專利名稱：一種基于脂質(zhì)聚類分析的可可粉摻假檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于指紋圖譜的可可粉摻假檢測(cè)方法，特別是一種通過構(gòu)建甘油酯指紋圖譜以判定可可粉是否摻假的方法。
背景技術(shù)：
天然可可脂(cocoa butter或cacao butter, CB)是可可豆經(jīng)壓榨法制得的具有特殊功能的油脂，盛產(chǎn)于熱帶(主要在非洲)，常溫下為乳黃色固體，外觀類似白蠟，具有芳香氣味?？煽煞劬哂袧饬曳曳嫉莫?dú)特香味，含有豐富的多酚、蛋白質(zhì)、碳水化合物、可可脂等多種營(yíng)養(yǎng)元素和活性成分，是制造巧克力的重要原料，也用于生產(chǎn)當(dāng)今世界三大嗜好性飲料之一。上個(gè)世紀(jì)90年代中期以來，隨著可可制品應(yīng)用范圍的日趨擴(kuò)大，對(duì)外貿(mào)易的拓展，我國(guó)可可加工行業(yè)發(fā)展迅猛，與此同時(shí)，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上大量劣質(zhì)或假冒可可粉充斥市場(chǎng)，不僅嚴(yán)重危害了食品安全，也影響了我國(guó)的國(guó)際貿(mào)易信譽(yù)和正規(guī)可可加工廠家的利益。金永生等對(duì)可可粉中摻入大豆柏、芝麻柏、花生殼和板栗殼等幾種外源植物源性成分的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了探索研究，建立的方法準(zhǔn)確性易受雜質(zhì)影響，不能鑒別可可殼粉這種主要的內(nèi)源性摻假物；另外，可能添加的外源植物源性成分種類繁多，難以預(yù)料，實(shí)際操作中不可能對(duì)所有可能添加的外源植物源性成分逐個(gè)進(jìn)行PCR檢測(cè)，因此該方法有很大局限性，難以推廣。為此，本文嘗試從脂質(zhì)指紋分析角度建立可可粉摻假檢測(cè)方法，即用索氏提取法提取11批不同來源的可可粉樣品中的可可脂，通過反相高效液相色譜(HPLC)分離-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)檢測(cè)得到可可粉的脂質(zhì)色譜指紋圖譜，根據(jù)其共有特征峰的相對(duì)峰面積，應(yīng)用系統(tǒng)聚類分析(HCA)法，對(duì)模擬分別摻入板栗殼粉與桂圓殼粉且分別摻入代可可脂和棕櫚油的可可粉摻假樣品進(jìn)行脂質(zhì)指紋分析。本發(fā)明可為我國(guó)可可粉的質(zhì)量檢測(cè)方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升及完善提供科學(xué)依據(jù)與參考，從而促進(jìn)我國(guó)可可粉產(chǎn)品的質(zhì)量提高和穩(wěn)定，更好地規(guī)范可可粉市場(chǎng)，維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種準(zhǔn)確可靠且較簡(jiǎn)便，可推廣應(yīng)用于可可粉的摻假檢測(cè)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為首先，構(gòu)建可可粉甘油酯標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，包括可可粉脂質(zhì)的提取、高效液相色譜的指紋分析及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的確定；然后，根據(jù)可可粉甘油酯組成的測(cè)定方法，測(cè)定模擬摻假樣品的脂質(zhì)甘油酯組成；最后，根據(jù)可可粉樣品和模擬摻假樣品脂質(zhì)甘油酯組分的相對(duì)峰面積組成的矩陣，進(jìn)行聚類分析。本發(fā)明的具體步驟為
I、可可粉脂質(zhì)甘油酯指紋圖譜的建立方法包括下列步驟(I)可可粉脂質(zhì)的提取稱取2. 50g左右可可粉，置于濾紙筒中，放入索氏抽提器的提取管中，并在提取瓶中加入2/3左右的石油醚，水浴47°C，6h。取出提取瓶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，濃縮至干。然后將提取瓶在105°C干燥2h，取出放置于干燥器內(nèi)冷卻，稱重，重復(fù)此操作至恒重。準(zhǔn)確稱取一定量提取得到的脂質(zhì)，溶解于三氯甲烷，使其濃度為5mg/mL左右。(2)高效液相色譜分析色譜柱symmetry C18 (250_X 4. 6mm, 5 μ m)。流動(dòng)相Α為乙腈/氯仿(70 :30), B為乙腈/氯仿(30:70)。二元梯度洗脫程序0min, 100%A ;5min,70%A ;25min，0%A ;25. I 30min，100%A。柱溫40°C。流速0. 8mL/min。ELSD 漂移管溫度:85°C，N2流速2. 5L/min。在此條件下分別進(jìn)樣分析，得 到可可粉甘油酯的色譜指紋圖譜。以11號(hào)峰為參照，計(jì)算樣品中各峰的相對(duì)保留時(shí)間。