專利名稱：一種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測脂肪酸含量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(GC-MS法)快速檢測動物樣品中脂肪酸含量的方法。
背景技術：
脂肪酸是構成人體脂肪和類脂的基本物質(zhì)，是細胞膜磷脂的重要成分，直接調(diào)節(jié)細胞膜的組成及蛋白質(zhì)與膜內(nèi)受體。脂肪酸根據(jù)飽和度的不同可分為飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUFA)。短鏈SFA可調(diào)節(jié)腸道運動，促進結腸細胞増殖，也可増加腸道黏膜損傷處的循環(huán)血流，促進腸道黏膜結構和功能的恢復；另外，短鏈飽和脂肪酸可治療轉(zhuǎn)流性結腸炎、遠段潰瘍性結腸炎和放射性結腸炎。此外，SFA攝入過多增加高胰島素(Ins)血癥的風險以及患乳腺癌的危險。MUFA可降低血漿總膽固醇和LDL的水平，降低血小板的聚集率,減少機體內(nèi)自由基脂質(zhì)超氧化物的作用，也具有降低血壓的作用。MUFA改善了內(nèi)皮白細胞黏附因子的基因表達，從而可預防動脈粥樣硬化，降低患冠心病的危險性。MUFA還能起到降血糖的作用，另夕卜，因為MUFA是神經(jīng)元細胞膜組成成分，它能維持神經(jīng)元細胞膜完整性，因此MUFA可防止記憶下降。PUFA是腦的成長、細胞間相互作用，第二信息向こ酰膽堿的應答及神經(jīng)傳導功能等腦功能發(fā)育不可缺少的物質(zhì)，可用于治療精神分裂癥。另外，不飽和脂肪酸有利于膜的流動性，更有利于胰島素(Ins)的透膜吸取及與受體的結合。在正常情況下人體內(nèi)脂肪酸是ー穩(wěn)定的化學組分，處于相對平衡，生物體內(nèi)脂肪酸的改變能誘導神經(jīng)生理、認知和其他行為的變化，尤其是必需脂肪酸含量的改變。而某些脂肪酸(如亞油酸，亞麻酸等高級脂肪酸)對人體保健極為重要，但人體又不能自行合成，根據(jù)測定含量的高低，可通過飲食營養(yǎng)加以調(diào)節(jié)，提高人們的健康和防止疾病的發(fā)生。血漿中游離脂肪酸的測定是先將脂肪酸與Cu2+作用，以氯仿萃取后用銅試劑測定Cu2+的濃度，進而得到游離脂肪酸的含量，該方法不僅繁瑣，而且只能測定脂肪酸總量。氣相色譜法雖然具有高分離能力，但對脂肪酸定性鑒定時要有標準物質(zhì)對照，無標樣時測定較困難。另外，脂肪酸組分復雜，難以分離，傳統(tǒng)方法通常采用酸水解、堿水解以及皂化法等，步驟繁瑣，所需樣品量大，不適用于科研、臨床中微量樣品的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、快速、實時的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測脂肪酸含量的方法，特別適合對動物組織中微量樣品的檢測。為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案I)樣品準備將IOmg動物組織剪碎后得樣品，將樣品置于螺ロ玻璃瓶中；2)提取、皂化及甲酯化將質(zhì)量分數(shù)為37%的濃鹽酸與2，2- ニ甲氧基丙烷按照0. 02 0. 98的體積比混合得濃鹽酸2，2-ニ甲氧基丙烷溶液，向螺ロ玻璃瓶內(nèi)的樣品中分別加入20 ii L質(zhì)量濃度為lmg/mL的內(nèi)標物石油醚溶液，以及ImL濃鹽酸2，2- ニ甲氧基丙烷溶液，然后充氮氣保護下震蕩20min，震蕩后用氮氣將螺ロ玻璃瓶內(nèi)的液體吹干，吹干后向螺ロ玻璃瓶內(nèi)加入2. 5mL質(zhì)量分數(shù)為13%的三氟化硼甲醇溶液，然后將螺ロ玻璃瓶于80-85 °C水浴中加熱I小吋；3)加熱結束后向螺ロ玻璃瓶內(nèi)加入2. 5mL去離子水，然后用石油醚萃取2次，取石油醚層，將石油醚層用無水Na2SO4干燥，干燥后過濾得濾液，將濾液減壓濃縮至體積不再減少得檢測樣，向檢測樣充入氮氣進行保護；4)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對檢測樣內(nèi)的脂肪酸進行測定；5)數(shù)據(jù)分析及樣品鑒定經(jīng)過步驟4)后，根據(jù)獲得的原始光譜數(shù)據(jù)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，計算檢測樣內(nèi)各脂肪酸組分的相對含量以及絕對含量。
