴增的源核酸位于臨床疾病患者的唾液中。為得到用于擴增的源核酸，首先利用相應(yīng)的引物進行一般的PCR，將從患者的唾液中得到的源核酸進行放大，然后以凝膠電泳進行分離回收，回收產(chǎn)物再與生物素化接頭連接，而固相載體采用鏈霉親和素修飾的磁珠，兩者混合結(jié)合，即可得到表面固定有至少一個核酸片段的磁珠。上述僅是本發(fā)明中固相載體表面固定的源核酸來源的一些具體實施例，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。步驟S02中所述的引物，是用于對固相載體表面固定的源核酸進行擴增的核酸序列，包括上游引物和下游引物中的至少一種。所述上游引物，是與源核酸的5’端互補結(jié)合的核酸序列；所述下游引物，是與源核酸的3’端序列相同的核酸序列。在本發(fā)明的一個具體實施例中，將上游弓I物或下游引物結(jié)合于固相載體表面的弓I物結(jié)合位點，與上游引物和下游引物同時固定于固相載體表面的方案相比，可以在實現(xiàn)發(fā)明目的的同時減少試劑的種類；在本發(fā)明的另一個具體實施例中，將上游引物、下游引物按照一定的比例同時結(jié)合于固相載體表面的引物結(jié)合位點，可以在實現(xiàn)發(fā)明目的的同時加快擴增的速度。其中上游引物與下游引物的混合比例根據(jù)需要可變，優(yōu)選為1:2至2:1的比例之間，更優(yōu)選為I: I。上述對于上游引物與下游引物之間的混合比例只是本發(fā)明所用的一些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。步驟S02所述引物結(jié)合位點，是指固相載體表面用與引物相結(jié)合的位點。步驟S02所述的擴增載體，是指表面固定有至少一個核酸片段，且同時還結(jié)合有引物的固相載體，此時核酸片段和引物同時固定于固相載體表面，能夠直接應(yīng)用于擴增。
本發(fā)明中所述引物結(jié)合于固相載體表面時，不排除引物同時也與核酸片段互補結(jié)合，這并不影響本發(fā)明的發(fā)明目的的實現(xiàn)。步驟S02中所述引物結(jié)合于固相載體表面可以采用多種方式實現(xiàn)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，引物通過與固相載體表面攜帶的基團進行配對連接，實現(xiàn)直接結(jié)合，可以簡化操作。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，引物通過與連接子攜帶的其中一個基團連接，再通過連接子攜帶的另一個基團與固相載體表面攜帶的基團進行配對連接，從而實現(xiàn)引物與固相載體的間接連接；在本實施方案的另一個具體實施例中，連接子是類似于樹脂結(jié)構(gòu)的存在，使用該連接子除了可以實現(xiàn)引物與固相載體的間接連接之外，還可以進一步提高固相載體表面結(jié)合的引物數(shù)量。 其中，所述連接子用于連接引物與固相載體。所述連接子可以采用多種化合物，包括但不限于烷烴、單鏈核苷酸分子或包含多聚物部分的化合物。上述配對連接的方式多種多樣，可以采用生物素-親和素/鏈霉親和素、納米金/碘乙酰-巰基、氨基-醛基/羧基/異硫氰基、丙烯酰胺-硅烷基/聚丙烯酰胺中的任意一種。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，引物含有生物素標記，而固相載體本身已經(jīng)經(jīng)過鏈霉親和素修飾，因此兩者直接通過生物素與鏈霉親和素之間的配對連接，實現(xiàn)直接連接。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，固相載體表面含有氨基修飾，而引物經(jīng)過羧基修飾，兩者通過氨基-羧基進行配對連接，實現(xiàn)直接連接。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，采用多聚化合物如樹脂作為連接子，通過氨基分別與引物所帶的羧基及固相載體表面攜帶的醛基進行配對連接，實現(xiàn)引物與固相載體表面的間接結(jié)合。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，以烷烴分子作為連接子，其上含有氨基以及羧基，因此可以與羧基化的引物以及表面氨基化的固相載體進行配對連接，實現(xiàn)引物與固相載體表面的間接結(jié)合。上述僅是本發(fā)明中引物結(jié)合于固相載體表面的一些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。步驟S02中引物與固相載體表面的結(jié)合方式，可以與步驟SOl中源核酸與固相載體表面的結(jié)合方式一致，也可以采取不一樣的結(jié)合方式。在本發(fā)明的一個實施方案中，引物以及源核酸都采用與固相載體表面直接配對連接的方式。進一步的，在采用相同結(jié)合方式時，源核酸與引物還可以采用相同或者是不同的基團配對實現(xiàn)與固相載體的直接或間接配對連接。在本實施方案的一個具體實施例中，固相載體表面含有鏈霉親和素修飾，而源核酸和引物都含有生物素修飾，源核酸和引物都通過鏈霉親和生物素的作用固定于固相載體表面；在本實施方案的另一個具體實施例中，固相載體表面含有氨基修飾，而源核酸含有羧基修飾，引物含有醛基修飾，源核酸與引物通過不同的基團配對實現(xiàn)與固相載體的直接配對連接；在本實施方案的另一個具體實施例中，固相載體表面含有氨基修飾，而源核酸含有羧基修飾，引物含有異硫氰基修飾，源核酸與引物通過不同的基團配對實現(xiàn)與固相載體的直接配對連接；在本實施方案的另一個具體實施例中，固相載體經(jīng)過不同的修飾處理后含有氨基以及鏈霉親和素，而源核酸含有羧基修飾，引物含有生物素修飾，源核酸與引物通過不同的基團配對實現(xiàn)與固相載體的直接配對連接；在本實施方案的另一個具體實施例中，固相載體表面含有樹脂包埋，而源核酸與引物分別于樹脂上所攜帶的相同或不同基團進行配對，從而都采用間接連接的方式實現(xiàn)與固相載體的連接。在本發(fā)明的另一個實施方案中，源核酸與引物采用不同的固定方式與固相載體表面結(jié)合。在本實施方案的一個具體實施例中，固相載體表面含有鏈霉親和素修飾，源核酸通過捕獲探針實現(xiàn)與固相載體的間接配對連接，而引物通過鏈霉親和生物素的作用實現(xiàn)與固相載體的直接配對連接，兩者通過不同的結(jié)合 方式與固相載體連接；在本實施方案的另一個具體實施例中，固相載體表面含有氨基修飾，源核酸利用羧基修飾實現(xiàn)與固相載體的直接配對連接，引物通過氨基與連接子上所帶的醛基配對連接，然后再通過連接子上的醛基實現(xiàn)與固相載體的間接連接，從而實現(xiàn)源核酸與引物通過不同的結(jié)合方式與固相載體連接。上述實施方案以及具體實施例僅是本發(fā)明中源核酸與引物兩者與固相載體表面結(jié)合的一些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。其中，步驟S02中的引物可以是用于擴增營養(yǎng)指導(dǎo)基因、常規(guī)藥物相關(guān)基因或易感基因的特異性擴增引物。步驟S03中，利用擴增載體對源核酸進行擴增，是指利用一定的方法(如化學(xué)、酶促或其他類型的方法)使得源核酸的拷貝數(shù)增加或?qū)е略春怂岽嬖诘男盘栐黾?。本技術(shù)方案利用擴增載體進行擴增時，除加入必須的擴增試劑外，還加入少量游離態(tài)的引物用以加速擴增的啟動以及擴增的速度。加入的游離態(tài)引物量可根據(jù)固相載體上固定的引物種類和量的不同而進行相應(yīng)的調(diào)整。在本發(fā)明的一個實施方案中，固相載體表面固定的是上游引物，在一個具體實施例中，加入的游離態(tài)引物是下游引物；在另一個具體實施例中，為使擴增速度能夠加快，加入大量游離態(tài)下游引物的同時，也加入了少量上游引物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，固相載體表面固定的是下游引物，在一個具體實施例中，加入的游離態(tài)引物是上游引物；在另一個具體實施例中，為使擴增速度能夠加快，加入大量游離態(tài)上游引物的同時，也加入了少量下游引物。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，上游引物與下游引物同時結(jié)合于固相載體表面，在一個具體實施例中，加入的游離態(tài)引物是上游引物或者是下游引物中的其中一種；在另一個具體實施例中，擴增時同時加入游離態(tài)的上游引物和下游引物，以便加快擴增的速度，且上游引物與下游引物的量以1:1為佳，以其他比例亦可。本發(fā)明可以采用多種擴增方式，包括但不限于常見的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、鏈置換擴增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增、基于核酸序列的擴增(NASBA)、Q-Beta復(fù)制和滾環(huán)擴增(RCA)，優(yōu)選乳液PCR (EPCR)、橋式PCR，其中橋式PCR又可分為水相橋式PCR和乳液橋式PCR兩種。本發(fā)明所述單分子擴增，是指對源核酸，以極微量(甚至是單個分子)的形式在空間上隔離(但這些源核酸整體上還是屬于同一個反應(yīng)體系)，在各自的空間內(nèi)實現(xiàn)對源核酸的擴增，得到擴增均一的擴增產(chǎn)物，用以提升擴增后得到的擴增產(chǎn)物的信號。其中，本發(fā)明中所述EPCR是利用乳濁液體系中各液滴形成的獨立空間，對擴增載體上的源核酸進行獨立擴增反應(yīng)，用以生成大量均一的擴增產(chǎn)物的單分子擴增技術(shù)，其大致操作步驟是將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨立的PCR反應(yīng)空間。