專利名稱：人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的b細(xì)胞表位肽段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及急性腎損傷的診斷技術(shù)。
背景技術(shù)：
急性腎損傷(acute kidney injury, AKI),有時(shí)混淆于急性腎功能衰竭(acuterenal failure, ARF),尚無統(tǒng)一的定義。目前普遍接受的AKI概念是指各種原發(fā)或繼發(fā)損傷因素導(dǎo)致的腎臟結(jié)構(gòu)的改變、腎功能下降以及最終腎衰竭的整個(gè)過程。有研究表明，冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后病人AKI發(fā)病率達(dá)到26. 6 %，嚴(yán)重創(chuàng)傷后AKI發(fā)病率達(dá)到50 %，而AKI在重癥監(jiān)護(hù)病房(I⑶)中病死率高達(dá)37% 76. 19%，是一種發(fā)病率和病死率很高的臨床綜合癥。早期治療對(duì)AKI的逆轉(zhuǎn)十分重要，而早期診斷是早期治療的前提和關(guān)鍵所在。目前AKI的診斷和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，主要是AKIN (Acute Kidney Injury Network)國(guó)際組織于2007年提出的AKIN標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)將AKl分為三級(jí)一級(jí)為血肌酐(sCr)升高到基礎(chǔ)值的150 200% ;二級(jí)為sCr升高到基礎(chǔ)值的200 300% ;三級(jí)為sCr升高到基礎(chǔ)值的300%以上。這種主要以sCr水平為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)AKI的早期診斷缺乏敏感性和特異性。如當(dāng)腎功能下降50%時(shí)，sCr水平才開始上升，因此將sCr作為AKI診斷指標(biāo)幾乎起不到腎功能保護(hù)的作用，這也是長(zhǎng)期以來AKI臨床治療效果不佳的主要原因。為更好地進(jìn)行AKI的預(yù)防、診斷、治療以及預(yù)后評(píng)估，發(fā)現(xiàn)和鑒定AKI新的敏感生物標(biāo)志物并建立準(zhǔn)確的測(cè)定方法是AKI防治研究的重要方向。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)是Kjeldsen L等人1993年在中性粒細(xì)胞特異性顆粒中發(fā)現(xiàn)的一種小分子分泌型蛋白。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)NGAL也在人體多種組織如腎、前列腺、呼吸道和消化道上皮中低水平表達(dá)，而在炎癥時(shí)的中性粒細(xì)胞、乳腺癌及膀胱上皮癌細(xì)胞中表達(dá)顯著增高。更為重要的發(fā)現(xiàn)是Mishra J等2003年研究觀察到在缺血再灌注損傷后的小鼠腎臟和順鉬誘導(dǎo)的中毒性腎損害中，小鼠尿液中NGAL在損傷后3h測(cè)定值升高大于三倍，在12h可達(dá)正常的12倍，72h恢復(fù)到正常水平，能很好地反應(yīng)AKI的病程和損傷程度；2005年Lancet雜志上報(bào)道了 71例接受心臟手術(shù)的患兒的研究發(fā)現(xiàn)，體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass, CPB)后2h的血和尿NGAL是預(yù)測(cè)AKI的可靠指標(biāo)，其曲線下面積(under the curve, AUC)分別為O. 910和O. 998。2008年Nickola等另一項(xiàng)研究監(jiān)測(cè)了 635例急診科患者的尿NGAL水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尿NGAL在診斷AKI具有較高的敏感性和特異性(分別為90%和99% )，引起了人們對(duì)NGAL檢測(cè)的廣泛關(guān)注。