(3)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立通過對(duì)11個(gè)不同產(chǎn)地的可可粉樣品中甘油酯高效液相色譜圖進(jìn)行比較，確定共有特征峰，并將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入指紋圖譜專用軟件得到由其共有特征峰構(gòu)成的可可粉甘油酯的標(biāo)準(zhǔn)色譜指紋圖譜。待測(cè)樣品可與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對(duì)比，區(qū)別其異同。共有特征峰有14個(gè)，它們的相對(duì)保留時(shí)間RT (以11號(hào)峰POS為參照)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于1% ;即I 號(hào)峰平均 RT 為 O. 411，RSD 為 O. 18%;2 號(hào)峰平均 RT 為 O. 465，RSD 為 0%;3 號(hào)峰平均 RT 為 O. 703，RSD 為 O. 15%;4 號(hào)峰平均 RT 為 O. 743，RSD 為 O. 22%;5 號(hào)峰平均 RT 為 O. 786，RSD 為 O. 07%;6 號(hào)峰平均 RT 為 O. 848，RSD 為 O. 12%;7 號(hào)峰平均 RT 為 O. 878，RSD 為 O. 02%;8 號(hào)峰平均 RT 為 O. 899，RSD 為 0%;9 號(hào)峰平均 RT 為 O. 944，RSD 為 O. 03%;10 號(hào)峰平均 RT 為 O. 977，RSD 為 O. 06%;11 號(hào)峰平均 RT 為 I. 000，RSD 為 0%;12 號(hào)峰平均 RT 為 I. 107，RSD 為 0%;13 號(hào)峰平均 RT 為 I. 183，RSD 為 O. 34%;14 號(hào)峰平均 RT 為 I. 215，RSD 為 O. 34%;其中超過總峰面積3%的指紋峰有3個(gè)，分別為8號(hào)峰，相對(duì)峰面積
10.8489Γ12. 403%; 11號(hào)峰，相對(duì)峰面積51. 518% 53. 078%; 12號(hào)峰，相對(duì)峰面積30 . 46 39Γ32. 677%。2、聚類分析本發(fā)明選擇Ward法作為聚類方法、Chebychev距離作為測(cè)量距離方法，均值為I作為標(biāo)準(zhǔn)化處理，進(jìn)行聚類分析。11號(hào)共有指紋峰較穩(wěn)定，峰面積百分比約50%，且與鄰近峰分離較好，保留時(shí)間較居中，因此設(shè)定11號(hào)峰為參照峰。然后，應(yīng)用14個(gè)共有特征峰的相對(duì)峰面積(以11號(hào)峰作為參照峰)組成的矩陣進(jìn)行聚類分析。本發(fā)明建立了可可粉的脂質(zhì)甘油酯組成的HPLC指紋圖譜，其相似度均在O. 995以上。應(yīng)用可可粉脂質(zhì)甘油酯組成的HPLC指紋圖譜的14個(gè)共有特征峰的相對(duì)峰面積組成的矩陣，以系統(tǒng)類聚法對(duì)摻假可可粉進(jìn)行分析，摻入I. 2% (占樣品質(zhì)量的百分含量)及以上代可可脂或棕櫚油的摻假可可粉樣品可以予以鑒別。本方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，可應(yīng)用于可可粉的摻假檢測(cè)。


圖I :11個(gè)產(chǎn)地可可粉脂質(zhì)甘油酯組成的HPLC指紋圖譜；各峰保留時(shí)間(min)分別為1號(hào)峰一7. 291 ；2 號(hào)峰一8. 245 ；3號(hào)峰一12. 469 ；4號(hào)峰一 13. 184 ；5 號(hào)峰一 13. 943 ；6 號(hào)峰一 15. 038 ；7 號(hào)峰一 15. 571 ；8 號(hào)峰一 15. 947 ；9 號(hào)峰一 16. 745 ；10 號(hào)峰一 17. 331 ；11 號(hào)峰一 17. 739 ；12 號(hào)峰一 19. 635 ；13 號(hào)峰一20. 978 ；14號(hào)峰一21. 561。圖2 :模擬摻假可可粉樣品脂質(zhì)色譜圖；圖3:模擬摻入板栗殼及代可可脂的摻假可可粉樣品聚類分析樹狀圖；圖4:模擬摻入桂圓殼及棕櫚油的摻假可可粉樣品聚類分析樹狀圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I :摻入板栗殼及代可可脂的可可粉的摻假檢測(cè)方法研究I、儀器、樣品及試劑I. I 樣品11批不同來源的可可粉樣品和摻假脂質(zhì)代可可脂(BS2000):均由無錫市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所局采集；模擬摻假材料板栗殼粉由購(gòu)自無錫市大潤(rùn)發(fā)超市的板栗制得；I. 2 試劑石油醚、三氯甲烷分析純，(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈色譜純，(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；I. 3 