理想狀態(tài)下，每個小水滴只含一個擴增載體，包含有足夠的其它擴增試劑(包括DNA聚合酶、dNTP等)。在EPCR反應(yīng)后，固相載體表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同來源的源核酸擴增產(chǎn)物。EPCR 具體步驟可參考文獻BEAMing: single-molecule PCR on microparticles inwater-in-oil emulsions, Frank Diehl, Meng Li, Yiping He, nature methods, Vol. 3,No. 7, July 2006。本發(fā)明中所述的橋式PCR是利用固定于固相 載體上的上游引物或下游引物與源核酸形成橋狀結(jié)構(gòu)進行擴增，從而得到大量同源、均一擴增產(chǎn)物的單分子擴增技術(shù)。所述橋式PCR的基本原理是，橋式PCR的引物被固定在固相載體上，PCR過程中PCR擴增產(chǎn)物會被固定在固相載體上，且PCR擴增產(chǎn)物能夠與固相載體上的引物互補配對，成橋狀，然后互補配對的引物以與其成橋的擴增產(chǎn)物為模板進行擴增。通過控制初始模板加入的量，橋式PCR反應(yīng)完成后，擴增產(chǎn)物在固相載體上以一簇簇的形式存在，且每一簇的擴增產(chǎn)物為同來源的DNA模板擴增產(chǎn)物。水相橋式PCR與乳液橋式PCR的主要區(qū)別在于，乳液橋式PCR是在乳液體系中隔離的獨立空間中進行橋式PCR，同時具有水相橋式PCR與EPCR的特性。關(guān)于橋式PCR的具體原理和實施方案可參考以下文獻CN20061009879. X、US6227604和Dual primeremulsion PCR for next generation DNA sequencing, Ming Yan Xu et al BenchmarksVol. 48 No. 5，2010。在本發(fā)明的一個實施方案中，利用PCR方法對源核酸進行擴增，此方法操作簡單，但缺點在于需要源核酸較多。在本發(fā)明的另一個實施方案中，利用RCA的方法對源核酸進行擴增，此實施方案的優(yōu)勢在于能夠形成單分子擴增，擴增結(jié)束后可以得到大量均一的擴增產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，利用EPCR對擴增載體表面固定的源核酸進行擴增，可以實現(xiàn)單分子擴增，以極少量甚至是單個源核酸完成擴增，而且得到大量均一的擴增產(chǎn)物。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，利用橋式PCR對擴增載體表面固定的源核酸進行擴增，同樣可以實現(xiàn)單分子擴增，以極少量甚至是單個源核酸完成擴增，得到大量均一的擴增產(chǎn)物。在本實施方案中的一個具體實施例中，利用水相橋式PCR對固相載體表面固定的源核酸進行擴增；而在本實施方案中的另一個具體實施例中，利用乳液橋式PCR實現(xiàn)對固相載體表面固定的源核酸的擴增。其中，本發(fā)明中所述的擴增產(chǎn)物，指的是經(jīng)過擴增反應(yīng)后，表面固定有大量擴增得到的核酸序列的固相載體。上述優(yōu)選實施方案中利用EPCR和橋式PCR進行單分子擴增，與只有引物或只有源核酸固定于固相載體的技術(shù)相比，可以避免由于缺少其中一種而無法進行擴增，從而可以提高固相載體用于擴增的效率，減少固相載體的使用量，降低成本。上述僅是本發(fā)明中用于擴增固相載體表面固定的源核酸的一些具體實施方式
，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。步驟S03進行擴增后，得到的擴增產(chǎn)物里包含表面結(jié)合有待測核酸片段的固相載體，以及其他未反應(yīng)完的雜質(zhì)，因此，進行后續(xù)操作前需要進行對擴增產(chǎn)物的純化回收。純化回收的目的在于將表面結(jié)合有待測核酸片段的固相載體與雜質(zhì)分離提純出來，可以使用現(xiàn)有技術(shù)中的常用方法，包括但不限于離心分離提純、柱分離純化。步驟S2中，所述第一 anchor的延伸末端,是指在第一 anchor后能夠繼續(xù)連接并進行核苷酸鏈延伸的末端。
根據(jù)步驟SI中所述第一 anchor的不同設(shè)計結(jié)構(gòu)，步驟S2可以采用不同的實現(xiàn)方式。在本發(fā)明的一個實施方案中，第一 anchor含有特異性殘基,在本實施方案中的一個具體實施例中，第一 anchor的結(jié)構(gòu)如圖4所示，圖中所示X為A、G、C或T, Y代表特異性殘基，n為正整數(shù)。另外，圖中Y的個數(shù)以及Y在X中的位置可變，當存在多個Y時，Y與Y之間并不一定是以圖4中所示的相連的形式存在，可分別散布在第一 anchor的不同位置。上述的第一 anchor可以使得步驟S2中熒光探針的洗脫以及更換的實現(xiàn)更加簡便。利用該結(jié)構(gòu)的第一 anchor實現(xiàn)步驟S2的方法如圖5所示，包括以下步驟
521.在含有特異性殘基的第一anchor延伸末端連接帶特定位置標記的熒光探針，檢測相應(yīng)連接產(chǎn)物的熒光信號，得到對應(yīng)位置的核苷酸序列信息；
522.以特異性切割劑切割特異性殘基，將前一步驟中連接的熒光探針及第一anchor洗脫，重置第一 anchor ；
523.在第一anchor延伸末端重復(fù)帶特定位置標記的熒光探針的連接和相應(yīng)熒光信號檢測的操作，得到第一 anchor延伸末端后M個核苷酸的序列信息。需要說明的是，在該技術(shù)方案中，步驟S21中所述第一 anchor含有的特異性殘基及其相應(yīng)的特異性切割劑可以包括多種。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，如圖6所示，第一 anchor含有的特異性殘基為dU堿基，其對應(yīng)的特異性切割劑為UDG酶。利用如圖6所示結(jié)構(gòu)的第一 anchor，步驟S2可以通過圖7所示的方法實現(xiàn)，該方法包括以下步驟
S21’ .在含有dU堿基的第一 anchor延伸末端連接帶特定位置標記的突光探針,檢測相應(yīng)連接產(chǎn)物的熒光信號，得到對應(yīng)位置的核苷酸序列信息；
S22’.以UDG酶識別dU堿基并進行酶切，將前一步驟中連接的熒光探針及第一 anchor洗脫，重置第一 anchor ；
S23’ .在第一 anchor延伸末端重復(fù)帶特定位置標記的突光探針的連接和相應(yīng)突光信號檢測的操作，得到第一 anchor延伸末端后M個核苷酸的序列信息。以該技術(shù)方案實現(xiàn)步驟S2，其優(yōu)勢在于，第一 anchor含有dU堿基，可以直接利用特異性識別酶切dU堿基的UDG酶對第一 anchor進行切割，形成短片段，從而使得步驟S2中熒光探針的洗脫以及更換的實現(xiàn)更加簡便。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例中，如圖8所示，第一 anchor所帶的特異性殘基為切口酶Nt. Alw I的酶切識別堿基。利用如圖8所示結(jié)構(gòu)的第一 anchor，步驟S2可以通過如圖9所示的方法實現(xiàn)，該方法包括以下步驟
S21’ 在含有切口酶酶切識別位點的第一 anchor延伸末端連接帶特定位置標記的熒光探針，檢測相應(yīng)連接產(chǎn)物的熒光信號，得到對應(yīng)位置的核苷酸序列信息；
S22’ 以切口酶識別切口酶酶切識別位點并進行酶切，將前一步驟中連接的熒光探針洗脫；
S23’ 在第一 anchor延伸末端重復(fù)帶特定位置標記的熒光探針的連接和相應(yīng)熒光信號檢測的操作，得到第一 anchor延伸末端后M個核苷酸的序列信息。以該技術(shù)方案實現(xiàn)步驟S2，其優(yōu)勢在于，在更換帶不同位置標記的熒光探針時，可以利用第一 anchor上所攜帶的切口酶酶切識別位點，通過相應(yīng)的切口酶直接將原來連接的突光探針與第一 anchor之間的連接打斷,從而輕松將原來連接的突光探針洗掉,連接新的熒光探針，避免將第一 anchor洗脫之后又重置，簡化操作步驟，同時節(jié)省試劑的成本。
其中，上述步驟中所述M均為正整數(shù)，其數(shù)值范圍由本發(fā)明所使用的連接酶決定，優(yōu)選為廣9，更優(yōu)選為1飛。在本發(fā)明的一個實施方案中，利用T4連接酶實現(xiàn)本發(fā)明所述的酶切延伸測序法，M的數(shù)值優(yōu)選為f 6 ;在本發(fā)明的另一個實施方案中，利用Tth連接酶實現(xiàn)本發(fā)明所述的酶切延伸測序法，M的數(shù)值范圍可優(yōu)選為廣9。在上述優(yōu)選范圍內(nèi)，本發(fā)明利用酶切延伸增加測序讀長的測序方法，不僅能夠增加檢測時測序的讀長，還能進一步提高測序過程中的熒光探針與anchor連接的準確性，進而提高核苷酸序列信息讀取的準確性。其中，當利用T4連接酶，將熒光探針連接在anchor的3’端或者5’端時，熒光探針與anchor發(fā)生連接的那一端的6個堿基需與相應(yīng)的待測序片段完全互補配對，才能實現(xiàn)連接；當利用Tth連接酶,將突光探針連接在anchor的3’端或5’端時,分別要求突光探針與anchor連接的那一端的8個或9個堿基與相應(yīng)的待測序片段完全互補配對，才能實現(xiàn)連接。上述步驟中所使用的帶不同位置標記的熒光探針分為不同組別類型，同組類型中不同熒光標記對應(yīng)同一特定位置的不同核苷酸序列信息，而不同組類型的熒光探針熒光標記對應(yīng)的特定位置不同。