為了在理論上回答NGAL是否是檢測(cè)診斷AKI理想的標(biāo)志物，美國(guó)哥倫比亞大學(xué)Barasch研究小組進(jìn)行了深入研究，并在2011年Nature Medcine上報(bào)道了用Luciferase-2和mCherry雙螢光報(bào)告基因在NGAL啟動(dòng)子和其5’ UTR驅(qū)動(dòng)下的knock in小鼠模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，揭示了缺血性和細(xì)胞毒性AKI時(shí)NGAL基因表達(dá)活性在腎組織中的Henles管和集合管的上皮細(xì)胞呈劑量依賴性的顯著變化;AKI時(shí)尿中NGAL主要來自腎組織，而不是來自正常時(shí)也低表達(dá)NGAL的中性粒細(xì)胞、肝細(xì)胞、呼吸道和腸道等上皮細(xì)胞；尿NGAL的檢測(cè)、比血和尿Cr檢測(cè)更能特異性地代表AKI的損傷程度，其檢測(cè)的敏感性有極為顯著的差異(P < O. 001)。這項(xiàng)重要的研究發(fā)現(xiàn)，不僅從理論上說明了腎上皮特征性尿NGAL檢測(cè)診斷AKI的高特異性和高靈敏性的原因和臨床應(yīng)用前景，也解釋了過去一段時(shí)間里NGAL免疫檢測(cè)中存在的主要問題。2010年Linjun Cai等用ELISA發(fā)現(xiàn)AKI、細(xì)菌感染和結(jié)腸癌患者尿NGAL與正常對(duì)照相比均顯著增高，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AKI時(shí)增加的是NGAL單體(25KD)，細(xì)菌感染增加的主要是NGAL同源二聚體(45KD)，而結(jié)腸癌增加的是NGAL與金屬蛋白酶9(MMP-9)結(jié)合形成的異源二聚體(135KD)。根據(jù)Barasch研究小組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究結(jié)果推測(cè)患者發(fā)生AKI時(shí)，其腎Henles管和集合管上皮細(xì)胞NGAL基因反應(yīng)性高表達(dá)參與了腎上皮的抗損傷作用，因?yàn)橐延醒芯拷沂綨GAL可通過介導(dǎo)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)原始腎上皮細(xì)胞的成熟時(shí)同時(shí)以腎上皮特征性單體形式分泌入尿液。丹麥Bioporto Diagnostic公司研發(fā)的人NGAL快速ELISA檢測(cè)試劑盒,所用的NGAL抗體均是用人外周血白細(xì)胞來源的NGAL同源二聚體免疫動(dòng)物后制備，忽略了不同組織來源NGAL之間可能存在的差異。事實(shí)上，這些試劑盒檢測(cè)結(jié)果在人群中存在太大的變 異，例如Bioporto Diagnostic報(bào)道醫(yī)院IQJ病人尿液中NGAL濃度在110 40000ng/ml之間，血液中NGAL濃度在25 3491ng/ml，這種個(gè)體間巨大差異，其原因可能就是AKI損傷時(shí)，尿液中的主要NGAL形式是損傷上皮重新合成和分泌的單體NGAL，未能開發(fā)出針對(duì)腎上皮特征性NGAL特異性的抗體，影響了其對(duì)AKI診斷的應(yīng)用。上述的研究發(fā)現(xiàn)和目前NGAL檢測(cè)試劑的不足，迫切地要求對(duì)臨床AKI患者尿中的腎上皮特征性NGAL分子形式進(jìn)行深入的研究并獲得特異性的檢測(cè)抗體，用以建立適合臨床AKI診斷的尿NGAL定量檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供NGAL B細(xì)胞表位肽段，其能作為NGAL單克隆抗體的抗原。為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為人NGAL的B細(xì)胞表位肽段，所述人NGAL的B細(xì)胞表位肽段的氨基酸序列如SEQID N0:3所示。上述氨基酸序列是通過如下手段獲取的從NCBI Protein數(shù)據(jù)庫中獲取如SEQ ID NO 2所示的NGAL蛋白序列；分別對(duì)NGAL蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原性、親疏水性、可及性、柔韌性以及可能的糖基化位點(diǎn)，對(duì)各區(qū)段進(jìn)行分析評(píng)分，選取得分高的區(qū)域作為B細(xì)胞表位區(qū)域，其序列如SEQID NO 3所示。所述的B細(xì)胞表位肽段化學(xué)合成中在其N端引入半胱氨酸，以提高其與BSA的交聯(lián)能力，接著與BSA或KLH交聯(lián)。