專利名稱：鑒別純化后的胸腺肽α1是否含有缺失肽的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及胸腺肽a I的質(zhì)量檢測方法，尤其涉及一種鑒別純化后的胸腺肽a I是否含有缺失肽的方法，屬于胸腺肽a I的固相合成和檢測領域。
背景技術：
胸腺肽a I是從胸腺素組分5 (TF-5)中分離出的一種活性多肽，由28個氨基酸殘基組成，分子量為3108.37。在TF-5中，胸腺肽a I的含量為0.6%，是人體胸腺激素的重要活性組分。例如胸腺肽a I可調(diào)節(jié)T淋巴細胞發(fā)育、分化和成熟。此外，胸腺肽a I能修復受損的T淋巴細胞。雖然從TF-5中分離的胸腺肽a I無明顯毒副反應，但由人工固相合成的市售胸腺肽a I可因不純而造成不良反應。目前，人工固相合成胸腺肽aI的操作規(guī)程于篇律，幾乎沒有優(yōu)化空間。市售的保護氨基酸和相關試劑的純度也足以支持人工固相合成高純度胸腺肽a I。在操作規(guī)程不出差錯的前提下，人工固相合成的胸腺肽a I是否純，取決于它含的缺失肽的狀況。與小分子藥物不同，多肽的生物活性非常強。在人工固相合成的胸腺肽a I中，SP使存在微量的缺失肽也可造成嚴重的毒副作用?？刂迫斯す滔嗪铣傻男叵匐腶 I的質(zhì)量的關鍵是控制缺失肽。目前國內(nèi)外即沒有披露人工固相合成的胸腺肽a I中的缺失肽狀況，也沒有公開測定人工固相合成的胸腺肽a I中的缺失肽的方法。這種狀態(tài)不適應胸腺肽a I的臨床地位。為了改善這種狀況，保障胸腺肽a I的臨床用藥安全性，形成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供種能夠準確、靈敏的檢測鑒別純化后的胸腺肽a I是否含有缺失肽的方法；本發(fā)明的另一個目的是提供純化后的胸腺肽a I的缺失肽譜并將該缺失肽譜作為胸腺肽a I固相合成中的質(zhì)量控制物。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:一種鑒別胸腺肽a I純品是否含有缺失肽的方法，包括以下步驟:(1)將固相合成的胸腺肽a I進行純化；(2)將純化后的胸腺肽a I純品采用LC/MS聯(lián)用儀進行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在20.78min時出現(xiàn)峰面積為0.36%的峰或在
27.19min時出現(xiàn)峰面積分別為0.47%的峰，則說明純化后的胸腺肽a I中含有缺失肽。其中，所述缺失肽的氨基酸序列為SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示。本發(fā)明中所述的胸腺肽a I純品可以是采用本領域的常規(guī)純化方法進行純化后所得到的純品；作為參考，本發(fā)明中所述的胸腺肽a I純品可以采用以下所述的方法進行兩次純化，其中，第一次純化胸腺肽a I的方法優(yōu)選為:采用配備Waters 2487檢測器、Waters 600泵和迪馬C 18制備柱的制備型HPLC進行純化；紫外檢測波長為215nm，用A和 B 梯度洗脫，流速為 10ml/min,梯度為 0_5min，10 % A/90 % B ；5-10min, 15 % A/85 % B ；10-20min 18% A/82% B ；20-70min 25% A/75% B ;其中 A 為含 0.09% TFA 的乙腈，B 為含0.1% TFA 的水。所述的第二次純化胸腺肽α I的方法優(yōu)選為:采用配備Waters 2487檢測器、Waters 600泵和迪馬C18制備柱的制備型HPLC進行純化；紫外檢測波長為215nm，用乙腈/醋酸/水梯度洗脫，流速為10ml/min，梯度為0_5min，10 %乙腈/I %醋酸/90 %水；5-10min,由10 %乙腈/I %醋酸/90 %水變至15 %乙腈/I %醋酸/85 %水；10_20min，由15%乙腈/I %醋酸/85%水變至18%乙腈/I %醋酸/82%水；20_70min，由18%乙腈/I %醋酸/82%水變至25%乙腈/1%醋酸/75%水。其中，所述純化方法中的迪馬C 18制備柱的規(guī)格優(yōu)選為10μπι、250Χ21.2mm。步驟(2)中所述的梯度洗脫條件優(yōu)選為:用0.1 %甲酸/乙腈進行梯度洗脫，流速為0.4ml/min ;梯度為:0_30min,由0.1 %甲酸/乙腈=90/10變至0.1 %甲酸/乙腈=80/20 ；30-35min,由 0.1 % 甲酸 / 乙腈=80/20 變至 0.1 % 甲酸 / 乙腈=75/25。本發(fā)明方法中LC/MS聯(lián)用儀中的LC采用Agilent 1200自動進樣,Waters XterraRP 18分析柱的規(guī)格為5μπι，3.0X 150mm ;LC/MS聯(lián)用儀中的MS采用Bruker SolatixFT-1CR-MS，離子流檢測器。本發(fā)明進一步提供了胸腺肽α I純品的缺失肽譜，其氨基酸序列為SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示；可將所述的缺失肽作為胸腺肽α I固相合成中的質(zhì)量控制物。本發(fā)明方法可以準確、靈敏的鑒別出胸腺肽α I純品是否含有缺失肽，可以有效地保障和控制胸腺肽α I的質(zhì)量，在制備高純度固相合成胸腺肽α I中有重要應用價值。