每次連接反應(yīng)中，加入同一組類型的熒光探針，根據(jù)所采集的熒光信號，可以得到該組熒光探針標記特定位置對應(yīng)的核苷酸序列信息；而通過第一 anchor的雜交結(jié)合-熒光探針的連接-采集熒光信號-熒光探針的洗脫這些操作的重復(fù)，可以準確的得到第一 anchor延伸末端后M個核苷酸的序列信息。步驟S2檢測結(jié)束后，待測核酸片段上保留有結(jié)合的第一 anchor和帶特定位置標記的熒光探針。為了便于步驟S3中的內(nèi)切酶進行酶切，可將第一 anchor延伸末端重新活化，然后加入四種核苷酸，利用DNA聚合酶,沿著第一 anchor延伸末端的方向，將固定于固相載體上的待測核酸片段形成完整的雙鏈核酸分子。步驟S3中所述內(nèi)切酶，是指能識別雙鏈核酸分子上所含有的特異性酶切識別堿基序列，然后在距離酶切識別位點一定數(shù)量堿基的位置進行雙鏈核酸切割的酶。在本發(fā)明中，可以使用酶切之后能得到平末端的內(nèi)切酶，優(yōu)選使用酶切之后能得到粘性突出末端的內(nèi)切酶，其選用原則遵循通過識別酶切識別位點，能將步驟S2中已經(jīng)獲取的核苷酸序列全部或部分切除的內(nèi)切酶即可。在選用內(nèi)切酶時，優(yōu)選最適反應(yīng)溫度在37 °C左右的內(nèi)切酶，最適反應(yīng)溫度過高的內(nèi)切酶容易導(dǎo)致在酶切過程中雙鏈的變性解離，從而導(dǎo)致后續(xù)熒光探針的連接受阻；優(yōu)選對甲基化不敏感的內(nèi)切酶，以便能持續(xù)的酶切和獲取待測核酸片段的核苷酸序列；優(yōu)選酶切識別位點與酶切位點之間核苷酸個數(shù)在4以上的，使得每次酶切之后向前延伸測序的長度更長。本發(fā)明所用的內(nèi)切酶可以是II型內(nèi)切酶，包括但不限于Acu I、Alw I、Bbs I、Bbv I 、Bcc I 、BceA I 、BciV I 、BfuA I 、Bmr I 、Bpm I 、Bsa I 、BseR I 、Bsg I 、BsmA I 、BsmB I 、BsmF I 、BspM I 、BspQ I 、BtgZ I 、Ear I 、Eci I 、Fau I 、Fok I 、Hga I 、Hph I 、HpyA V、Mbo II >Mly I、Mnl I、Ple I > Sap I > SfaN I、BpuE I、Mme I 和 NmeA III，其中優(yōu)選 Acu I > Bbv I > BceA I > Bpm I > BseR I > BspM I > Fok I > Hga I、Mbo II 和 Mnl I ;所用
的內(nèi)切酶也可以是III型內(nèi)切酶，包括但不限于Ecopl和Ecopl5 I。步驟S3中，用于被內(nèi)切酶進行識別的酶切識別位點，可以通過第一 anchor帶入，也可以通過其他方法帶入。根據(jù)酶切識別位點來源的不同，步驟S3也可以通過不同的方法實現(xiàn)。 在本發(fā)明中的一個實施方案中，酶切識別位點直接由第一 anchor帶入，即第一anchor含有至少一個酶切識別位點。利用第一 anchor上所含有的酶切識別位點，可以有多種不同的方式實現(xiàn)步驟S3。在本方案的一個具體實施方式
中，步驟S3可以直接利用內(nèi)切酶識別第一 anchor上所帶的酶切識別位點，將步驟S2中已經(jīng)得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到含有待測序片段的酶切產(chǎn)物。利用該實施方式實現(xiàn)步驟S3的優(yōu)勢在于，在步驟S2得到第一 anchor延伸末端后M個核苷酸的序列信息之后，利用第一 anchor上所含有的酶切識別位點直接進行酶切，可以簡化操作步驟。在本方案的另一個具體實施方式
中，利用第一 anchor上所含有的酶切識別位點，步驟S3還可以通過如圖10所示的方法實現(xiàn)，該方法包括如下步驟
531.將步驟S2中連接的突光探針與第一anchor洗脫,重置第一 anchor并進行鏈延伸，與待測核酸片段形成雙鏈核酸分子；
532.內(nèi)切酶通過識別第一anchor上所帶的酶切識別位點，將步驟S2中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到含有待測序片段的酶切產(chǎn)物。利用該技術(shù)方案實現(xiàn)步驟S3的優(yōu)勢在于,首先利用第一 anchor的延伸末端進行鏈延伸，與待測核酸片段延伸形成雙鏈核酸分子，能夠保證酶切產(chǎn)物保持雙鏈狀態(tài)，便于后續(xù)接頭的連接。在本實施方案的一個優(yōu)選實施例中，待測核酸片段通過5’端連接固定于微珠上，而結(jié)合于第一接頭的第一 anchor上含有酶切識別位點序列5’…CTGAAG…3’，步驟S3中利用II型內(nèi)切酶Acu I識別該酶切識別位點并進行酶切，得到待測序片段3’端含有兩個突出核苷酸的酶切產(chǎn)物。在本實施方案的另一個優(yōu)選實施例中，待測核酸片段通過5’端連接固定于微珠上，而結(jié)合于第一接頭的第一 anchor上含有酶切識別位點序列5’ 一GCAGO" 3’，步驟S3中利用II型內(nèi)切酶Bbv I識別該酶切識別位點并進行酶切，得到待測序片段3’端含有兩個突出核苷酸的酶切產(chǎn)物。在本實施方案的另一個優(yōu)選實施例中，待測核酸片段通過5’端連接固定于微珠上，而結(jié)合于第一接頭的第一 anchor上含有酶切識別位點序列5’…GAGTC…3’，步驟S3中利用II型內(nèi)切酶Mly I識別該酶切識別位點并進行酶切，得到待測序片段3’端含有平末端的酶切產(chǎn)物。在本實施方案的一個優(yōu)選實施例中，待測核酸片段通過3’端連接固定于微珠上，而結(jié)合于第一接頭的第一 anchor上含有酶切識別位點序列5’…CATCO" 3’，步驟S3中利用Fok I酶識別該酶切識別位點并進行酶切，得到待測序片段5’端含有4個突出核苷酸的酶切產(chǎn)物。在本實施方案的一個具體實施例中，待測核酸片段通過5’端連接固定于微珠上，而結(jié)合于第一接頭的第一 anchor上含有酶切識別位點序列5’…CAGCAG…3’，步驟S3中利用III型內(nèi)切酶Ecopl5 I酶識別該酶切識別位點并進行酶切，得到待測序片段3’端含有兩個突出核苷酸的酶切產(chǎn)物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，酶切識別位點通過在第一 anchor的另一端連接含有至少一個酶切識別位點的第三接頭帶入。利用第三接頭，步驟S3可以通過如圖11所示的方法實現(xiàn)，該方法包括以下步驟
S31’.在第一 anchor的另一端連接雙鏈的第三接頭，該第三接頭含有至少一個酶切識別位點；
S32’.利用內(nèi)切酶識別第三接頭所帶的酶切識別位點，將步驟S2中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到含有待測序片段的酶切產(chǎn)物。需要說明的是，所述第一 anchor的另一端,是相對步驟SI中第一 anchor已經(jīng)用于延伸的末端而言的；若第一 anchor的另一端在步驟S3之前是被封閉的，那么在步驟S3之前需要先進行活化；活化的方法可以利用現(xiàn)有技術(shù)中的任一種，只需將另一端中可用于連接的基團暴露出來即可，如在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實施方式
中，第一 anchor本身含有特異性殘基，可直接利用特異性切割劑切割特異性殘基完成活化。所述第三接頭，是含有至少一個酶切識別位點的核酸分子，用于引入內(nèi)切酶的酶切識別位點，以便于后續(xù)步驟中，通過內(nèi)切酶將已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除。利用該技術(shù)方案實現(xiàn)步驟S3的優(yōu)勢為適用性廣，對待測核酸片段無特殊要求，無論待測核酸片段上結(jié)合的第一 anchor是否含有酶切識別位點，均可通過該技術(shù)方案實現(xiàn)。需要進一步說明的是，第三接頭可以選用相應(yīng)含有不同末端的接頭，具體可包括但不限于平末端接頭、突出末端接頭、分叉型接頭和帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭，這些接頭的結(jié)構(gòu)與特性可參見專利文獻CN201110222952.4。本發(fā)明中優(yōu)選使用突出末端接頭、分叉型接頭和帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭，這些結(jié)構(gòu)的接頭在連接過程中可以避免出現(xiàn)多個接頭之間自連的現(xiàn)象。針對上述不同的實現(xiàn)方案，第三接頭上所述用于酶切的內(nèi)切酶酶切識別位點可以是上述內(nèi)切酶所對應(yīng)的任意一種，只需在設(shè)計合成時將酶切識別位點與酶切位點之間的核苷酸預(yù)先計算好，使得酶切之后恰好將步驟S2中已經(jīng)讀取過序列信息的核苷酸部分或完全切除即可，因此在本發(fā)明中可以選用不同的酶切識別位點及其相應(yīng)的內(nèi)切酶實現(xiàn)對步驟S2中已得到序列信息的核苷酸的切除。應(yīng)當說明的是，上述實施方案僅是本發(fā)明中關(guān)于選用的酶切識別位點及其相應(yīng)的內(nèi)切酶的一些具體實施例，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍，換用符合條件的其他酶切識別位點及相應(yīng)的內(nèi)切酶，同樣可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。為得到含有待測序片段的酶切產(chǎn)物，可以在步驟S3的酶切反應(yīng)之后進行純化回收，而純化回收的方法可以利用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方式實現(xiàn)。