儀器高效液相色譜儀(包括G1311A四元泵，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1379A在線脫氣機(jī)，G1316A 柱溫箱，AgilentllOO 化學(xué)工作站):Agilentll00,美國(guó) Agilent 公司；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器Alltech2000,美國(guó)Agilent公司；BUCHI 索氏抽提器B-811，瑞士 BUCHI Labortechnik AG 有限公司；DLSB_ 低溫冷卻液循環(huán)泵DLSB-5/20，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52_2，上海滬西分析儀器廠有限公司；循環(huán)水多用真空泵SHZ_3，上海滬西分析儀器廠有限公司。腈、甲醇均為色譜純。2、可可粉脂質(zhì)的提取稱取2. 50g左右可可粉，置于濾紙筒中，放入索氏抽提器的提取管中，并在提取瓶中加入2/3左右的石油醚，水浴47°C，6h。取出提取瓶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，濃縮至干。然后將提取瓶在105°C干燥2h，取出放置于干燥器內(nèi)冷卻，稱重，重復(fù)此操作至恒重。準(zhǔn)確稱取一定量提取得到的脂質(zhì)，溶解于三氯甲烷，使其濃度為5mg/mL左右。3、高效液相色譜分析色譜柱symmetryC18 (250mmX 4. 6mm, 5 μ m)。流動(dòng)相Α 為乙腈 / 氯仿(70 :30)，B 為乙腈 / 氯仿(30 :70)。二元梯度洗脫程序0min，100%A ；5min,70%A ；25min,0%A ；25. I 30min，100%A。柱溫40°C。流速:0. 8mL/min。ELSD 漂移管溫度85°C，N2 流速:2. 5L/min。在此條件下分別進(jìn)樣分析，得到可可粉樣品脂質(zhì)甘油酯組成的指紋譜圖，見附圖I。以11號(hào)峰為參照，計(jì)算樣品中各峰的相對(duì)保留時(shí)間。4、標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立及共有指紋峰特征通過11個(gè)不同產(chǎn)地的可可粉樣品中的脂質(zhì)甘油酯組成的高效液相色譜測(cè)定，比較其色譜圖，確定共有特征峰14個(gè)，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RT(以11號(hào)峰為參照)的相 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于1% ;其中超過總峰面積3%的指紋峰有3個(gè)，分別為8號(hào)峰，相對(duì)峰面積10. 848% 12· 403% ；11號(hào)峰，相對(duì)峰面積51. 518% 53. 078% 12號(hào)峰，相對(duì)峰面積30 . 46 39Γ32. 677%。5、聚類分析系統(tǒng)聚類分析源自分類學(xué)，是以樣本的相似性為基礎(chǔ)的。它的基本思想是將待聚類樣本集的各樣本各自看成一類，然后規(guī)定或定義樣本與樣本間的距離或相似性量度以及類與類之間的距離后進(jìn)行聚類。聚類開始時(shí)，每個(gè)樣本各自形成一類，類與類之間和樣本與樣本之間的距離是相同的，選擇距離最小的一對(duì)即相似性最大的一對(duì)樣本合并成一個(gè)新類；再計(jì)算該新類和其他所有類間的距離；比較各個(gè)距離之后，將距離最小的兩類又合并成另一個(gè)新類。直到所有樣本集中的樣本歸為一類為止。整個(gè)聚類過程，進(jìn)行了 n(樣本數(shù)目)-I次的合并新類的操作，得到η-l個(gè)并類距離。這η-l個(gè)合并過程也可以用樹狀圖來表示。根據(jù)給出的樹狀圖便可得出樣本類別的相關(guān)信息。按照2和3的方法測(cè)定摻入板栗殼和代可可脂的可可粉的甘油三酯的組成，并選擇Ward法作為聚類方法、Chebychev距離作為測(cè)量距離方法，均值為I作為標(biāo)準(zhǔn)化處理,進(jìn)行聚類分析。11號(hào)共有指紋峰較穩(wěn)定，峰面積較大，且與鄰近峰分離較好，保留時(shí)間較居中，因此設(shè)定11號(hào)峰為參照峰。然后，以共有特征峰和非共有峰的相對(duì)峰面積(以11號(hào)峰POS作為參照峰)組成的矩陣進(jìn)行聚類分析。因板栗殼中基本上不含脂質(zhì)，故當(dāng)向Sll號(hào)可可粉中摻入板栗殼時(shí)，則可可粉中的可可脂含量會(huì)降低，為使可可脂含量達(dá)標(biāo)，不法廠家通常同時(shí)摻入一定量的代可可脂。因此本實(shí)驗(yàn)?zāi)M制備8個(gè)摻加不同量代可可脂的樣品(摻加代可可脂后總脂含量均達(dá)到10%)，見表I (經(jīng)測(cè)定Sll號(hào)可可粉中原有總脂含量為9. 96%，即近似為10%。)。按照步驟2的方法提取這些樣品中的脂質(zhì)，并按照步驟3進(jìn)行HPLC指紋分析(圖2a)。根據(jù)色譜峰的相對(duì)峰面積組成的矩陣進(jìn)行聚類分析，由所得的聚類分析樹狀圖(圖3)可見樣品Al不能從純正的可可粉樣品(SI Sll)中區(qū)別出來，而A2 A8則均可區(qū)分于SI S11，即摻入