圖1胸腺肽α I純品的離子流.
圖2胸腺肽α I純品的質(zhì)譜.
圖3胸腺肽α I純品中的缺失肽

Ac-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1 Ie-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(SEQ ID N0.1)的質(zhì)譜。 圖4胸腺肽α I純品中的缺失肽Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1le-Thr-Thr-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(SEQ ID N0.2)的質(zhì)譜。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1固相合成胸腺肽α I1.制備 Fmoc-Asn (Trt)-Wang Resin稱取IOg (3.lmmol) Wang Resin置于固相反應合成柱中。加入60ml DCM溶脹樹脂lOmin，抽走DCM。用DMF洗樹脂三次，每次50ml，吹氣兩分鐘，抽走溶劑。于磨口三角瓶中稱取 5.5g(9.3mmoI)Fmoc-Asn(Trt)和 1.38g(10.23mmol)HOBt，加入 50ml DMF 溶解。在冰水浴中冷卻下加2.15ml (13.95mmol)DIC活化5min。將活化后的氨基酸加入用DMF洗好的樹脂中，然后加入0.23g(l.86mmol)DMP，用氮氣吹氣進行攪拌，室溫反應2_4h。反應結束后用DMF洗樹脂三次，每次50ml，吹氣兩分鐘，抽干溶劑。取少量樹脂，用甲醇收縮三次，真空干燥至恒重，測替代值，如替代值達到預期，將樹脂用乙酸酐封閉未反應的羥基，封閉反應2-4h后，用DMF洗樹脂三次，每次50ml，吹氣兩分鐘，抽走溶劑。用甲醇收縮樹脂三次，每次50ml，吹氣5min，抽走溶劑，真空干燥至恒重，測替代值。如替代值達到預期。2.Fmoc-Asn (Trt) -Wang Resin 的溶脹和脫 Fmoc上面得到的Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin并置于固相反應合成柱中，加60ml DCM溶脹lOmin，然后抽走DCM。用DMF洗滌樹脂，每次用50mlDMF，每次洗2min，共洗三次。用濃度為20 %的piperidine的DMF溶液脫Fmoc，共脫兩次，每次50ml，一次脫3min，另一次脫8min。然后用DMF洗滌樹脂，每次用50ml DMF洗2min，共洗四次。最后用DCM洗搽Asn (Trt)-Wang Resin，每次洗2min，共洗兩次。抽走溶劑。樹脂對茚三酮顯黃色。3.制備 Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin稱取2.12g(4.98mmol) Fmoc-Glu (OtBu)和 0.74g(5.5mmol)H0Bt 于干燥磨口三角瓶中，用50ml DMF溶解，溶液置冰浴冷卻。加1.15ml (7.47mmol)DIC活化5min。然后將活化后的氨基酸加到上面得到的Asn(Trt)-Wang Resin中反應2h。抽走反應液。用DMF洗滌樹脂，每次用50ml DMF，每次洗2min，共洗三次。樹脂對茚三酮不顯色。用濃度為20%的piperidine的DMF溶液脫Fmoc，共脫兩次，每次50ml，第一次脫3min，第二次脫8min。然后用DMF洗滌樹脂，每次用50ml DMF洗2min，共洗四次。最后用DCM洗滌樹脂，每次洗2min，共洗兩次。抽走溶劑。樹脂對茚三酮顯黃色。4.制備Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser (tBu)-GIu-(OtBu)-1le-Thr(tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys(Boc)-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin按照制備Glu (OtBu) -Asn (Trt) -Wang Resin 的方法依次將 1.55g (4.98mmol)Fmoc-Ala，2.12g(4.98mmol)Fmoc-GIu (OtBu)，2.12g (4.98mmol)Fmoc-GIu (OtBu)，