在本發(fā)明的一個實施例中，待測核酸片段固定于玻片上，酶切之后直接以緩沖液沖洗即可實現(xiàn)有待測序片段的酶切產(chǎn)物與其他物質(zhì)分離純化；在本發(fā)明的另一個具體實施例中，待測核酸片段固定于磁珠上，直接利用磁鐵吸附，以緩沖液輕微沖洗，即可實現(xiàn)含有待測序片段的酶切產(chǎn)物與其他物質(zhì)分離純化。驟S4中，在連接第二接頭之前，根據(jù)步驟S3中得到的酶切產(chǎn)物的不同以及后續(xù)使用的連接方法，可以選擇性的對酶切產(chǎn)物進行修飾處理，如末端補平；也可以直接利用酶切之后得到的突出末端進行第二接頭的連接。在本發(fā)明的一個具體實施例中，根據(jù)步驟S3中 利用第一 anchor上所帶內(nèi)切酶的酶切識別位點，以Fok I進行酶切，得到3’端含有4個核苷酸序列突出末端的酶切產(chǎn)物。對酶切產(chǎn)物先進行末端補平處理，然后再連接第二接頭。此實施方式的優(yōu)勢在于可以避免由于過長的突出末端而使得第二接頭合成的種類過多，從而降低第二接頭的合成成本。在本發(fā)明的另一個具體實施例中，根據(jù)步驟S3中利用第一 anchor上所帶酶切識別位點為Acu I的酶切識別位點，以Acu I進行酶切，得到3’含有2個核苷酸序列突出末端的酶切產(chǎn)物。針對該突出末端突出的核苷酸較少，只需合成42種第二接頭即可實現(xiàn)連接，因此直接利用酶切之后得到的突出末端進行第二接頭的連接。此實施方式的優(yōu)勢在于可以簡化操作步驟，直接加入第二接頭進行反應(yīng)即可。步驟S4中，所述第二接頭，是用于與含有待測序片段的酶切產(chǎn)物連接形成新待測核酸片段的雙鏈核酸分子。根據(jù)酶切產(chǎn)物末端以及選用的連接方式不同，第二接頭可以選用相應(yīng)含有不同末端的接頭，包括但不限于平末端接頭、突出末端接頭、分叉型接頭和帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭，這些接頭的結(jié)構(gòu)與特性可參見專利文獻CN201110222952. 4。本發(fā)明中優(yōu)選使用突出末端接頭、分叉型接頭和帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭，這些結(jié)構(gòu)的接頭在連接過程中可以避免出現(xiàn)多個接頭之間自連的現(xiàn)象。步驟S4中，為了便于后續(xù)第二 anchor與第二接頭的互補配對能夠順利進行，可以對酶切產(chǎn)物與第二接頭連接之后形成的雙鏈核酸連接產(chǎn)物進行處理，形成單鏈形式的新待測核酸片段。將雙鏈核酸連接產(chǎn)物上互補結(jié)合于待測序片段上的核苷酸以及酶切之后保留下來的核苷酸進行處理形成單鏈新待測核酸片段的方法，包括但不限于通過NaOH變性解離或升溫退火的方式進行清除。所述第二 anchor是能與第二接頭錨定結(jié)合的單鏈核酸分子,用于在步驟S5中連接突光探針；所述第二 anchor可以與第一 anchor相同或者不同。若第二 anchor與第一anchor相同，則后續(xù)繼續(xù)酶切時可使用相同的內(nèi)切酶進行操作，簡化反應(yīng)試劑的種類，同時還能避免因新待測核酸片段中存在相同的內(nèi)切酶序列，導(dǎo)致后續(xù)的酶切步驟得到非目標產(chǎn)物；若第二 anchor與第一 anchor不同，貝U可以在第二 anchor的合成中引入新的設(shè)計,滿足更多的實際需要。第二 anchor與第一 anchor的不同，可以是酶切識別位點的位置和種類不同，也可以是核苷酸數(shù)量的不同。第二 anchor根據(jù)需要可以進行其他處理。在本發(fā)明的一個具體實施例中，根據(jù)需要將第二 anchor的3’端或5’端進行封閉,用以控制連接方向，并避免第二 anchor相互之間的自連。在本實施例的一個具體實施方式
中，對3’端進行封閉的方法包括但不限于雙脫氧、氨基化反應(yīng)、酰胺化，其無法繼續(xù)連接，控制第二 anchor的連接只發(fā)生在5’端；在本實施例的另一個具體實施方式
中，將第二 anchor的5’端進行封閉，通過5’端進行去磷酸化或酰胺化處理將其封閉，從而只保留3’端作為連接的末端。在本發(fā)明的另一個具體實施例中，第二 anchor含有特異性殘基，可以使得后續(xù)熒光探針的更換以及洗脫更加簡便。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，第二 anchor所帶的特異性殘基為dU堿基，其核苷酸序列中引入數(shù)個dU堿基，該結(jié)構(gòu)的第二 anchor可以在后續(xù)測序的洗脫過程中直接切除dU堿基形成不同的短片段，便于洗脫的實現(xiàn)。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式中，第二 anchor所帶的特異性殘基為含有硫代磷酸酯鍵的堿基，在其核苷酸序列中，以一個或多個硫代磷酸酯鍵(P-S)代替原有的P-O鍵，可以直接利用含有Ag、Hg、Cu、Mn、Zn和Cd離子的化合物切割P-S鍵實現(xiàn)第二 anchor的洗脫。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式中，第二 anchor含有兩個酶切識別位點，其中一個為用于切割雙鏈的限制性內(nèi)切酶酶切識別位點，另一個為用于切割雙鏈中的一條單鏈形成切口的切口酶酶切識別位點。應(yīng)當說明的是，上述實施例僅是本發(fā)明中第二 anchor的一些具體 實施方式，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。步驟S5中，得到第二 anchor延伸末端后N個核苷酸的序列信息通過如圖12所示的方法實現(xiàn)，該方法包括以下步驟
551.在第二anchor延伸末端后連接帶特定位置標記的熒光探針，檢測相應(yīng)連接產(chǎn)物的熒光信號，得到相應(yīng)位置的核苷酸序列信息；
552.將前一步驟連接的熒光探針去除，連接帶不同位置標記的熒光探針，檢測相應(yīng)連接產(chǎn)物的熒光信號，得到相應(yīng)標記位置的核苷酸序列信息；
553.重復(fù)步驟S52的操作，直至得到第二anchor延伸末端后N個核苷酸的序列信息。上述技術(shù)方案利用帶不同位置標記的熒光探針之間的連接和更換，實現(xiàn)對第二anchor延伸末端后N個核苷酸的序列信息的獲取。其中，步驟S52中所述熒光探針的去除可以有多種方式實現(xiàn)。在本步驟的一個具體實施方式
中，利用NaOH變性將熒光探針以及第二 anchor從新待測核酸片段上解離下來，然后將第二 anchor重新結(jié)合于第二接頭上，進行后續(xù)標記位置不同的熒光探針的連接以及信號檢測操作。此實施方式簡單易行，不需要添加另外的試劑。在本步驟的另一個優(yōu)選實施方式中，第二 anchor含有數(shù)個dU堿基，因此利用UDG酶直接進行dU堿基的切除，形成短片段，升溫變性解離，重新得到新待測核酸片段，然后將第二 anchor重新結(jié)合于第二接頭上，進行后續(xù)標記位置不同的熒光探針的連接以及信號檢測操作。在本步驟的另一個優(yōu)選實施方式中,第二 anchor的核苷酸序列中，幾個硫代磷酸鍵(P-S)代替原有的P-O鍵，因此直接利用含有Ag、Hg、Cu、Mn、Zn和Cd離子的化合物切割P-S鍵實現(xiàn)第二 anchor以及突光探針的去除。在本步驟的另一個優(yōu)選實施方式中，第二 anchor延伸末端處含有一個切口酶的酶切識別位點，因此直接利用切口酶將熒光探針與第二 anchor之間的連接去除，就可以在第二 anchor的延伸末端繼續(xù)連接標記位置不同的熒光探針，實現(xiàn)后續(xù)測序步驟的實施。此實施方式直接將熒光探針去除，而不需要對第二 anchor進行處理，既簡化操作，又降低試劑成本。上述優(yōu)選實施方式利用特異性的物質(zhì)將第二 anchor中的連接切除，形成短小片段，然后利用溫和條件即可去除熒光探針。其中，上述步驟中所述N為正整數(shù)，其數(shù)值范圍同樣由本發(fā)明所使用的連接酶決定，優(yōu)選為f 9，更優(yōu)選為f 6。在本發(fā)明的一個實施方案中，利用T4連接酶實現(xiàn)本發(fā)明所述的酶切延伸測序法，N的數(shù)值優(yōu)選為1飛；在本發(fā)明的另一個實施方案中，利用Tth連接酶實現(xiàn)本發(fā)明所述的酶切延伸測序法，N的數(shù)值范圍優(yōu)選為廣9。在上述優(yōu)選范圍內(nèi)，本發(fā)明的酶切延伸測序法不僅能夠增加測序讀長，還能進一步提高測序過程中的熒光探針與anchor連接的準確性，進而提高核苷酸序列信息讀取的準確性。其中，當利用T4連接酶，將熒光探針連接在anchor的3’端或者5’端時,突光探針與anchor發(fā)生連接的那一端的6個堿基需與相應(yīng)的待測序片段完全互補配對，才能實現(xiàn)連接；當利用T th連接酶，將熒光探針連接在anchor的3’端或5’端時,分別要求突光探針與anchor連接的那一端的8個或9個堿基與相應(yīng)的待測序片段完全互補配對，才能實現(xiàn)連接。圖13為步驟S5中一個具體實施例中得到第二 anchor延伸末端后N個核苷酸的序列信息的方法示意圖，該圖直觀的展現(xiàn)了得到第二 anchor延伸末端后N個核苷酸的序列信息的過程。步驟51.讀取第二 anchor延伸末端后第I位核苷酸序列信息在T4連接酶的作用下，第二 anchor延伸末端后連接標記位置為第I位的熒光探針，然后采圖，收集熒光信號，根據(jù)得到的突光信號確定第二 anchor延伸末端后第I位的核苷酸序列信息。步驟52.讀取第二 anchor延伸末端后第2位核苷酸序列信息利用第二 anchor延伸末端處所帶的切口酶酶切識別位點，將熒光探針與第二 anchor之間的連接切掉，通過升溫變性解離將標記位置為第I位的熒光探針洗脫，然后換用標記位置為第2位的熒光探針連接到第二 anchor的延伸末端，采圖成像，收集熒光信號，根據(jù)得到的熒光信號確定第
