一種快速測定植物多糖及糖甙的化學發(fā)光分析法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速測定植物多糖及糖甙的化學發(fā)光分析法，該方法利用苯酚-硫酸法中Molish試劑的苯酚可與H2O2和多糖或糖甙水解產(chǎn)生的單糖與濃硫酸縮合成的糠醛發(fā)生氧化還原反應，采用Luminol-H2O2-Co(II)化學發(fā)光體系間接測定了菊科植物鹿草和甜葉菊及豆科植物鷹嘴豆中多糖及糖甙的含量。根據(jù)測得的葡萄糖液標準曲線的回歸方程：A＝86.37·C+6.43(A為發(fā)光強度，C為標準液濃度，回歸系數(shù)γ＝.9651)將濃度換算成相當于植物原料的多糖或糖甙重量百分含量：結(jié)果為：鹿草多糖，根4.23％，花4.03％，莖1.86％，葉0.62％；甜葉菊總糖甙：守田3號11.28％，雜交姜滬1號8.87％；新疆鷹嘴豆多糖：7.12％。該方法可快速測定、線性好、誤差小、穩(wěn)定可控。
【專利說明】一種快速測定植物多糖及糖甙的化學發(fā)光分析法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分析化學領(lǐng)域，具體涉及一種快速測定菊科植物鹿草和甜葉菊及豆科植物鷹嘴豆中多糖及糖甙的化學發(fā)光分析法。
【背景技術(shù)】
[0002]化學發(fā)光分析法是在一些特殊的化學反應中，反應中間體或反應產(chǎn)物所釋放出的化學能處于激發(fā)態(tài)(excited state),然后由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)(ground state)時所產(chǎn)生的一種光輻射，根據(jù)化學發(fā)光反應在某一時刻的發(fā)光強度來確定試樣中待測組分含量的方法。該方法已用于分析測定許多化學物質(zhì)，但尚沒有應用于植物多糖及糖甙的測定。
[0003]鹿草{Rhaponticumcarthamoides (Willd.) Ii jin.}獨產(chǎn)于我國新疆阿勒泰地區(qū)，為菊科管狀花亞科漏蘆屬植物，具有抗粥樣動脈硬化、滋補強壯等多種功效，被譽為“新疆人參”，在新疆民間長期入藥，具補氣健腦功效，主治神經(jīng)衰弱、食欲不振[新疆生物土壤研究所，《新疆中草藥》，新疆人民出版社，烏魯木齊，251，1975]。我們測定發(fā)現(xiàn)其含豐富的人體必須氨基酸、多糖、微量元素等物質(zhì)，進一步研究表明鹿草多糖具有提高機體免疫功能、提高性機能、增加耐力和抗貧血等強壯和適應原樣作用[李迪明等，中藥藥理與臨床，2000,16(1):17-181。目前文獻中報道的多糖測定方法主要是苯酚-硫酸法，鹿草多糖的測定尚未見有報道。
[0004]甜葉菊是菊科多年生草本植物，原產(chǎn)于南美的巴拉圭和巴西，近年來在新疆廣為引種。甜葉菊葉子含甜菊式(Sievioside)、甜菊雙糖式(Steviolbioside)和甜菊三糖式或四糖式(Rebaudisides A、B、C,、D,、E, F及杜爾可式)等豐富的甜葉菊糖式,提純的甜葉菊糖甙甜度是白糖的300-400倍，而熱量只有白糖1/300，是高甜度、低熱值的天然健康甜味齊U，現(xiàn)已在食品、醫(yī)藥、保健等行業(yè)中廣泛應用，為糖尿病及高血壓患者帶來福因。甜葉菊糖甙常見的測定方法有質(zhì)量法、堿容量法及蒽酮比色法，這些方法有的干擾多、誤差大，有的操作繁雜、耗時長[孫傳范等，食品科學2010，31 (9):338-340]。