所述動物組織包括大腦、肝臟、腎臟、心臟、血液或肌肉組織。所述動物組織的來源包括小鼠、大鼠、比格犬、恒河猴、豬、牛、雞、鴨、魚或人。所述氣相色譜的工作條件為檢測樣溶于500 L正己烷后上樣，進樣量為I U L，進樣方式為不分流，載氣為流速I. 5mL/min的氦氣，升溫程序為初始溫度為60°C，保持4min,然后以5°C /min升至150°C,然后以4°C /min升至300°C,保持5min。所述質(zhì)譜的工作條件為采用EI源、正離子檢測，電子能量為70eV，離子源溫度為230°C，單四級桿溫度為150°C，掃描方式為全掃描方式，電子倍增器電壓為1070V，溶劑延遲為 3. 75min。所述相對含量采用面積歸ー化方法進行計算。所述絕對含量的計算方法為脂肪酸組分對應的峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值乘以內(nèi)標物的濃度。所述內(nèi)標物包括十五烷酸、十七烷酸、十九烷酸、二十ー烷酸或二十三烷酸。本發(fā)明所述氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測脂肪酸含量的方法與傳統(tǒng)常用的動植物、微生物油脂檢測方法相比，具有以下優(yōu)點I)本發(fā)明利用2，2-ニ甲氧基丙烷-濃鹽酸對動物組織中脂類進行提取和皂化，將提取與皂化合并，簡化了操作步驟，再利用三氟化硼甲醇溶液甲酯化獲得脂肪酸甲酷，最后利用石油醚提取脂肪酸組分，檢測組織的樣品用量與現(xiàn)有技術相比顯著降低，提高了檢測的靈敏度，同時，每批次樣品檢測僅需要約2小時左右，節(jié)省了人力、物力、財力，可以達到快速檢測的目的，提高了工作效率。2)本發(fā)明可同時測定動物組織中幾乎所有的脂肪酸，碳數(shù)從碳9到碳26，分子量從100到400，且對功能性的多不飽和脂肪酸(PUFA)如含有1-6和雙鍵或三鍵的PUFA具有非常好的分離和定性、定量檢測效果；同時，對于具有相同碳數(shù)、相同分子量，而結構不同的PUFA的同分異構體(在生理調(diào)解和體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導等方面具有非常重要的作用)，本方法具有獨特的優(yōu)勢；同時，本發(fā)明可對不同樣品間的脂肪酸組成及含量進行比較，應用性更廣，為科研實驗、臨床應用及食品質(zhì)量和安全監(jiān)測中對動物樣品脂肪酸組成及含量的快速檢測提供新的思路和方法。3)本發(fā)明采用質(zhì)譜儀作為氣相色譜的檢測信號，與普通的FID和T⑶檢測器相比有兩大優(yōu)勢其一是靈敏度高，且沒有校正因子的影響，色譜峰的峰面積真正代表了試樣中脂肪酸甲酯的質(zhì)量，這ー優(yōu)點對于未知脂肪酸的定量檢測尤為重要；其ニ是檢出限低，本發(fā)明直接檢測的信號是物質(zhì)的質(zhì)荷比(m/z)，與氫火焰離子和熱導檢測器相比，省去了將離子濃度(FID)或?qū)嵯禂?shù)(TCD)轉(zhuǎn)化為濃度的步驟，因此，不但降低了檢測限，而且還縮短了響應時間。另外，本發(fā)明解決了氣相色譜法(GC)定性定量分析檢測脂肪酸所需標準品數(shù)量眾多且價格昂貴等問題。


圖I為小鼠肝臟樣品GC-MS檢測的總離子流圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明作進ー步說明，以昆明小鼠肝臟中脂肪酸的檢測為例，但本發(fā)明的保護范圍不局限于該實驗。本發(fā)明提供了一種基于分步ー鍋法提取及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測微量動物脂肪酸含量的方法，具體步驟如下 一、樣品準備將取得的小鼠臟肝組織至于冰凍緩沖液中保存；準確稱量10. OOmg ( ±0. 02mg)的肝臟組織，剪至Imm左右，然后將樣品置于5mL的螺ロ玻璃瓶中。