一種檢測(cè)akt2蛋白的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)AKT2蛋白的試劑盒及其制備方法，涉及化學(xué)發(fā)光免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】，為解決目前AKT2蛋白超微量檢測(cè)的技術(shù)問題，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括：1)AKT2蛋白校準(zhǔn)品；2)鏈親和素偶聯(lián)的固相載體；3)生物素化的AKT2蛋白配體；4)5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯(lián)標(biāo)記的AKT2蛋白配體；以及5)所作用的化學(xué)發(fā)光底物。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明制備上述試劑盒的方法。本發(fā)明主要用途為AKT2蛋白超微量檢測(cè)。
【專利說明】—種檢測(cè)AKT2蛋白的試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化學(xué)發(fā)光免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種檢測(cè)AKT2蛋白的試劑盒及其制備方法，結(jié)合了生物素-親和素免疫放大技術(shù)和化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]AKT2基因由417個(gè)腺嘌呤、526個(gè)胞嘧啶、520個(gè)鳥嘌呤核386個(gè)胸腺嘧啶組成。AKT2蛋白是由AKT2基因表達(dá)的蛋白，AKT2蛋白又名β-RAC-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在科研和生產(chǎn)過程中，需要測(cè)定溶液中ΑΚΤ2蛋白含量變化，來監(jiān)控實(shí)驗(yàn)條件和監(jiān)控生產(chǎn)過程。
[0003]目前ΑΚΤ2蛋白測(cè)定方法有膠體金免疫層析(GICA);蛋白質(zhì)印跡(WB);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，化學(xué)發(fā)光法免疫分析(CLIA) ;GICA、ELISA、WB的優(yōu)點(diǎn)是相對(duì)成本低廉，缺點(diǎn)是靈敏度低，AKT2蛋白含量少的情況下檢測(cè)不出，CLIA檢測(cè)靈敏度比上述方法高，但還是不能滿足科研上對(duì)AKT2蛋白超微量檢測(cè)的需要。為了適應(yīng)科研和生產(chǎn)上對(duì)檢測(cè)靈敏度的更高要求，需要對(duì)化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行創(chuàng)新。
[0004]1977年，Halmann將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)結(jié)合起來，建立了化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)。經(jīng)過幾十年的發(fā)展。目前根據(jù)標(biāo)記物的不同，化學(xué)發(fā)光免疫分析可分以下四個(gè)類型:(I)以辣根過氧化物酶(HRP)為標(biāo)記物的酶促化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。該系統(tǒng)的發(fā)光底物為魯米諾及其衍生物，在氧化劑存在下，HRP催化魯米諾及其衍生物發(fā)光，波長(zhǎng)425nm。苯酚類化合物可增強(qiáng)其發(fā)光強(qiáng)度；(2)以堿性磷酸酶為標(biāo)記物的酶促化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。該系統(tǒng)的發(fā)光底物為1，2—二氧環(huán)乙烷衍生物(或稱金剛烷衍生物)。例如 AMPPD, CSPD, CDP-Star, Lum1-phos480, Lumiphos-530 等。表面活性劑會(huì)增強(qiáng)并延長(zhǎng)其發(fā)光強(qiáng)度，發(fā)光波長(zhǎng)470nm;(3)以吖啶酯類為標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用直接標(biāo)記吖啶酯類發(fā)光劑，吖啶酯類發(fā)光劑在堿性H2O2作用下直接發(fā)光，波長(zhǎng)430nm處吖啶酯類發(fā)光系統(tǒng)發(fā)光強(qiáng)度高；(4)以三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+為標(biāo)記物的電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。是通過施加一定的電壓進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)，在電極表面產(chǎn)生電生物質(zhì)，然后電生物質(zhì)與體系中三丙胺(TPA)之間通過電子傳遞形成激發(fā)態(tài)，之后激發(fā)態(tài)的能量以光的形式釋放出來.在波長(zhǎng)350?420nm處發(fā)光強(qiáng)度高。