[0005]鷹嘴豆(CicerarietiumL)為豆科草本植物，起源于西亞和近東地區(qū)。在我國新疆有大面積栽培，其在維吾爾醫(yī)藥中的應用已有2500年的歷史，具有廣泛的藥用價值，可做利尿劑、摧奶劑、可治療失眠，預防皮膚病和防治膽病等，也是中西亞及南亞地區(qū)人們喜愛的營養(yǎng)食品[古麗克孜等，光譜實驗室，2000，17 (4):411-413]。我們研究發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆多糖具有降血糖作用，測定其含量是鷹嘴豆糖尿病治療劑質(zhì)量控制的重要依據(jù)。
[0006]本發(fā)明為完善植物多糖及糖甙的測定方法，采用快速化學發(fā)光分析法嘗試上述三種植物中多糖及糖甙的含量測定，結(jié)果表明該方法可靠準確，可用于從上述在新疆有獨特植物資源的鹿草、甜葉菊和鷹嘴豆中開發(fā)天然藥物的標準化研究，促進其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]發(fā)明目的:提供一種快速測定植物多糖及糖甙的化學發(fā)光分析法，用于菊科植物鹿草和甜葉菊及豆科植物鷹嘴豆中多糖及糖甙的含量分析。[0008]文獻中報道植物多糖及糖甙的方法主要是苯酚-硫酸法——Molish反應，其中Molish試劑中的酚類物質(zhì)，可以與雙氧水(H2O2)發(fā)生氧化還原反應，本發(fā)明根據(jù)該原理，利用Luminol-H2O2-C0(II)化學發(fā)光體系間接測定了鹿草和鷹嘴豆中的多糖含量以及甜葉菊糖甙的含量，測定結(jié)果與苯酚-硫酸法作對照表明該方法具有快速、線性好、誤差小、穩(wěn)定可控。
[0009]本發(fā)明采用的Luminol-H2O2-C0 (II)化學發(fā)光體系間接測定，其工作原理是:根據(jù)Molish反應，多糖或糖甙中的葡萄糖在濃硫酸的催化作用下脫去三分子水后生成的糠醛和所加苯酚發(fā)生Molish作用縮合脫去一分子水后出現(xiàn)紫紅色，由此通過比色法來測定多糖的含量。
[0010]在上述反應中，苯酚可與H2O2發(fā)生氧化還原作用，而H2O2在所用的Luminol-H2O2-Co(II)發(fā)光體系中也是氧化劑，在堿性溶液中在Co (II)催化下可氧化Luminol并產(chǎn)生化學發(fā)光，H2O2的量將影響發(fā)光強度的大小。因此，本發(fā)明設(shè)計在Molish反應中剩余的苯酚可先與過量H2O2反應，剩余的H2O2再和發(fā)光劑Luminol作用發(fā)光，由其強度來間接確定多糖的含量。附圖所示的反應過程可清楚地反映整個測定過程。
[0011]技術(shù)措施:
[0012]一種快速測定植物多糖及糖甙的化學發(fā)光分析法，其特征在于采用Luminol-H2O2-Co(II)化學發(fā)光體系進行間接測定，其方法如下:
[0013]用溶劑法定量提取植物粗粉中的多糖及糖甙，提取多糖時用溶劑法等除去蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，提取糖甙時用溶劑法熱提冷析法反復處理除單糖等水溶性干擾物質(zhì)；提取物用活性碳脫色重結(jié)晶法純化過濾后，濾液定容后作為試液。取小量試液分別加入一定量的本酌.及濃硫fe，水浴加熱水解完全后冷卻至室溫，稀釋后加入一定量的NaOH試液和H2O2試液，稀釋、定容。在發(fā)光分析儀的試樣管中，分別通入Luminol試液和CoCl2試液，注射管內(nèi)通入試液，打開活塞，把試液通入反應池，記錄反應的化學發(fā)光信號。根據(jù)實驗所測葡萄糖液標準曲線得到的回歸方程為:A = 86.37.C+6.43 (式中A為發(fā)光強度，C為標準溶液濃度，回歸系數(shù)Y = 0.9651)，計算試液濃度再換算成相當于植物粗粉的多糖及糖甙的重量百分含量。