二anchor延伸末端后第2位的核苷酸序列信息。步驟53.讀取后續(xù)核苷酸重復(fù)步驟52的操作，換用帶不同位置標記的熒光探針獲取相應(yīng)位置的核苷酸序列信息，直至得到第二 anchor延伸末端后第6位核苷酸的序列信
肩、O上述實施方案中，利用第二 anchor延伸末端處含有的切口酶酶切識別位點,直接實現(xiàn)帶不同位置標記的熒光探針的連接更換，從而實現(xiàn)獲取第二 anchor延伸末端后6個核苷酸的序列信息。應(yīng)當說明的是,上述實施例僅是實現(xiàn)步驟S5中得到第二 anchor延伸末端后N個核苷酸的序列信息的一些具體實施方案，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍。例如改變其中N的數(shù)值，如更換與之前反應(yīng)中所使用的試劑不同的試劑或者是將之前反應(yīng)中反應(yīng)過的試劑換成未反應(yīng)過的試劑。步驟S6中所述更換的試劑,指的是步驟S3至S5中所用到的內(nèi)切酶、接頭、anchor和帶不同位置標記的熒光探針；所述更換，指的是廣義的更換，如更換不同種類的試劑或者是將反應(yīng)過的試劑換成未反應(yīng)過的試劑。試劑更換之后，以內(nèi)切酶對步驟S5的產(chǎn)物進行已讀取核苷酸序列的切除，然后再使酶切產(chǎn)物與新的接頭連接，并結(jié)合新的anchor，連接新的熒光探針，檢測該熒光探針的熒光信號，即可得到該熒光探針對應(yīng)位置的核苷酸序列。如此進行類似上述的循環(huán)操作，即可得到待測核酸片段中所需的核苷酸序列信息。
圖14為本發(fā)明一個實施例中增加測序讀長的測序方法示意圖，該圖直觀的展現(xiàn)了利用酶切延伸的方法進行測序的過程。步驟I.第一 anchor雜交結(jié)合將第一 anchor通過堿基互補配對雜交結(jié)合于待測核酸片段的第一接頭上，其中待測核酸片段的5’端通過連接固定于微珠表面；其中，第一anchor含有序列為5’…CTGAAG…3’的酶切識別位點，且第一 anchor的核苷酸序列中含有dU堿基。
步驟2.獲取第一 anchor延伸末端后6個核苷酸的序列信息T4連接酶作用下，在第一 anchor的延伸末端連接用于檢測的熒光探針，檢測熒光信號得到相應(yīng)位置的核苷酸序列信息，并利用UDG酶切除dU堿基以實現(xiàn)第一 anchor的重置和帶不同位置標記的熒光探針的更換檢測，采集相應(yīng)探針的熒光信號圖，獲得第I至6位的核苷酸序列信息。步驟3.酶切為便于后續(xù)酶切的進行，當?shù)谝?anchor延伸末端后6個核苷酸的序列信息全部被讀取之后，首先在DNA聚合酶的作用下，將待測核酸片段延伸形成完整的雙鏈核酸分子；然后利用Acu I酶特異性識別并酶切第一 anchor中所攜帶的酶切識別位點，將之前已經(jīng)讀取過的第一 anchor延伸末端的6個核苷酸序列切除，得到3’端含有兩個核苷酸突出末端的未測序片段；酶切反應(yīng)之后，利用磁鐵吸附磁珠，將含有未測序片段的酶切產(chǎn)物純化回收。步驟4.酶切產(chǎn)物連接第二接頭并結(jié)合第二 anchor :利用步驟3的酶切產(chǎn)物的一端所含有兩個核苷酸突出末端，與一共為42=16種的第二接頭，在T4連接酶的作用下進行連接得到雙鏈連接產(chǎn)物；連接反應(yīng)結(jié)束之后，將雙鏈連接產(chǎn)物變性解離形成單鏈，得到固定于磁珠上的新待測核酸片段；將第二 anchor通過堿基互補配對結(jié)合于新待測核酸片段的第二接頭上。其中，第二 anchor上同樣含有序列為5’…CTGAAG…3’的酶切識別位點，且距離第二 anchor延伸末端處4個核苷酸位置處還含有序列為5’…GGATC…3’的酶切識別位點。步驟5.獲取第二 anchor延伸末端后6個核苷酸的序列信息按照如圖12所示實施例的方法，利用切口酶Nt. Alw I切割帶特定位置標記的突光探針與第二 anchor之間的連接，實現(xiàn)帶不同位置標記熒光探針的更換，從而可以讀取不同位置的核苷酸序列信息，獲取第二 anchor延伸末端后6個核苷酸的序列信息。步驟6.更換試劑，重復(fù)步驟3、步驟4、步驟5中的操作，獲取一定數(shù)量(其數(shù)值范圍優(yōu)選為1飛)的核苷酸序列信息之后，通過酶切手段切除已經(jīng)讀取過的核苷酸序列，并構(gòu)建新的待測核酸片段，以此實現(xiàn)延伸測序的目的，直至得到待測核酸片段上所需的核苷酸序列信息。針對上述各技術(shù)方案，為進一步說明本發(fā)明所記載技術(shù)方案的技術(shù)效果及優(yōu)越性，本發(fā)明給出一具體的操作實施例。本實施例以一個包含有牛奶吸收與消化能力MCM6基因的一段核酸片段(SEQ IDNO: 103)的單克隆質(zhì)粒，和一個包含有葉酸及維生素B吸收能力MTHFR基因的一段核酸片段(SEQ ID NO: 104)的單克隆質(zhì)粒作為待測樣品的核酸模板。其中，MCM6基因和MTHFR基因相應(yīng)的特異性擴增引物為SEQ ID N0:61 和 SEQ ID NO:62, SEQ ID N0:63 和 SEQ ID NO:64,從中分別擴增出用于后續(xù)測序的目標核酸片段，然后利用目標核酸片段構(gòu)建測序文庫，從而進行待測核酸片段的檢測。
其中待測核酸片段的5’端接頭通過鏈霉親和生物素的作用與磁珠結(jié)合，待測核酸片段的3’端含有第一接頭序列。為減少操作過程的復(fù)雜性，兩種核酸片段的第一接頭采用相同的序列，因此在本實施例中兩者所使用的第一 anchor也是ー樣的，兩者同時進行操作。整個測序過程以及熒光信號圖像數(shù)據(jù)的處理分析采用深圳華因康基因科技有限公司生產(chǎn)的Pstar- II Plus測序平臺進行。所述實施例具體操作如下。一、待測核酸片段的擴增。
利用上述核酸模板的特異性擴增引物，對MCM6基因和MTHFR基因的目標核酸片段進行擴增，得到用于構(gòu)建測序文庫的目標核酸片段。其中，所述擴增是分別進行的，反應(yīng)體系如下:F$_(10iiM)，2iiL;I^1^_(10iiM)，2iiL;dNTP (各 2. 5mM)，4 y L ;作為核酸模板的質(zhì)粒，20ng;Ex Taq (5U/u L),0. 25 U L ；10XEx Taq Buffer，5 ii L ;ddH20 加至 50 ii しPCR反應(yīng)條件如下
95 0C 3min ；
94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s ;重復(fù) 25 個循環(huán)；
72 °C 7min。利用PCR回收試劑盒，分別對各樣品的擴增產(chǎn)物進行分離，除去未擴增的引物和dNTP,瓊脂糖凝膠純化回收目標核酸片段。ニ、利用擴增得到的目標核酸片段構(gòu)建測序文庫。在步驟一中擴增得到的目標核酸產(chǎn)物兩端連接第一接頭，然后進行單分子擴增，得到測序用的測序文庫。I.目標核酸片段與第一接頭連接。以末端含有突出T堿基的突出末端接頭作為第一接頭，其具體序列為SEQ IDN0:95和SEQ ID NO:96，且該第一接頭含有特定位置的生物素化修飾，以便于后續(xù)與含有鏈霉親和素修飾的磁珠連接。第一接頭與目標核酸片段連接，得到含有第一接頭的目標核酸片段。在T4連接酶的作用下，將分別擴增得到的兩種目標核酸產(chǎn)物以等摩爾比混合，與第一接頭連接，得到含有第一接頭的目標核酸片段，連接體系為目標核酸產(chǎn)物的混合物，50 u L (約 500ng);第一接頭，L (約 3000ng)；10mM ATP,5u L ；T4 DNA 連接酶(30U/y L)，luL；10XT4連接酶緩沖液，IOu L ;カロ ddH20至100 uし16°C孵育4h以上,反應(yīng)結(jié)束后利用純化試劑盒純化回收。2.利用含有第一接頭的目標核酸片段進行單分子擴增，構(gòu)建測序文庫。利用如之前圖3所示的擴增方法，以含有第一接頭的目標核酸片段進行單分子擴増，構(gòu)建測序文庫，得到待測核酸片段，具體操作如下。I)將含有生物素修飾的目標核酸片段與含有鏈霉親和素修飾的Myone磁珠(I U m, lOmg/mL ；Invitrogen)結(jié)合，使得磁珠表面固定有至少ー個目標核酸片段，反應(yīng)體系及反應(yīng)過程為含有第一接頭的目標核酸片段，0. 018ng (IO8個分子)；My0ne磁珠(I U m, lOmg/mL ;Invitrogen), 6 u L ;螺旋振蕩混勻，反應(yīng) 30min,以適量 TE 緩沖液(IOmMTris-HCl, pH8. 0 ；lmM EDTA )清洗兩次，離心分離，將得到的磁珠以6 y L結(jié)合緩沖液(IOmMTris-HCl, pH7. 5 ；lmM EDTA ；1M NaCl ；0. 01% Triton X-100)重懸保存。2)單分子擴增引物結(jié)合于磁珠表面。
將步驟I)得到的產(chǎn)物與5’端含有生物素標記和距離5’端第6位核苷酸含有氨基化的單分子擴增引物(F3、R3)反應(yīng)，使生物素化的F3、R3與含有第一接頭的目標核酸片段同時結(jié)合在磁珠表面，其中，F(xiàn)3、R3的序列為SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98，與含有第一接頭的目標核酸片段互補。反應(yīng)體系及過程如下生物素化且氨基化的引物F3 (IOOuM),0. 3u L ;生物素化且氨基化的引物R3 (100uM),0. 3u L ;步驟I)中得到的磁珠懸浮液，6uL ;室溫條件下(18 25°C )，螺旋振蕩，孵育Ih ;適量TE緩沖液清洗2次，離心，以6 y L TE緩沖液重懸磁珠，得到磁珠懸浮液，4°C保存?zhèn)溆谩?