[0005]1982年，Ikarlyama等以氯化血紅素代替辣根過氧化酶(HRP),用碳二亞胺法將其標(biāo)記在人體血清白蛋白(HSA)上，結(jié)合酶免疫分析技術(shù)，對(duì)HSA的化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)試進(jìn)行了初步探討。他們這一開創(chuàng)性的研究，為金屬卟啉在酶免疫分析中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
[0006]1984年，Hara等將鐵卟啉配合物標(biāo)記于HSA抗體上用于檢測(cè)HSA，并將這一體系應(yīng)用于分析化學(xué)中。
[0007]1992年，Adam等對(duì)鐵卟啉和錳卟啉的催化機(jī)理進(jìn)行的研究，并與辣根過氧化酶的催化發(fā)光效應(yīng)進(jìn)行了比較。
[0008]1993年，Motsenbocker等用光敏劑和金屬卩卜啉標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)。
[0009]1994年，慈云祥等課題組對(duì)于金屬卟啉催化劑替代辣根過氧化酶催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)也進(jìn)行了一些探索。
[0010]2006年，Komagoe等卟啉誘導(dǎo)的光學(xué)生成過氧化氫的測(cè)定，用魯米諾發(fā)光法:在水溶液中與卟啉聚集的一個(gè)結(jié)構(gòu)活性關(guān)系進(jìn)行研究。
[0011]2006年，Rana等電化學(xué)產(chǎn)生過氧化氫和卟啉化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行了嘗試。
[0012]2006年，李春艷等四苯基卟啉鋅摻雜8-羥基喹啉鋁與四苯基聯(lián)苯二胺的電致發(fā)光性能進(jìn)行了研究。
[0013]2007年，劉波等發(fā)光材料四苯基卟啉及其金屬配合物的合成及性能進(jìn)行了研究。
[0014]2008年，吳俊等卟啉摻雜MEH-PPV的發(fā)光性能進(jìn)行了探討。
[0015]2011年，D Wu等新型化學(xué)發(fā)光流動(dòng)注射分析減少其對(duì)魯米諾-間-四(3_甲氧基-4-羥基)苯基卟啉錳催化過氧化氫的反應(yīng)進(jìn)行了研究。
[0016]2012年，Kazemi等對(duì)動(dòng)力學(xué)化學(xué)發(fā)光猛(III)-四(4_磺酸)P卜啉魯米諾過氧化氫體系的人和牛血清白蛋白的影響進(jìn)行了研究探索。
[0017]上述研究，主要在卟啉類標(biāo)記物替代辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶及其他酶促化學(xué)發(fā)光技術(shù)，在過氧化氫等過氧化物，魯米諾及魯米諾衍生物為底物基礎(chǔ)上進(jìn)行的探索，取得一些效果，但沒有滿足科研方面對(duì)超微量檢測(cè)的需求。我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水溶性的5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉在促進(jìn)吖啶酯和吖啶磺酰胺在非堿性條件下的化學(xué)發(fā)光效果方面明顯優(yōu)于上述四種常用化學(xué)發(fā)光常見系統(tǒng)及文獻(xiàn)報(bào)道，能夠提高對(duì)超微量被測(cè)物的檢測(cè)能力。
[0018]吖啶酯類發(fā)光劑標(biāo)記物合成后，會(huì)有微量發(fā)光劑在沒有堿性條件刺激下緩慢發(fā)光，這點(diǎn)也影響了其長(zhǎng)期穩(wěn)定性及對(duì)緩沖液的選擇性。5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉化學(xué)結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，且對(duì)酸堿PH值適應(yīng)的范圍寬，可長(zhǎng)期穩(wěn)定保存。
[0019]同時(shí)，目前沒有發(fā)現(xiàn)5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉作為標(biāo)記物，吖啶酯，吖啶磺酰胺為底物的化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)AKT2蛋白的研究及報(bào)道。
[0020]生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidin system,BAS)具有多級(jí)的信號(hào)放大作用，并且不增加非特異性干擾，且具有特異性好、穩(wěn)定性高、和實(shí)驗(yàn)成本低等特點(diǎn)。