將所述的B細(xì)胞表位肽段與載體蛋白BSA或KLH交聯(lián)之后，不僅能增加抗原的大小，也能增強(qiáng)免疫性。本發(fā)明的目的之二在于提供一種雜交瘤細(xì)胞，其能特異性的分泌NGAL單克隆抗體。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為所述的人NGAL的B細(xì)胞表位肽段制備的雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞的制備是通過所述NGAL的B細(xì)胞表位肽段與BSA或KLH交聯(lián)后免疫Balb/c小鼠，取免疫后的小鼠脾細(xì)胞懸液并制備SP2/0細(xì)胞懸液(脾臟B淋巴細(xì)胞)，并與骨髓瘤細(xì)胞和融合，將融合細(xì)胞選擇性培養(yǎng)，通過ELISA篩選后得到的雜交瘤細(xì)胞。將篩選出的最強(qiáng)陽性細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，同時(shí)在克隆化培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞中篩選出最強(qiáng)陽性化的雜交瘤細(xì)胞送于并送中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)保藏，保藏號(hào)為CCTCC NO :C201262，其可穩(wěn)定分泌所述單克隆抗體。本發(fā)明的目的之三在于提供所述一種特異性抗體，其可作為檢測(cè)NGAL抗原的試齊U。同時(shí)，還提供含有上述抗體的試劑盒，該試劑盒可用于急性腎損傷的診斷。所述的人NGAL的B細(xì)胞表位肽段制備的特異性抗體。所述特異性抗體為所述人NGAL的B細(xì)胞表位肽段制備的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。作為優(yōu)選的，所述雜交瘤細(xì)胞的生物保藏編號(hào)為CCTCC N0:C201262。基于診斷急性腎損傷的雙抗夾心ELISA試劑盒，由緩沖液、單克隆抗體、洗滌液、酶標(biāo)抗體、TMB底物、終止液組成，所述單克隆抗體由保藏編號(hào)為CCTCC NO C201262的雜交 瘤分泌，所述酶標(biāo)抗體為被辣根過氧化物酶標(biāo)記的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白重組蛋白為抗原制備的多克隆抗體。本發(fā)明的目的之四在于提供三種新應(yīng)用，該應(yīng)用為急性腎損傷的診斷提供了新的思路。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為所述的人NGAL的B細(xì)胞表位肽段在制備急性腎損傷的診斷試劑中的應(yīng)用。所述的人NGAL的B細(xì)胞表位肽為免疫原性多肽，其可被B細(xì)胞抗原受體(BCR)識(shí)別并結(jié)合，或與人NGAL抗原的抗體特異性識(shí)別并相互結(jié)合；所以，所述B細(xì)胞表位肽段可以制備成診斷試劑，用于檢測(cè)標(biāo)本中的NGAL抗原的特異性抗體含量，進(jìn)一步判斷是否為急性腎損傷患者提供指標(biāo)參數(shù)。人NGAL的B細(xì)胞表位肽段的特異性抗體在制備急性腎損傷的診斷試劑中的應(yīng)用?；蛉薔GAL的B細(xì)胞表位肽段的特異性抗體的免疫復(fù)合物在制備急性腎損傷的診斷試劑中的應(yīng)用。所述人NGAL的B細(xì)胞表位肽段的特異性抗體或人NGAL的B細(xì)胞表位肽段的特異性抗體的免疫復(fù)合物，可用于免疫原及篩選原的檢測(cè)，或建立NGAL定量檢測(cè)。當(dāng)NGAL的含量超過正常人的標(biāo)準(zhǔn)，NGAL的含量可作為判定急性腎損傷的判定輔助參數(shù)。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明制備的人NGAL是高純度的NGAL單體重組蛋白(rhNGAL),該蛋白可用于抗體制備的免疫原及篩選原，同時(shí)可以作為建立NGAL定量檢測(cè)時(shí)的校準(zhǔn)品。通過NGAL蛋白序列的B細(xì)胞表位肽段免疫小鼠制備的單克隆抗體具有純度高(SDS-PAGE檢測(cè)純度> 96% )、效價(jià)高(ELISA效價(jià)達(dá)I : 256000)、特異性好、可大批量制備等優(yōu)點(diǎn)。