2.53g (7.47mmoI)Fmoc-Val,2.53g (7.47mmoI)Fmoc-Val,3.17g (7.47mmoI)Fmoc-Glu (OtBu)，3.50g (7.47mmoI)Fmoc-Lys (Boc)，4.67g (9.96mmol)Fmoc-Lys (Boc)，4.23g (9.96mmol) Fmoc-Glu (OtBu)，4.67g (9.96mmol) Fmoc-Lys (Boc)，3.52g (9.96mmol)Fmoc-Leu，4.09g(9.96mmoI) Fmoc-Asp(OtBu)，4.67g (9.96mmol)Fmoc-Lys (Boc)，
3.96g (9.96mmol) Fmoc-Thr (tBu)，3.96g (9.96mmol) Fmoc-Thr (tBu)，3.52g (9.96mmol)Fmoc-1le，3.17g(7.47mmol)Fmoc-GIu(OtBu)，2.86g(7.47mmol)Fmoc-Ser (tBu)，
2.86g (7.47mmol) Fmoc-Ser (tBu)，2.97g (7.47mmol) Fmoc-Thr (tBu)，3.07g (7.47mmol)Fmoc-Asp (OtBu),2.53g (7.47mmol)Fmoc_Val，2.32g (7.47mmoI)Fmoc-Ala，
3.1Og(9.96mmol) Fmoc-Ala，4.09g(9.96mmol)Fmoc-Asp (OtBu)和 3.8Ig(9.96mmol)Fmoc-Ser (tBu)偶聯(lián)到 Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin 上并脫 Fmoc。5.制備Ac-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr (tBu)-Ser (tBu)-Ser (tBu)-Glu-(OtBu)-1le-Thr (tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin0°C下將1.18ml (12.45mmol)乙酸酐于干燥磨口三角瓶中與50mlDMF混合，然后加
0.44ml (2.49mmol) DIPEA 活化 5min。將活化后的乙酸酐與 Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser (tBu)-Glu (OtBu)-1le-Thr (tBu)-Thr(tBu)-Lys-(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Va
1-Val-Glu- (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asn (Trt) -Wang Resin 反應 2h。抽走反應液。樹脂用DMF洗滌4次，每次50ml DMF,每次洗2min。樹脂用DCM洗滌2次，每次用50mlDCM，每次洗3min。抽走溶劑。樹脂對茚三酮不顯色。樹脂用MeOH收縮3次，每次用50mlMeOH，每次收縮5min，抽干。得18.5g干燥肽樹脂。低溫保存。6.從Ac-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr (tBu)-Ser (tBu)-Ser (tBu)-Glu-(OtBu)-1le-Thr (tBu)-Thr (tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin切害胸腺肽α I0°C下將18.5g干燥的肽樹脂與180ml裂解液(TFA/TIS/H20)反應0.5h，室溫反應2.5h。反應結束后，用砂芯漏斗過濾分離樹脂。樹脂用少量TFA洗滌三次。合并的濾液用0°C的1800ml的乙醚沉淀出胸腺肽α I粗品。離心分離出胸腺肽α I粗品。胸腺肽α I粗品用0°C的乙醚洗滌粗肽三次，用N2吹走殘余乙醚，置于真空干燥器干燥至恒重，得6.27g胸腺肽α I粗品，收率為81%，含量為68 %。實施例2固相合成胸腺肽α I的純化1.固相合成胸腺肽α I的一次純化Waters 2487 檢測器，Waters 600 泵，迪馬 C 18 制備柱(10 μ m，250X21.2mm)，紫外檢測器，波長215nm，TFA/乙腈/水梯度洗脫，洗脫梯度列入表I。表I胸腺肽α I粗品一次純化的洗脫梯度