[0021]本發(fā)明結(jié)合BAS技術(shù)，首次提出采用水溶性5，10，15-三(4_吡啶基)-20-R-羧基卟啉作為標(biāo)記物構(gòu)建化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)AKT2蛋白的方法，該方法集合了 CLIA靈敏度、BAS放大作用和5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉穩(wěn)定性，克服了傳統(tǒng)CLIA法靈敏度無法滿足科研超微量研究的弊端，本發(fā)明試劑盒的高靈敏度，穩(wěn)定性方面5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉作為標(biāo)記物明顯好于常規(guī)直接標(biāo)記吖啶酯，吖啶磺酰胺標(biāo)記物，發(fā)光信號(hào)更強(qiáng)，對(duì)于檢測(cè)超微量物質(zhì)提供了 一個(gè)全新的化學(xué)發(fā)光技術(shù)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022]本發(fā)明克服了當(dāng)前化學(xué)發(fā)光法不能滿足對(duì)AKT2蛋白超微量檢測(cè)的技術(shù)問題，即通過生物素-親和素免疫放大技術(shù)結(jié)合化學(xué)發(fā)光技術(shù)和水溶性5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉作為標(biāo)記物構(gòu)建化學(xué)發(fā)光免疫分析高靈敏度檢測(cè)AKT2蛋白，提供了一種檢測(cè)AKT2蛋白的試劑盒及其制備方法。
[0023]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0024]本發(fā)明的目的是提供一種生物素-親和素免疫放大技術(shù)結(jié)合化學(xué)發(fā)光技術(shù)和水溶性5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉作為標(biāo)記物方法，檢測(cè)AKT2蛋白的試劑盒。
[0025]本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括:1)AKT2蛋白校準(zhǔn)品；2)鏈親和素偶聯(lián)的固相載；3)生物素化的AKT2蛋白配體；4) 5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯(lián)標(biāo)記的AKT2蛋白配體；以及5)上述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉所作用的化學(xué)發(fā)光底物。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述AKT2蛋白為AKT2基因表達(dá)的β-RAC-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述ΑΚΤ2蛋白校準(zhǔn)品為ΑΚΤ2基因表達(dá)的β-RAC-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶配制的校準(zhǔn)品凍干品，校準(zhǔn)品內(nèi)所用的保護(hù)基質(zhì)蛋白為牛血清白蛋白，卵清蛋白。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述鏈親和素偶聯(lián)的固相載體為磁性顆粒，塑料顆粒。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述ΑΚΤ2蛋白配體為可以與ΑΚΤ2蛋白特異性結(jié)合反應(yīng)的單克隆抗體、多克隆抗體、基因工程抗體、蛋白質(zhì)、大分子有機(jī)化合物。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述5，10，15_三(4-吡啶基)-20_R-羧基卟啉結(jié)構(gòu)
式如⑴所示:
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)AKT2蛋白的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: DAKT2蛋白校準(zhǔn)品； 2)鏈親和素偶聯(lián)的固相載體； 3)生物素化的AKT2蛋白配體； 4)5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯(lián)標(biāo)記的AKT2蛋白配體；以及 5)上述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉所作用的化學(xué)發(fā)光底物。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述AKT2蛋白為AKT2基因表達(dá)的β -RAC-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述ΑΚΤ2蛋白校準(zhǔn)品為ΑΚΤ2基因表達(dá)的β -RAC-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶配制的校準(zhǔn)品凍干品，校準(zhǔn)品內(nèi)所用的保護(hù)基質(zhì)蛋白為牛血清白蛋白，卵清蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述鏈親和素偶聯(lián)的固相載體為磁性顆粒，塑料顆粒。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述ΑΚΤ2蛋白配體為可以與ΑΚΤ2蛋白特異性結(jié)合反應(yīng)的單克隆抗體、多克隆抗體、基因工程抗體、蛋白質(zhì)、大分子有機(jī)化合物。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉結(jié)構(gòu)式如(I)所示:
7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯(lián)標(biāo)記的AKT2蛋白配體所用的偶聯(lián)劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，N，K - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。
8.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉所作用的化學(xué)發(fā)光底物為吖啶酯、吖啶磺酰胺。
9.一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)以AKT2蛋白純品配制AKT2蛋白校準(zhǔn)品； 2)使鏈親和素偶聯(lián)固相載體；3)使AKT2蛋白配體生物素化； 4)用5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯(lián)標(biāo)記AKT2蛋白配體； 5)配制化學(xué)發(fā)光底物液； 6)分裝上述AKT2蛋白校準(zhǔn)品、鏈親和素偶聯(lián)固相載體、生物素化的AKT2蛋白配體、5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯(lián)標(biāo)記的AKT2蛋白配體和化學(xué)發(fā)光底物液；以及 7)組裝為成品。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述制備AKT2蛋白校準(zhǔn)品的步驟I)采用以下方法: 配制含牛血清白蛋白2%，卵清蛋白1.5%，水解明膠0.5%，2.5%蔗糖的0.01M PB緩沖溶液為校準(zhǔn)品基質(zhì)液，用基質(zhì)液配制含不同濃度AKT2蛋白的校準(zhǔn)品，用西林瓶分裝ImL/瓶，凍干處理后，-20°C保存。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述制備鏈親和素化固相載體的步驟2)采用以下磁性顆粒方法: 250mg氨基末端磁性顆粒置于燒杯，加入甲醇及丙酮各5mL反復(fù)清洗，磁性分離，棄去上清，加入DMF溶解的IOmL0.2%的1，4 一苯二異硫氰酸酯(PDITC)溶液，置于恒溫振蕩器，反應(yīng)IOh,最后將反應(yīng)后的磁性顆粒用丙酮及超純水反復(fù)清洗6遍,取新制備經(jīng)PDITC活化的磁性顆粒置于30mL離心管中，加入PBS25mL，加入4mg鏈親和素，置于恒溫振蕩器中反應(yīng)20min，磁性分離，測(cè)定反應(yīng) 前后 溶液在280nm的OD值，以PBS清洗3次，收集，加入等量丙三醇，-20°C保存。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述制備鏈親和素化固相載體的步驟2)采用以下塑料顆粒方法: 250mg氨基末端塑料顆粒置于燒杯，加入甲醇及丙酮各5mL反復(fù)清洗，離心分離，棄去上清，加入DMF溶解的IOmL0.2%的1，4 一苯二異硫氰酸酯(PDITC)溶液，置于恒溫振蕩器，反應(yīng)10h，最后將反應(yīng)后的塑料顆粒用丙酮及超純水反復(fù)清洗6遍，取新制備經(jīng)PDITC活化的塑料顆粒置于30mL離心管中，加入PBS25mL，加入4mg鏈親和素，置于恒溫振蕩器中反應(yīng)20min，離心分離，測(cè)定反應(yīng)前后溶液在280nm的OD值，以PBS清洗3次，收集，加入等量丙三醇，-20°C保存。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述制備AKT2蛋白配體生物素化的步驟3)采用以下方法: 將生物素-N-羥基磺酸基琥珀酰亞胺酯(Sulf0-NHS-Biotin)冰箱取出平衡至室溫。0.01M的PBS稀釋AKT2蛋白配體至濃度2mg/mL。稱取Sulfo-NHS_Biotin2mg于西林瓶中加超純水300 μ L，輕輕搖勻活化。立即將活化的生物素溶液54 μ L緩慢加入2mLAKT2蛋白配體溶液中，室溫反應(yīng)30min，反應(yīng)液用0.01M的PBS透析4°C 8h (換液4次)，收集，加入等量丙三醇，-20°C保存。
14.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述制備5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶聯(lián)標(biāo)記AKT2蛋白配體的步驟4)采用以下方法: 將1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)冰柜取出平衡至室溫，取10mg5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉和20mgEDC分別溶于Iml超純水中使其溶解，將兩者在4°C混合攪拌反應(yīng)30min，然后向此混合液中緩慢滴加入含30mg/mL AKT2蛋白配體溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h， 層析純化后，-20°C保存。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK103575897SQ201210253644
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月23日
【發(fā)明者】常立峻, 李勇, 徐海偉, 胡慶鋒, 陳秀發(fā) 申請(qǐng)人:蘇州長(zhǎng)光華醫(yī)生物試劑有限公司