[0014]上述方法不限于不限于菊科植物鹿草和甜葉菊及豆科植物鷹嘴豆，尚可用于其他富含多糖或糖甙的藥用或藥食同源的植物，如黃精、黃芪、紅景天、香菇、鎖陽、肉蓯蓉、淫羊藿、人參、蟲草、銀杏、靈芝、冬凌草、紫菀、橐吾、茵陳、黃芩、紅花、葛根、橙皮、槐花米、黑加侖、甘藍、藍莓、菊苣、萬壽菊、洋甘菊、金銀花、綠茶等。
[0015]在上述方法中，多糖及糖甙的提取溶劑與植物原料的物料比在25:1到50:1范圍內(nèi)，提取采用熱浸提或煮提，提取3-6次，每次2-3小時，浸提溫度為50°C -1OO0C，浸提3-6次；或采用超生提取等其它現(xiàn)有技術(shù)進行提取。提取多糖的溶劑可選擇50°C以上的熱水或沸水，其純化方法可選擇溶劑萃取法或Sevag透析法或熱提法、活性碳吸附法或凝膠過濾法，其中溶劑萃取法中的溶劑可以是80-90% (V/V)乙醇或甲醇、三氟三氯乙烷、氯仿-戊醇或丁醇(4: I)混合溶劑；活性炭粉用量與提取液比0.1-3: 100(V/V)，凝膠過濾法選用葡聚糖凝膠SephendexG-75至G-200的葡聚糖凝膠。提取糖式的溶劑可選擇水、5-95% (醇/水V/V)乙醇或甲醇、異丙醇、正丁醇、戊醇、丙酮等種的一種、兩種或三種，其純化方法可用可用上述溶劑反復熱溶冷析1-3次，再熱溶解定容，其中優(yōu)選的純化溶劑是水及80-95% (醇/水V/V)乙醇或甲醇。
[0016]在上述方法中，多糖及糖甙提取液的水解，苯酚及濃硫酸的用量占提取供試液的體積百分比(V/V)分別是:苯酚:30-60% (V/V)，優(yōu)選25-30%，濃硫酸:5-30 %，優(yōu)選10-20% ;提取液加入濃硫酸后應室溫放置不少于10分鐘；加熱水解的溫度40-80°C ;水解時間10-60分鐘；水解后需加入與水解所用的濃硫酸等量的NaOH試液。
[0017]在上述方法中，多糖及糖甙的提取液可配成0.1-0.5mg/ml的供試液進行測定，相應的Luminol-H2O2-Co (II)化學發(fā)光體系中所用的Luminol分析液濃度為0.8_5x 10_3mol/L,其制備方法是:取0.8-5X10_2mol/L的Luminol-NaOH儲備液用pH大于9的堿性緩沖溶液稀釋，配成pH 9-10的l-5X10_3mol/L的Luminol分析液，此溶液避光保存的時間不超過7天；該體系使用的 Co (II)可選擇 CoS04 或赤礬(CoS04.7Η20)、Co (N03)或 Co (N03) 2.6Η20、CoCO3或CoCl2及其水合物中的一種配成濃度為4-20mg/ml、pH值為1_5的酸性溶液，其中以測定中穩(wěn)定可控、干擾少及發(fā)光強度最大化為目標，優(yōu)選的是用CoCl2制備及其水合物制備成PH值1-5的CoCl2試液；該體系中的H2O2加入量與提取植物原料的體積重量比應為3:1-1: 0.5(ml/g)，優(yōu)選的用量比是:1: I。
[0018]在上述方法中，標準曲線測定采用的單糖標準品可選擇葡萄糖、鼠李糖、半乳糖及甘露糖等中的一種，鑒于植物多糖及糖甙的結(jié)構(gòu)中常見的單糖為葡萄糖，所優(yōu)選的是葡萄糖。
[0019]在上述方法中，為保證測定的重現(xiàn)性，發(fā)光分析儀中反應池的反應時間應控制在1-10秒，優(yōu)選的最佳時間是2秒；平行測定次數(shù)3-5次，每次測定間隔時間(1-10秒)保持一致；每次進樣速度及反應池溫度(20°C -30°C )也應保持一致。