檢測實驗中該螺ロ玻璃瓶可替代傳統(tǒng)的加熱回流裝置，其具有以下特征體積小，所需樣品量少(I-IOmg),有較好的密封效果(具螺ロ瓶蓋且耐壓0. 2-0. 3Mpa)。 ニ、樣品的提取、皂化及甲酷化取IOmg十七燒酸溶于石油醚(60-90), IOmL容量瓶定容,配置成lmg/mL的十七燒酸石油醚溶液，作為內(nèi)標物標準液；將質(zhì)量分數(shù)為37%的濃鹽酸與2，2-ニ甲氧基丙烷按照0.02 0.98的體積比混合得2%的濃鹽酸2，2- ニ甲氧基丙烷溶液；向螺ロ玻璃瓶內(nèi)的樣品中分別加入20 ii L質(zhì)量濃度為lmg/mL的十七烷酸石油醚溶液，以及ImL濃鹽酸2，2- ニ甲氧基丙烷溶液，然后充氮氣保護、室溫下于SK-I漩渦振蕩器上震蕩20min，震蕩后用氮氣將螺ロ玻璃瓶內(nèi)的液體(反應中產(chǎn)生的丙酮、甲醇以及2，2-ニ甲氧基丙烷)吹干，吹干后向螺ロ玻璃瓶內(nèi)加入2. 5mL質(zhì)量分數(shù)為13%的三氟化硼甲醇溶液，然后將螺ロ玻璃瓶于80-85°C水浴中加熱I小時；加熱結束后向螺ロ玻璃瓶內(nèi)加入2. 5mL去離子水，然后用石油醚萃取2次，取石油醚層，將石油醚層用無水Na2SO4干燥，干燥后過濾得濾液，將濾液于循環(huán)真空水泵上減壓濃縮(減壓濃縮條件為常溫、-0. OlMpa)至體積不再減少，得檢測樣品，沖入氮氣保護。與其他的甲酯化方法相比，本發(fā)明采用的方法具有以下優(yōu)點a酷化時間短，相同條件下，HCl甲醇溶液反應需兩小時；b反應易處理，若采用硫酸催化，因其強氧化性，則需要増加一歩水洗處理；c皂化產(chǎn)物較少，更真實的反應脂肪酸的實際含量，相對于堿催化的酯化方法，本發(fā)明幾乎沒有皂化產(chǎn)物。三、分離、檢測色譜檢測采用安捷倫7890A/5975C，檢測樣溶于500 y L正己烷后上樣；
①分析柱是HP-5MS彈性石英毛細管柱(30m*0. 25id*0. 25um)；②載氣氦氣,流速為I. 5mL/min ； ③進樣量I y L，可自動進樣，也可手動進樣，進樣方式為不分流；④進樣ロ溫度290 0C，傳輸線溫度300 °C ；⑤程序升溫，初始溫度60°C,保持4min,以5°C /min升至150°C,然后以4°C /min升至300°C，保持5min ；質(zhì)譜①EI源，正離子檢測，電子能量為70eV ；
②離子源溫度230°C，單四級桿溫度150°C ;③掃描方式為全掃描方式；④電子倍增器電壓1070V，溶劑延遲3. 75min ；四、數(shù)據(jù)分析及處理色譜圖的保留時間和積分面積由工作站自動完成，利用NIST08譜庫定性色譜峰。各脂肪酸組分的相對含量通過面積歸ー化法得到；絕對含量由對應的峰面積和內(nèi)標物峰面積的比值乘以內(nèi)標物的濃度得到。參見圖1，本檢測樣中可辨認的脂肪酸甲酷的峰為18個，其余峰為小分子溶劑、化合物或膽固醇等留體。可辨認的脂肪酸甲酯及其保留時間列于表I。保留時間及峰面積用安捷倫Chemstation計算,相對含量用面積歸ー化的方法計算,絕對含量(mg/g組織)采用與內(nèi)標物標準液脂肪酸C17:0的峰面積比獲得。表I.小鼠肝臟中脂肪酸的含量
權利要求
1.一種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測脂肪酸含量的方法，其特征在于包括以下步驟 1)樣品準備將IOmg動物組織剪碎后得樣品，將樣品置于螺ロ玻璃瓶中； 2)提取、皂化及甲酯化將質(zhì)量分數(shù)為37%的濃鹽酸與2，2-ニ甲氧基丙烷按照0.020. 98的體積比混合得濃鹽酸2，2- ニ甲氧基丙烷溶液，向螺ロ玻璃瓶內(nèi)的樣品中分別加入20 u L質(zhì)量濃度為lmg/mL的內(nèi)標物石油醚溶液，以及ImL濃鹽酸2，2- ニ甲氧基丙烷溶液，然后充氮氣保護下震蕩20min，震蕩后用氮氣將螺ロ玻璃瓶內(nèi)的液體吹干，吹干后向螺ロ玻璃瓶內(nèi)加入2. 5mL質(zhì)量分數(shù)為13%的三氟化硼甲醇溶液，然后將螺ロ玻璃瓶于80-85°C水浴中加熱I小時； 3)加熱結束后向螺ロ玻璃瓶內(nèi)加入2.5mL去離子水，然后用石油醚萃取2次，取石油醚層，將石油醚層用無水Na2SO4干燥，干燥后過濾得濾液，將濾液減壓濃縮至體積不再減少得檢測樣，向檢測樣充入氮氣進行保護； 4)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對檢測樣內(nèi)的脂肪酸進行測定； 5)數(shù)據(jù)分析及樣品鑒定經(jīng)過步驟4)后，根據(jù)獲得的原始光譜數(shù)據(jù)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，計算檢測樣內(nèi)各脂肪酸組分的相對含量以及絕對含量。