本步驟中，用于與磁珠結(jié)合，并作為單分子擴增模板序列的目標核酸片段的摩爾數(shù)與磁珠的數(shù)量大致相同，因此，步驟I)所得的磁珠懸浮液中的一個磁珠表面只結(jié)合了極少量甚至是單個模板序列。3)制備用于單分子擴增的乳濁液體系。采用深圳華因康基因科技有限公司的KE001乳濁液制備試劑盒，根據(jù)使用說明制備乳濁液體系。首先對油相制備試劑以螺旋劇烈振蕩進行混勻，置于室溫30min，得到用于制備乳濁液體系的油相體系；利用步驟2)得到的磁珠懸浮液制備PCR Mix水相體系，以150ii L 為例，該水相體系如下ddH20，113ii L ;10XPCR buffer (650mM Tris-HCl, pH8. 0 ；160mM (NH4)2SO4 ；10mM DTT ；llmM MgCl2), 15u L ；50mM MgS04,3u L ；10mM dNTP,3u L ;未生物素化且無氨基化的F3 (10uM),0. 5u L ;未生物素化且無氨基化的R3 (IOuM),0. 5u L ；步驟2)得到的磁珠懸浮液，L ；5U/uL DNA Taq酶，L ;將上述成分混勻，制備成PCRMix水相體系。將制備好的油相體系與水相體系按照4:1的比例放入EP管中混合，同時加入輔助混勻的鋼珠，將EP管置于乳濁液制備儀上夾緊，按照15HZ，10s，再轉(zhuǎn)換17HZ，8s進行振蕩混勻，制備成用于單分子擴增的乳濁液體系。4)利用制備好的乳濁液體系進行單分子擴增。利用制備好的乳濁液體系進行EPCR單分子擴增，反應(yīng)體系及反應(yīng)過程如下所示 4min,94°C ；
30s，94。。，
55s，64。。，
45s，72°C，循環(huán)數(shù)為3 ；
30s，94。。，
55s，61°C，
45s，72°C，循環(huán)數(shù)為3 ；
30s，94。。，
55s, 58°C,
45s，72°C，循環(huán)數(shù)為3 ；
30s，94。。，
55s，57。。，
45s，72°C，循環(huán)數(shù)為 100 ；
6min，72°C ；
反應(yīng)結(jié)束后10°C保存。
3.破乳釋放擴增產(chǎn)物，分離提純得到測序文庫。在EPCR反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)產(chǎn)物中加入適量異丙醇，螺旋震蕩混勻后4000rpm，3min離心分離去上清，擴增產(chǎn)物以磁鐵吸附。擴增產(chǎn)物中加入適量的抽提緩沖液(Extraction buffer),螺旋振蕩混勻后4000rpm離心3min分層，用磁鐵吸附磁珠，將液體清除；重復(fù)此操作數(shù)次。然后加入適量TE，重復(fù)清洗數(shù)遍擴增產(chǎn)物，最后以適量的TE重懸磁珠，得到含有待測核酸片段的磁珠。三、利用測序文庫進行酶切延伸測序。
I.第一 anchor錨定結(jié)合于待測核酸片段的第一接頭上。將含有待測核酸片段的磁珠與測序緩沖液混合，在含有羧基活化基團修飾的玻片上進行點樣固定，形成測序陣列。將第一 anchor (SEQ ID N0:99)與待測核酸片段的第一接頭之間通過堿基互補配對雜交結(jié)合，其中第一 anchor延伸末端上含有Acu I酶的酶切識別位點，該反應(yīng)過程及體系為:28°C,400ML 2XSSPE (saline sodium phosphate EDTA)[175. 32g/L NaCl，31. 202g/L NaH2PO4. 2H20，0. OlM EDTA, pH7. 4]雜交緩沖液對固定于玻片表面的待測核酸片段進行潤洗；加入第一 anchor (15剛)，2 X SSPE環(huán)境下升溫至65°C，維持30s ;降溫至42°C，雜交Imin ;以磁鐵吸附磁珠，30°C，900ML清洗緩沖液[50mM KCl，IOmMTris-HCl (pH7. 4),0. ImM EDTA]進行清洗,將未反應(yīng)的第一 anchor分離清除。2.獲取第一 anchor延伸末端后6個核苷酸的序列信息。I)連接熒光探針。本實施例所用熒光探針分為不同組別類型，同組類型中不同熒光標記對應(yīng)同一特定位置的不同核苷酸序列，而不同組類型的熒光探針熒光標記對應(yīng)的特定位置不同。毎次連接反應(yīng)中，加入同一組類型的熒光探針，根據(jù)所采集的熒光信號，可以讀取該組熒光探針標記特定位置對應(yīng)的核苷酸序列信息。所述熒光探針的結(jié)構(gòu)為5’ -NNNXNNNNN-3’，其中N為簡并堿基，X為A、T、G和C中的任意ー種，X可以在5’端數(shù)起的第I至第6中的任何位置。在T4連接酶的作用下，將對應(yīng)I號位帶不同熒光標記的ー組四種熒光探針混合后連接到第一 anchor延伸末端之后，連接反應(yīng)過程及體系為30°C，連接緩沖液[IOOmMMgCl2. 6H20, IOmM Tris-HCl (pH7. 4)]對雜交分離的產(chǎn)物進行潤洗；加入0. 2U/ML T4連接酶，熒光探針(濃度為2. 5剛)，連接緩沖液中，300C，反應(yīng)20min ;連接反應(yīng)結(jié)束之后，以磁鐵吸附磁珠，300C，900ML清洗緩沖液沿玻片平面進行清洗，將未反應(yīng)的熒光探針與連接產(chǎn)物進行分離。2)采集熒光信號，讀取相應(yīng)位置的核苷酸序列信息。將連接有熒光探針的連接產(chǎn)物放入測序儀，在熒光顯微鏡下進行激發(fā)，采集熒光信號，根據(jù)熒光信號判斷讀取該位置的核苷酸序列。3)洗脫第一 anchor及熒光探針。在讀取上ー步驟中相應(yīng)位置的核苷酸序列信息后，可以利用不同的方法進行洗脫。在本實施例中，利用NaOH直接變性解離，反應(yīng)過程及體系為測序反應(yīng)體系中加入NaOH (0. 05M),變性30s ；以磁鐵吸附磁珠，30°C，900ML洗脫緩沖液進行清洗，將變性解離的第一 anchor及熒光探針以及NaOH進行清洗分離。在本發(fā)明的另ー個實施例中，利用UDG酶對第一 anchor中的dU堿基進行切割形成小片段，然后將小片段直接洗脫，反應(yīng)過程及體系為酶切緩沖液，20ML ；UDG酶，IOML ;洗脫緩沖液加至200ML ；37°C,5min進行酶切；酶切結(jié)束后，以磁鐵吸附磁珠，加入900ML洗脫緩沖液進行洗脫分離，得到未接第一 anchor的待測核酸片段。4)重復(fù)上述步驟，通過更換不同標記位置的熒光探針進行連接，從而讀取得到第一 anchor延伸末端后第I至6位的核苷酸序列信息。3. Acu I酶切，得到含有未測序片段的酶切產(chǎn)物。 I)延伸形成雙鏈核酸分子。為便于后續(xù)酶切的進行，當?shù)谝?anchor延伸末端后6位核苷酸序列信息全部被讀取之后，利用之前所述的NaOH變性解離方法除去熒光探針及第一 anchor，并重新結(jié)合第一 anchor于第一接頭上，然后在DNA聚合酶的作用下，將待測核酸片段延伸形成完整雙鏈核酸分子，延伸反應(yīng)體系及過程為30°C條件下，以Klenow酶反應(yīng)緩沖液潤洗第一 anchor與待測核酸片段的結(jié)合物；加入dNTP以及0. 1U/ML的Klenow酶(BioLabs Inc.，貨號勵210し)，1\肥8ばデ6“反應(yīng)緩沖液中，37で，孵育IOmin ;延伸反應(yīng)結(jié)束后，以磁鐵吸附磁珠，30°C，900ML清洗緩沖液進行清洗，分離得到待測核酸片段延伸形成的完整雙鏈核酸分子。2) Acu I 酶切。得到雙鏈核酸分子后，以Acu I進行酶切，得到含有待測序片段的酶切產(chǎn)物，酶切的反應(yīng)體系及過程為30°C，雙鏈核酸分子中加入400ML IXNEBuffer 2，40剛SAM ;加入0. 05U/ML的Acu I酶(BioLabs Inc. )，37°C孵育2h ;酶切反應(yīng)結(jié)束后，以磁鐵吸附磁珠，30°C，900ML清洗緩沖液進行清洗，分離得到含有待測序片段的酶切產(chǎn)物，其中含有待測序片段的核苷酸鏈3’端含有兩個核苷酸的突出末端。4.酶切產(chǎn)物連接第二接頭，并結(jié)合第二 anchor。I)酶切產(chǎn)物連接第二接頭。利用酶切產(chǎn)物所帶的突出末端，以如圖14所示結(jié)構(gòu)的第二接頭(SEQ ID NOilOO和SEQ ID N0:101)進行連接，其中突出末端的-X堿基為A或G或C或T，第二接頭是以種類一共為42=16種接頭等摩爾比混合的形式加入連接反應(yīng)中，連接反應(yīng)的體系和過程為30°C條件下，在回收的酶切產(chǎn)物中加入IX連接緩沖液；加入濃度為10剛的16種接頭混合的第二接頭，以及0. 2U/ML的T4連接酶，16°C條件下孵育Ih ;連接反應(yīng)結(jié)束后，以磁鐵吸附磁珠，300C，900ML清洗緩沖液進行清洗，分離得到雙鏈核酸分子形式的新待測核酸片段。2)第二 anchor 的結(jié)合。以NaOH變性解離的方法，將雙鏈核酸分子形式的新待測核酸片段轉(zhuǎn)變成含有未測序片段的單鏈新待測核酸片段。第二 anchor (SEQ ID NO: 102)與第二接頭的雜交結(jié)合體系及過程為28°C，在單鏈新待測核酸片段中加入400ML 2X SSPE，加入第二 anchor(10剛)，60で維持30s ;然后降溫至42°C，雜交孵育2min ;雜交結(jié)束之后，以磁鐵吸附磁珠，300C, 900ML清洗緩沖液進行清洗,將未反應(yīng)的第二 anchor分離清除。5.獲取第二 anchor延伸末端后6個核苷酸的序列信息。參考步驟2中獲取第一 anchor延伸末端后6個核苷酸序列信息的相同方法和類似操作，通過更換不同標記位置的熒光探針進行連接，讀取得到第二 anchor延伸末端后第I至6位的核苷酸序列信息。6.獲取后續(xù)核苷酸序列信息。更換新的anchor、接頭以及內(nèi)切酶，重復(fù)步驟3至步驟5的操作，通過酶切手段切除已經(jīng)讀取過的核苷酸序列，并構(gòu)建新的待測核酸片段，以此實現(xiàn)向前延伸測序的目的，直至得到待測核酸片段上所能讀取的全部核苷酸序列信息。對MCM6基因核酸片段以及MTHFR基因核酸片段所形成的待測核酸片段進行測序所得到的熒光信號圖像數(shù)據(jù)，利用與Pstar II -Plus測序平臺 進行分析，得到序列號分別為SEQ ID NO: 105和SEQ ID NO: 106的核酸序列，更為具體的分析結(jié)果如表I所示。表I.熒光信號圖像數(shù)據(jù)分析結(jié)果圖