[0020]用上述方法最終測得相當于植物原料的多糖或糖甙重量百分含量為:鹿草多糖，根部:4.23%，花:4.03%，莖:1.86%, Bf:0.62% ;甜葉菊總糖甙，守田3號:11.28%，雜交姜滬I號:8.87% ;新疆鷹嘴豆多糖:7.12%。
[0021]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0022]本發(fā)明所用的上述方法測定時間短、線性好、穩(wěn)定性強和重現(xiàn)性好，測得回收率在100-105%范圍內(nèi)。表明該方法可靠準確，可用于工業(yè)化生產(chǎn)中鹿草和甜葉菊的質(zhì)量控制及制定行業(yè)標準，也可用于其他植物多糖及糖甙的含量測定。
【具體實施方式】
[0023]以下通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于此實施例。
[0024]實施例1?5所用的快速測定植物糖甙及多糖的化學發(fā)光分析法，方法如下:
[0025]①儀器和試劑準備
[0026]儀器:流動注射化學發(fā)光分析儀；pHs-25型酸度計；甘汞電極(21型)，玻璃電極(213型)。
[0027]試劑:Luminol儲備液(10_2mol/L):準確稱取 0.8860g 95% Luminol 水溶后加入2g氫氧化鈉,定溶于500ml容量瓶中，放置三天后備用。
[0028]Luminol 分析液(lCT3mol/L):取 lCT2mol/L Luminol-NaOH 儲備液 50ml 加入
0.lmol/1碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液稀釋10倍，即成pH 9.8的10_3mol/l的Luminol分析液，此溶液貯于棕色容量瓶內(nèi)避光保存，濃度在一周內(nèi)保持不變。[0029]CoCl2試液:準確稱取0.4036g CoCl2.6H20溶于水，用0.lmol/L鹽酸調(diào)至pH =3，移于IL容量瓶內(nèi)，用pH 3水溶液稀釋到刻度。
[0030]②提取供試液制備:
[0031]精確鹿草干燥粉末各1.9988g，加80ml的80%乙醇回流1.5小時，真空抽濾，殘渣用80%乙醇洗滌3~4次，濾液棄去，加水100ml煮提，再分別用80、70、60、50ml水反復煮提，50ml水煮提后，吸取0.5ml作Molish檢測，如為陰性，即可；陽性再用50ml水煮三次，加1%活性碳(約3g)脫色，真空抽濾，冷卻至室溫，然后移入IL容量瓶中，濾液瓶反復洗3~4次，余液均到入容量瓶內(nèi)，加水定容、搖勻備用。
[0032]③標準曲線測定
[0033]分別移取lml、2ml、3ml、......、10ml 5.046 X 10_3mol/l 葡萄糖標準液于編號 3、4、
5、……、12的容量瓶內(nèi)，然后再分別移取2ml苯酚于上述容量瓶內(nèi)，稍加稀釋后，再在每個容量瓶中準確移入Iml濃H2SO4，放置10分鐘后，在70°C水浴中加熱15分鐘，冷卻至室溫，稀釋到50ml，搖勻后分別移取5ml各種濃度的溶液并加入另外10個與上述編號相同的容量瓶，然后移入lml NaOH和2ml 10? 1/1 H2O2試液，稀釋至刻度待測。
[0034]④回收率測定
[0035]在編號為13~17的五個50ml容量瓶內(nèi)分別加入3ml葡萄糖和3ml供試液，然后分別移取2ml苯酚于上述容量瓶中，稍加稀釋后，再準確移入lml &H2S04，放置10分鐘后，在70°C水浴中加熱15分鐘，冷卻至室溫，稀釋到50ml，再分別移取各溶液5ml加入與上述編號相同的容量瓶內(nèi)，然后移入ImlNaOH試液和2ml H2O2試液，稀釋至刻度待測。