2.根據(jù)權利要求I所述ー種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測脂肪酸含量的方法，其特征在于所述動物組織包括大腦、肝臟、腎臟、心臟、血液或肌肉組織。
3.根據(jù)權利要求2所述ー種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測脂肪酸含量的方法，其特征在于所述動物組織的來源包括小鼠、大鼠、比格犬、恒河猴、豬、牛、雞、鴨、魚或人。
4.根據(jù)權利要求I所述ー種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測脂肪酸含量的方法，其特征在于所述氣相色譜的工作條件為檢測樣溶于500 UL正己烷后上樣，進樣量為Iy L，進樣方式為不分流，載氣為流速I. 5mL/min的氦氣，升溫程序為初始溫度為60°C，保持4min，然后以5°C /min 升至 15CTC,然后以 4°C /min 升至 30CTC,保持 5min。
5.根據(jù)權利要求I所述ー種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測脂肪酸含量的方法，其特征在于所述質(zhì)譜的工作條件為采用EI源、正離子檢測，電子能量為70eV，離子源溫度為230°C，單四級桿溫度為150°C，掃描方式為全掃描方式，電子倍増器電壓為1070V，溶劑延遲為3.75min。
6.根據(jù)權利要求I所述ー種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測脂肪酸含量的方法，其特征在于所述相對含量采用面積歸ー化方法進行計算。
7.根據(jù)權利要求I所述ー種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測脂肪酸含量的方法，其特征在于所述絕對含量的計算方法為脂肪酸組分對應的峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值乘以內(nèi)標物的濃度。
8.根據(jù)權利要求7所述ー種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測脂肪酸含量的方法，其特征在于所述內(nèi)標物包括十五烷酸、十七烷酸、十九烷酸、二十ー烷酸或二十三烷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測脂肪酸含量的方法，選擇GC-MS技術對動物樣品中脂肪酸含量進行檢測，是為了解決在實際生產(chǎn)、科研工作中，傳統(tǒng)方法中樣品處理步驟繁瑣且價格昂貴等問題，具體步驟包括1)動物組織樣品的處理；2)提取、皂化和甲酯化脂肪酸；3)確定GC-MS檢測脂肪酸的條件；4)數(shù)據(jù)分析及樣品鑒定。本發(fā)明對動物組織中的脂肪酸含量進行檢測具有操作簡單，檢測限低，實驗重現(xiàn)性好，實驗數(shù)據(jù)直觀可靠等特點，特別適用于微量樣品檢測，并可對不同樣品間的脂肪酸組成及含量進行比較，應用性更廣，為科研實驗、臨床應用及食品質(zhì)量和安全監(jiān)測中對動物樣品脂肪酸組成及含量的快速檢測提供新的思路和方法。
文檔編號G01N30/02GK102749396SQ201210247480
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月17日 優(yōu)先權日2012年7月17日
發(fā)明者陳福欣, 龔頻 申請人:陜西科技大學