I.2%及以上代可可脂的樣品可以予以鑒別。表I :模擬摻入板栗殼及代可可脂的摻假可可粉組成
權(quán)利要求
1.一種基于脂質(zhì)聚類分析的可可粉摻假檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟 1)構(gòu)建可可粉甘油酯標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，提取若干批不同來源的正宗可可粉樣品的脂質(zhì)后進(jìn)行甘油酯組成的高效液相色譜指紋分析，并確定共有特征峰； 2)采用步驟I)的中可可粉甘油酯標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的測(cè)定方法，測(cè)定可可粉未知樣品的甘油酯組成； 3)將步驟2)獲得的未知樣品的色譜圖與步驟I)得到的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比較，根據(jù)它們相對(duì)峰面積組成的矩陣，進(jìn)行聚類分析，判定可可粉是否摻假。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于構(gòu)建可可粉標(biāo)準(zhǔn)品甘油酯標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的具體步驟為 1)可可粉脂質(zhì)的提取稱取2.50g左右可可粉，置于濾紙筒中，放入索氏抽提器的提取管中，并在提取瓶中加入2/3左右的石油醚，水浴47°C，6h ;取出提取瓶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，濃縮至干；然后將提取瓶在105°C干燥2h，取出放置于干燥器內(nèi)冷卻，稱重，重復(fù)此操作至恒重；準(zhǔn)確稱取提取得到的脂質(zhì)，溶解于三氯甲烷，使其濃度為5mg/mL左右； 2)高效液相色譜分析色譜柱symmetryC18, 250mmX4. 6mm, 5 μ m ;流動(dòng)相A為乙腈/氯仿(70 :30)，B為乙腈/氯仿(30 70) ;二元梯度洗脫程序0min, 100%A ；5min,70%A ；25min，0%A ；25. I 30min，100%A ;柱溫40°C ;流速:0. 8mL/min ；ELSD 漂移管溫度85°C, N2流速2. 5L/min ;在此條件下進(jìn)樣分析步驟(I)過濾后的樣品，得到可可粉甘油酯的高效液相色譜指紋圖譜； 3)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的確定通過11個(gè)不同產(chǎn)地的可可粉樣品中提取得到的脂質(zhì)甘油酯組成的高效液相色譜測(cè)定，比較其色譜圖，確定了標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜共有14個(gè)特征峰，所述共有特征峰以11號(hào)峰POS為參照的相對(duì)保留時(shí)間RT的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于1%。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中聚類分析選擇Ward法作為聚類方法、Chebychev距離作為測(cè)量距離方法，均值為I作為標(biāo)準(zhǔn)化處理，進(jìn)行聚類分析，以14個(gè)共有特征峰的相對(duì)峰面積組成的矩陣進(jìn)行聚類分析，其中11號(hào)峰作為參照峰。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于脂質(zhì)聚類分析的可可粉摻假檢測(cè)方法，用索氏提取法提取可可粉中的可可脂，通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)檢測(cè)，構(gòu)建可可粉的脂質(zhì)色譜指紋圖譜，根據(jù)其共有特征峰的相對(duì)峰面積，應(yīng)用系統(tǒng)聚類分析(HCA)法，對(duì)模擬分別摻入板栗殼粉與桂圓殼粉且分別摻入代可可脂和棕櫚油的可可粉摻假樣品進(jìn)行脂質(zhì)指紋分析和摻假鑒別試驗(yàn)。結(jié)果表明該方法對(duì)摻入1.2%(占樣品質(zhì)量的百分含量)及以上代可可脂或棕櫚油的摻假可可粉樣品可以予以鑒別。該方法較簡(jiǎn)便、靈敏且重復(fù)性好，可用于摻入不含脂質(zhì)或低脂質(zhì)類雜質(zhì)的偽劣樣品(為使脂質(zhì)含量達(dá)標(biāo)，通常人為摻入代可可脂或棕櫚油等)的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102778517SQ20121024670
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者姚鳳花, 戴軍, 朱松, 王琴, 胡明華, 詹晟, 陳尚衛(wèi) 申請(qǐng)人:無錫市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心