[0036]⑤樣品測定
[0037]在50ml容量瓶內(nèi)加入3ml供試液，然后移取2ml苯酚于容量瓶中，稍加稀釋后，再準確移入Iml濃H2SO4，放置10分鐘后，在70°C水浴中加熱15分鐘，冷卻至室溫，稀釋到50ml，再分別移取各溶液5ml加入與上述編號相同的容量瓶內(nèi)，然后再移入ImlNaOH試液和2ml H2O2試液，稀釋至刻度待測。
[0038]⑥化學發(fā)光測定
[0039]在發(fā)光分析儀的試樣管1#中，分別通入10_3mol/l的Luminol試液和CoCl2試液，注射管內(nèi)通入試樣，打開活塞，把試液通入反應池，記錄反應的化學發(fā)光信號，每個樣品平行測定3次。
[0040]實施例6~7:實施例1中⑤項樣品的測定，供試液取1.5ml。
[0041]實施例8~11:實施例1中CoCl2試液，用0.lmol/L鹽酸調(diào)pH分別是:1、2、4及5。
[0042]實施例12-15:實施例1中發(fā)光分析儀中反應池的反應時間1、3、5及10秒。
[0043]實施例16-17:實施例1中樣品測定，苯酚分別取Iml及3ml，雙氧水加入量分別減至Iml及增至3ml。
[0044]實施例18~21:實施例6中CoCl2試液，用0.lmol/L鹽酸調(diào)pH分別是:1、2、4及5。
[0045]實施例22~25:實施例6中發(fā)光分析儀中反應池的反應時間1、3、5及10秒。
[0046]實施例26-27:實施例6中樣品測定，苯酚分別取Iml及3ml，雙氧水加入量分別減至Iml及增至3ml。[0047]實施例1~7與苯酚-硫酸比色法(7530分光光度計測定)的對照試驗結(jié)果見表
I和表2:
[0048]表1化學發(fā)光測定法試驗結(jié)果(相當于植物原料的重量百分含量)
[0049]
【權(quán)利要求】
1.一種快速測定植物多糖及糖甙的化學發(fā)光分析法，其特征在于采用Luminol-H2O2-Co(II)化學發(fā)光體系進行間接測定的方法主要有以下步驟: ①用溶劑法定量提取植物粗粉中的多糖及糖甙，提取多糖時用溶劑法等除去蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，提取糖甙時用溶劑法熱提冷析法反復處理除去單糖等水溶性干擾物質(zhì)；提取物用活性碳脫色重結(jié)晶法純化過濾后，濾液定容后作為試液。 ②取小量試液分別加入一定量的苯酚及濃硫酸，水浴加熱水解完全后冷卻至室溫，稀釋后加入一定量的NaOH試液和H2O2試液，稀釋、定容。 ③在發(fā)光分析儀的試樣管中，分別通入Luminol試液和CoCl2試液，注射管內(nèi)通入試液，打開活塞，把試液通入反應池，記錄反應的化學發(fā)光信號。 ④根據(jù)實驗所測葡萄糖液標準曲線得到的回歸方程為:A= 86.37 -C+6.43 (式中A為發(fā)光強度，C為標準溶液濃度，回歸系數(shù)Y = 0.9651)，計算試液濃度再換算成相當于植物粗粉的多糖及糖甙的重量百分含量。
2.如權(quán)利要求書I所述的方法，其特征在于:多糖及糖甙的提取溶劑與植物原料的物料比在25: I到50: I范圍內(nèi)，提取采用熱浸提或煮提，提取3-6次，每次2-3小時，浸提溫度為50°C -100°C，浸提3-6次；或采用超生提取等其它現(xiàn)有技術(shù)進行提取。