項目前IOObases準確率100 200bases準確率200 300bases準確率前300bases的平均準確率
MCM6 基因核酸片段 99.98% (Q30) 99. 88% (Q20)99. 26% (Q20)99. 74% (Q20)
MTHFR 基因核酸片段[99. 96% (Q30) [99. 85% (Q20)199. 24% (Q20)]99. 66% (Q20)
其中，表中所述Q30指的是在測序過程中讀取錯誤率僅為千分之一的核苷酸；Q20指的是在測序過程中讀取錯誤率僅為百分之一的核苷酸。根據(jù)表I數(shù)據(jù)，以測序過程中Q20能達到99%為可信數(shù)據(jù)作為判斷標準，通過上述實施例中得到的分析數(shù)據(jù)，利用本發(fā)明所記載的技術(shù)方案在在本實施例進行MCM6、MTHFR基因檢測，能夠達到至少300bp高質(zhì)量的測序讀長。同吋，為了驗證本實施例測序結(jié)果的準確性，將最初包含有MCM6基因核酸片段以及包含有MTHFR基因核酸片段的單克隆質(zhì)粒用sanger測序法進行序列測定，將得到的核酸序列結(jié)果與本實施所得的結(jié)果進行比對，比對結(jié)果顯示二者的測序結(jié)果在相似度上為100%。因此，本實施例所得到的結(jié)果為可信結(jié)果。應(yīng)當說明的是，以本發(fā)明所記載的技術(shù)方案進行核酸序列檢測，理論上應(yīng)當可以將待測核酸片段所有的核苷酸序列信息讀取出來。但根據(jù)所述實施例中得到的數(shù)據(jù)，本實施例中得到的高質(zhì)量讀長至少為300bp，而且隨著讀長的増加，其讀取準確率呈現(xiàn)逐步下降的趨勢，其原因可能是由于在不斷循環(huán)的酶切與連接操作中，內(nèi)切酶的酶切能力以及連接酶的連接能力有所下降而導(dǎo)致。因此，若對于內(nèi)切酶的酶切能力以及連接酶的連接能力進行加強，利用本發(fā)明所記載的技術(shù)方案檢測核酸序列的話，可以達到更長的讀長。其次，上述實施例僅是本發(fā)明所記載技術(shù)方案的ー個具體實施方案，針對不同待測樣品中的ー種或多種基因序列，利用相應(yīng)的擴增引物，通過上述實施例相同的操作和步驟進行檢測，同樣可以得到類似的結(jié)果。此外，測序過程以及熒光信號圖像數(shù)據(jù)的處理分析所采用的測序平臺還可以是深圳華因康基因科技有限公司生產(chǎn)的Pstar- II e> Pstar- II。本發(fā)明所述待測樣品的來源可以多種多祥，其來源包括但不限于血液、口腔上皮刮取樣、唾液、石蠟包埋組織和穿刺組織等。在檢測過程中，利用本發(fā)明所記載的技術(shù)方案檢測基因序列時，檢測的基因的種類和數(shù)目不受限制，可以任意組合。上述具體實施例只是對MCM6和MTHFR基因中的某一特定片段進行了檢測，若需要對這兩個基因的其他區(qū)域或其他基因的某些區(qū)域進行檢測，只需設(shè)計相應(yīng)的特異性擴增引物即可，相應(yīng)的特異性擴增引物對包括但不限于如下所述。所述ABCBl的引物為SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2 ;所述ADH2的引物為SEQ IDNO: 3 和 SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO: 8 中的至少一対；所述 ADH3 的引物為 SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 中的至少一対；所述 ALDH2 的引物為 SEQ ID NO: 15 和 SEQID NO:16、SEQ ID NO:17 和 SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19 和 SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO: 22中的至少一対；所述APOB的引物為SEQ ID N0:23和SEQ ID NO: 24 ;所述APOE 的引物為 SEQ ID NO: 25 和 SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27 和 SEQ ID NO: 28 中的至少ー對；所述CAT的引物為SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 30 ;所述CYBA的引物為SEQ ID NO: 31和 SEQ ID NO:32 ;所述 CYPlAl 的引物為 SEQ ID N0:33 和 SEQ ID NO:34 ;所述 CYP2E1 的引物為 SEQ ID NO: 35 和 SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37 和 SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39 和SEQ ID NO: 40, SEQ ID N0:41 和 SEQ ID NO: 42 中的至少一対；所述 ERCC2 的引物為 SEQ IDN0:43 和 SEQ ID NO: 44、SEQ ID N0:45 和 SEQ ID NO: 46 中的至少一対；所述 LCT 的引物為 SEQ ID NO:47 和 SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49 和 SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51 和 SEQID NO: 52 中的至少一対；所述 LPL 的引物為 SEQ ID N0:53 和 SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55和 SEQ ID N0:56 中的至少一対；所述 MClR 的引物為 SEQ ID N0:57 和 SEQ ID NO :58, SEQID N0:59和SEQ ID NO: 60中的至少一対；所述MCM6的引物為SEQ ID N0:61和SEQ IDNO: 62 ;所述MTHFR 的引物為 SEQ ID N0:63 和 SEQ ID NO:64,SEQ ID N0:65 和 SEQ ID NO:66中的至少ー對；所述MTR的引物為SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68 ;所述MTRR的引物為SEQ ID N0:69 和 SEQ ID NO:70 ;所述N0S3 的引物為 SEQ ID N0:71 和 SEQ ID NO:72 ;所述0CA2 的引物為 SEQ ID NO: 73 和 SEQ ID NO: 74 ;所述 PARPl 的引物為 SEQ ID NO: 75 和 SEQID NO:76 ;所述PONl 的引物為 SEQ ID N0:77 和 SEQ ID NO:78 ;所述 S0D3 的引物為 SEQ IDN0:79 和 SEQ ID NO:80 ;所述 TYRPl 的引物為 SEQ ID N0:81 和 SEQ ID N0:82;所述 VDR 的引物為 SEQ ID N0:83 和 SEQ ID NO:84, SEQ ID N0:85 和 SEQ ID NO:86, SEQ ID N0:87 和SEQ ID NO: 88, SEQ ID N0:89 和 SEQ ID NO: 90 中的至少一対；所述 XRCCl 的引物為 SEQ IDNO:91 和 SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93 和 SEQ ID NO:94 中的至少一対。所述 CYP1A2 的引物包括 SEQ ID NO: 107 和 SEQ ID NO: 108,SEQ ID NO: 109 和 SEQID NO: 110，以及SEQ ID NO: 111和SEQ ID NO: 112中的至少一対；所述CYP3A4的引物包括 SEQ ID NO:113 和 SEQ ID NO:114,SEQ ID NO:115 和 SEQ ID NO:116,SEQ ID NO:117 和SEQ ID NO: 118,SEQ ID NO: 119 和 SEQ ID NO: 120,SEQ ID NO: 121 和 SEQ ID NO: 122 以及SEQ ID NO: 123 和 SEQ ID NO: 124 中的至少一対；所述 CYP3A5 的引物包括 SEQ ID NO: 125和 SEQ ID NO: 126 以及 SEQ ID NO: 127 和 SEQ ID NO: 128 中的至少一対；所述 CYP2C9 的引物包括 SEQ ID NO: 129 和 SEQ ID NO: 130 以及 SEQ ID NO: 131 和 SEQ ID NO: 132 中的至少一対；所述 CYP2C19 的引物包括 SEQ ID NO: 133 和 SEQ ID NO: 134 以及 SEQ ID NO: 135 和SEQ ID NO: 136 中的至少一対；所述 CYP2D6 的引物包括 SEQ ID N0:137 和 SEQ ID NO: 138,SEQ ID NO: 139 和 SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141 和 SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143 和SEQ ID NO: 144,SEQ ID NO: 145 和 SEQ ID NO: 146,SEQ ID NO: 147 和 SEQ ID NO: 148 以及SEQ ID NO: 149和SEQ ID NO: 150中的至少一対；所述ABCBl的引物包括SEQ ID NO: 151和SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153 和 SEQ ID NO: 154 以及 SEQ ID NO: 155 和 SEQ ID NO: 156中的至少ー對；所述ADRBl的引物為SEQ ID NO: 157和SEQ ID NO: 158 ;所述ADRB2的引物為 SEQ ID NO: 159 和 SEQ ID NO: 160 ;所述 CACNA1C 的引物包括 SEQ ID NO: 161 和 SEQ IDNO: 162、SEQ ID NO: 163 和 SEQ ID NO: 164 以及 SEQ ID NO: 165 和 SEQ ID NO: 166 中的至少ー對；所述NPPA的引物為SEQ ID NO: 167和SEQ ID NO: 168 ;所述OPRMl的引物為SEQ IDNO: 169 和 SEQ ID NO: 170 ;所述 VKORCl 的引物為 SEQ ID NO: 171 和 SEQ ID NO: 172。