權利要求
1.一種鑒別純化后的胸腺肽α I是否含有缺失肽的方法，包括以下步驟:(1)將固相合成的胸腺肽α I進行純化；(2)將純化后的胸腺肽α I純品采用LC/MS聯(lián)用儀進行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在20.78min時出現(xiàn)峰面積為0.36%的峰或在27.19min時出現(xiàn)峰面積分別為0.47%的峰，則說明純化后的胸腺肽α I中含有缺失肽。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述缺失肽的氨基酸序列為SEQID N0.1或 SEQ ID N0.2 所示。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:(I)將固相合成的胸腺肽αI進行第一次純化和第二次純化。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一次純化胸腺肽αI的方法包括:采用配備Waters 2487檢測器、Waters 600泵和迪馬C18制備柱的制備型HPLC進行純化；紫外檢測波長為215nm，用A和B梯度洗脫，流速為10ml/min，梯度為0_5min，10%A/90% B ；5-10min, 15% A/85% B ；10-20min 18% A/82% B ；20-70min 25% A/75% B ;其中A為含0.09% TFA的乙腈，B為含0.1% TFA的水。
5.按照權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的第二次純化胸腺肽αI的方法包括:采用配備Waters 2487檢測器、Waters 600泵和迪馬C18制備柱的制備型HPLC進行純化；紫外檢測波長為215nm,用乙腈/醋酸/水梯度洗脫，流速為10ml/min,梯度為0_5min,10%乙腈/I %醋酸/90%水；5-10min，由10%乙腈/I %醋酸/90%水變至15%乙腈/I %醋酸/85%水；10-20min，由15%乙腈/I %醋酸/85%水變至18%乙腈/I %醋酸/82%水；20-70min,由18%乙腈/I %醋酸/82%水變至25%乙腈/I %醋酸/75%水。
6.按照權利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述迪馬C18制備柱的規(guī)格為10μ m、250 X 21.2mm。
7.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的梯度洗脫條件為用0.1%甲酸/乙腈進行梯度洗脫，流速為0.4ml/min ;梯度為:0-30min,由0.1 %甲酸/乙腈=90/10變至0.1 %甲酸/乙腈=80/20 ；30-35min,由0.1 %甲酸/乙腈=80/20變至0.1 %甲酸/乙腈=75/25。
8.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，LC/MS聯(lián)用儀中的LC采用Agilent1200自動進樣，Waters Xterra RP18分析柱的規(guī)格為5 μ m，3.0 X 150mm ;LC/MS聯(lián)用儀中的MS采用Bruker Solatix FT-1CR-MS,離子流檢測器。
9.SEQ ID N0.1所示的寡肽作為胸腺肽α I固相合成中的質(zhì)量控制物中的應用。
10.SEQ ID N0.2所示的寡肽作為胸腺肽α I固相合成中的質(zhì)量控制物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別純化后的胸腺肽α1是否含有缺失肽的方法，包括以下步驟(1)將固相合成的胸腺肽α1進行第一次純化和第二次純化；(2)將兩次純化后的胸腺肽α1純品采用LC/MS聯(lián)用儀進行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在20.78min時出現(xiàn)峰面積為0.36％的峰或在27.19min時出現(xiàn)峰面積分別為0.47％的峰，則說明純化后的胸腺肽α1中含有缺失肽。本發(fā)明方法可以準確、靈敏的鑒別出胸腺肽α1純品是否含有缺失肽，可以有效地保障和控制胸腺肽α1的質(zhì)量，在制備高純度固相合成胸腺肽α1中有重要應用價值。
文檔編號G01N30/02GK103163236SQ20121023953
公開日2013年6月19日 申請日期2012年7月12日 優(yōu)先權日2012年7月12日
發(fā)明者朱正兵, 彭濤, 王玲, 張金花 申請人:海南合瑞制藥股份有限公司