3.如權(quán)利要求書I所述的方法，其特征在于:提取多糖的溶劑可選擇50°C以上的熱水或沸水，其純化方法可選擇溶劑萃取法或Sevag透析法或熱提法、活性碳吸附法或凝膠過濾法，其中溶劑萃取法中的溶劑可以是80-90% (V/V)乙醇或甲醇、三氟三氯乙烷、氯仿-戊醇或丁醇(4: I)混合溶劑；活性炭粉用量與提取液比0.1-3: 100(V/V);凝膠過濾法選用葡聚糖凝膠Sephendex G_75至G-200的葡聚糖凝膠。
4.如權(quán)利要求書I所述的·方法，其特征在于:提取糖甙的溶劑可選擇水、5-95%(醇/水V/V)乙醇或甲醇、異丙醇、正丁醇、戊醇、丙酮等種的一種、兩種或三種，其純化方法可用上述溶劑反復熱溶冷析1-3次，再熱溶解定容，其中優(yōu)選的純化溶劑是水及80-95% (醇/水V/V)乙醇或甲醇。
5.如權(quán)利要求書I所述的方法，其特征在于:多糖及糖甙提取液的水解，苯酚及濃硫酸的用量占提取供試液的體積百分比(V/V)分別是:苯酚:30-60% (V/V)，優(yōu)選25-30%，濃硫酸:5-30%，優(yōu)選10-20% ;提取液加入濃硫酸后應室溫放置不少于10分鐘；加熱水解的溫度40°C -80°C ;水解時間10-60分鐘；水解后需加入與水解所用的濃硫酸等量的NaOH試液。
6.如權(quán)利要求書I所述的方法，其特征在于:多糖及糖甙的提取液可配成0.1-0.5mg/ml的供試液進行測定,相應的Luminol-H2O2-Co(II)化學發(fā)光體系中所用的Luminol分析液濃度為0.8_5xlCT3mol/L,其制備方法是:取0.8_5xlCT2mol/L的Luminol-NaOH儲備液用pH大于9的堿性緩沖溶液稀釋，配成pH 9-10的l-5X10_3mol/L的Luminol分析液，此溶液避光保存的時間不超過7天；該體系使用的Co(II)可選擇CoS04或赤礬(CoS04.7H20)、Co (N03)或Co (N03) 2 *6H20,CoCO3或CoCl2及其水合物中的一種配成濃度為4_20mg/ml、pH值為1-5的酸性溶液，其中優(yōu)選的是用CoCl2制備及其水合物制備成pH值1-5的CoCl2試液；該體系中的H2O2加入量與提取植物原料的體積重量比應為3: 1-1: 0.5(ml/g)，優(yōu)選的用量比是:I: I。
7.如權(quán)利要求書I所述的方法，其特征在于:標準曲線測定采用的單糖標準品可選擇葡萄糖、鼠李糖、半乳糖及甘露糖等中的一種，優(yōu)選的是葡萄糖。
8.如權(quán)利要求書I所述的方法，其特征在于:發(fā)光分析儀中反應池的反應時間控制在1-10秒，優(yōu)選的是2秒；平行測定次數(shù)3-5次，每次測定間隔時間保持一致，可控制在1-10秒；每次進樣速度及反應池溫度(20°C -30°C )也應保持一致。
9.如權(quán)利要求書I所述的方法，其特征在于:用該方法測得相當于植物原料的多糖或糖甙重量百分含量為:鹿草多糖，根部:4.23%，花:4.03%，莖:1.86%，葉:0.62% ;甜葉菊總糖甙，守田3號:11.28%，雜交姜滬I號:8.87% ;新疆鷹嘴豆多糖:7.12%。
10.如權(quán)利要求書I所述的方法，其特征在于:該方法不限于菊科植物鹿草和甜葉菊及豆科植物鷹嘴豆，尚可 用于其他富含多糖或糖甙的藥用或藥食同源的植物。
【文檔編號】G01N1/34GK103543144SQ201210245583
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月16日
【發(fā)明者】符波, 唐卿, 唐凱, 李新圃 申請人:符波, 唐卿, 上海復博實驗室裝備有限公司