對乳腺癌易感基因中的MTHFR、FGFR2基因和IL_1 ^基因進行檢測，其特異性擴增引物序列分別為 SEQ ID NO: 173 和 SEQ ID NO: 174,SEQ ID NO: 175 和 SEQ ID NO: 176,SEQID NO:177 和 SEQ ID NO:178。對肺癌易感基因中的XRCCI、APEI、CASP7、CASP8、 CASP9、CHEK2、C0X-2 和 CYPlAl基因進行擴增及檢測，對應(yīng)的特異性擴增引物為SEQ ID NO: 179和SEQ ID NO: 180,SEQ IDNO: 181 和 SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183 和 SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185 和 SEQ IDNO: 186,SEQ ID NO: 187和SEQ ID NO: 188,SEQ ID NO: 189和SEQ ID NO: 190,SEQ ID NO: 191和 SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193 和 SEQ ID NO:194。對結(jié)直腸癌易感基因中的MMP2、SMAD7、ADH2、ALDH2、CYPIA2基因進行檢測，相應(yīng)的特異性擴增引物為 SEQ ID NO: 195 和 SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197 和 SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199 和 SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201 和 SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203 和SEQ ID NO:204。對帕金森綜合癥易感基因中的SNCA、LRRK2、PINKl、UCH-Ll和Parkin基因進行檢測，相應(yīng)的特異性擴增引物為SEQ ID N0:205和SEQ ID NO:206,SEQ ID N0:207和SEQ IDNO:208,SEQ ID N0:209和SEQ ID NO:210,SEQ ID N0211 和SEQ ID N0:212、SEQ ID N0:213和 SEQ ID NO:214。應(yīng)當說明的是，本發(fā)明典型的應(yīng)用但不限于營養(yǎng)指導(dǎo)基因、常規(guī)藥物相關(guān)基因、易感基因的檢測，在其他類似的基因檢測中也可以應(yīng)用本發(fā)明所闡述的方法。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種增加測序讀長的測序方法，其特征在于，包括以下步驟 A.將第一錨定引物結(jié)合于待測核酸片段上的第一接頭上； B.在第一錨定引物延伸末端分別連接帶不同位置標記的熒光探針，并檢測相應(yīng)連接產(chǎn)物的熒光信號，得到第一錨定引物延伸末端后M個核苷酸的序列信息； C.利用內(nèi)切酶將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到帶有含有待測序片段的酶切產(chǎn)物； D.酶切產(chǎn)物連接第二接頭得到新待測核酸片段，將第二錨定引物結(jié)合于新待測核酸片段的第二接頭上； E.在第二錨定引物延伸末端分別連接帶不同位置標記的熒光探針，并檢測相應(yīng)連接產(chǎn)物的熒光信號，得到第二錨定引物延伸末端后N個核苷酸的序列信息； F.更換內(nèi)切酶、接頭、錨定引物和熒光探針，對前一步驟的產(chǎn)物進行酶切、接頭連接、錨定引物結(jié)合、熒光探針連接和熒光信號檢測； G.重復(fù)步驟F，直至得到待測核酸片段中所需的核苷酸序列信息； 其中，M、N均為正整數(shù)；所述待測核酸片段含有營養(yǎng)指導(dǎo)基因序列、常規(guī)藥物相關(guān)基因序列或易感基因序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，步驟A中所述待測核酸片段固定于固相載體表面。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，在步驟A之前還包括步驟 AO.利用固相載體對源核酸進行擴增，得到固定于固相載體表面的待測核酸片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，所述步驟AO包括以下步驟 A01.將用于擴增的源核酸固定于固相載體表面，得到表面帶有含有至少一個核酸片段的固相載體； A02.將引物結(jié)合于固相載體表面上的引物結(jié)合位點，得到固定有引物的擴增載體； A03.對擴增載體上的源核酸進行擴增，得到固定于固相載體表面的待測核酸片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，步驟A02中所述引物包括用于對所述源核酸進行擴增的上游引物和/或下游引物，所述上游引物是與源核酸5’端互補結(jié)合的核酸序列，所述下游引物是與源核酸3’端序列相同的核酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，步驟A03中所述的擴增是單分子擴增。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，所述步驟A02中引物結(jié)合于固相載體表面的方式為 引物與固相載體表面攜帶的基團進行配對連接，實現(xiàn)直接結(jié)合； 或通過連接子攜帶的基團分別與引物和固相載體表面攜帶的基團進行配對連接，實現(xiàn)間接結(jié)合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，所述配對連接的方式采用生物素-親和素/鏈霉親和素、納米金/碘乙酰-巰基、氨基-醛基/羧基/異硫氰基、丙烯酰胺-硅烷基/聚丙烯酰胺中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，步驟A中所述第一錨定引物帶有含有至少一個酶切識別位點。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，所述步驟C包括以下步驟 Cl.將步驟B中連接的熒光探針與第一錨定引物洗脫，重置第一錨定引物并進行鏈延伸，與待測核酸片段形成雙鏈核酸分子； C2.內(nèi)切酶通過識別第一錨定引物上所帶的酶切識別位點并進行酶切，將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到含有待測序片段的酶切產(chǎn)物。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，步驟C包括以下步驟 Cl’.在第一錨定引物的另一端連接雙鏈的接頭三，該接頭三帶有含有至少一個酶切識別位點； C2’.利用內(nèi)切酶識別接頭三所帶的酶切識別位點，將步驟B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到含有待測序片段的酶切產(chǎn)物。
12.根據(jù)權(quán)利要求I至11中任一項所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，所述第一錨定引物帶有含有至少一個特異性殘基和/或一端是封閉的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，所述步驟B包括以下步驟 BI.在帶有含有特異性殘基的第一錨定引物延伸末端連接帶特定位置標記的熒光探針，檢測相應(yīng)連接產(chǎn)物的熒光信號，得到對應(yīng)位置的核苷酸序列信息； B2.以特異性切割劑切割特異性殘基，將前一步驟中連接的熒光探針及第一錨定引物洗脫，重置第一錨定引物； B3.在第一錨定引物延伸末端重復(fù)帶特定位置標記的熒光探針的連接和相應(yīng)熒光信號檢測的操作，得到第一錨定引物延伸末端后M個核苷酸的序列信息。
14.根據(jù)權(quán)利要求I至11中任一項所述的增加測序讀長的測序方法，其特征在于，所述營養(yǎng)指導(dǎo)基因包括抗自由基清除基因、嗜酒基因、抗吸煙損傷基因、解毒能力基因、DNA修復(fù)基因、葉酸及維生素B吸收能力基因、維生素D吸收能力基因、膽固醇代謝能力基因、低密度脂蛋白代謝能力基因、鈣及磷吸收能力基因、黑色素沉積與代謝基因和牛奶消化與吸收基因中的至少一個；所述常規(guī)藥物相關(guān)基因包括CYP1A2、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、ABCB1、ADRB1、ADRB2、CACNA1C、NPPA、0PRM1 和 VKORCl 的至少一個；所述易感基因包括腫瘤易感基因、心血管易感基因、代謝系統(tǒng)易感基因和免疫系統(tǒng)易感基因中的至少一個。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，提供了一種增加測序讀長的測序方法。本發(fā)明所述增加測序讀長的測序方法，首先將第一錨定引物結(jié)合于待測核酸片段的第一接頭上，使用連接測序法讀取第一錨定引物延伸末端后的M個核苷酸的序列信息；利用內(nèi)切酶識別相應(yīng)的酶切識別位點將已讀取序列信息的核苷酸部分或完全切除，在酶切回收的待測序片段上連接新的第二接頭，然后在第二接頭上錨定結(jié)合第二錨定引物，并在第二錨定引物延伸末端連接新的熒光探針，向前延伸讀取核苷酸序列信息；通過循環(huán)上述操作，得到待測核酸片段所需的核苷酸序列信息，從而利用酶切延伸測序的方法增加了測序讀長。
文檔編號G01N21/64GK102766689SQ20121023267
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者盛司潼 申請人:盛司潼