人NGAL蛋白中B細(xì)胞表位肽段化學(xué)合成時(shí)在其N端引入半胱氨酸，提高了其與KLH或BSA交聯(lián)率(> 50% )，可作為優(yōu)質(zhì)免疫原。通過本發(fā)明制備的單克隆抗體、多克隆抗體可用于病人尿液NGAL含量的檢測(cè)，如可采用“雙抗體夾心” ELISA反應(yīng)模式，即酶標(biāo)記人抗NGAL單抗、酶標(biāo)板包被抗NGAL多抗(中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白重組蛋白為抗原制備的多克隆抗體)和被測(cè)樣品NGAL抗原形成“雙抗體夾心”結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。


圖I為重組pET42a_NGAL質(zhì)粒經(jīng)Sal I.BamH I酶切鑒定圖，箭頭顯示目的酶切產(chǎn)物。
圖2為NGAL重組蛋白的非變性PAGE電泳考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。圖3為Western Blot分析重組NGAL的免疫特異性，圖中MIF為對(duì)照蛋；NGAL(左)為上樣量結(jié)果；NGAL (右)為上樣量20 μ g結(jié)果。圖4為人NGAL表位特異性單克隆抗體的純化圖。圖5為人NGAL多克隆抗體(中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白重組蛋白為抗原制備的多克隆抗體)的純化圖。圖6為人NGAL多克隆抗體斑點(diǎn)雜交圖。本發(fā)明中雜交瘤細(xì)胞株雜交瘤細(xì)胞株6-NGAL送中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)保藏，保藏編號(hào)為CCTCC N0:201262，地址位于中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保存日期為2012年6月27日，保藏的培養(yǎng)物名稱為小鼠雜交瘤細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)和現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(沈關(guān)心周汝麟主編)中所述的條件或制造商建議的條件進(jìn)行或配置，未注明來源的產(chǎn)品均可通過市場(chǎng)途徑獲得。實(shí)施例INGAL重組蛋白的制備從GENBANK獲取NGAL編碼基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)行密碼子偏嗜性改造，化學(xué)合成編碼基因片段，克隆入原核表達(dá)載體經(jīng)DNA測(cè)序鑒定后誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，經(jīng)性質(zhì)鑒定后，大量純化制備NGAL重組蛋白，該蛋白可用于抗體制備的免疫原及篩選原，同時(shí)可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中建立NGAL定量檢測(cè)時(shí)的校準(zhǔn)品，具體的一 NGAL重組蛋白基因克隆從GENBANK獲得人NGAL蛋白的基因序列(登錄號(hào)為匪005564. 3)，將其遞交于Graphical codon usage analyzer (http://guca. schoedl. del),分析其密碼子偏性情況;具體的，將人NGAL基因密碼子在大腸桿菌中使用率< 10%的同義置換為大腸桿菌偏愛的密碼子，使其更加容易在大腸桿菌中表達(dá)，優(yōu)化后的NGAL⑶S核苷酸序列為SEQ ID NO 1 ；相應(yīng)的多肽序列如SEQ ID NO 2所示。為進(jìn)行有效表達(dá)及純化，在序列SEQ ID NO :1的5'-及3'-端分別添加限制性酶切位點(diǎn) Sal 1(5' GTCGAC3 ' )、BamH 1(5' GGATCC3 ')，其中 BamH I 位點(diǎn)后加入gatgatgatgataag序列，其編碼Asp-Asp-Asp-Asp-Lys多肽序列為EK酶的識(shí)別位點(diǎn)。然后委托上海英駿生物工程有限公司進(jìn)行全基因合成。合成的過程為常規(guī)基技術(shù)，可參考分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)一書。二 pET42a_NGAL 重組質(zhì)粒構(gòu)建將pET42a載體與合成基因經(jīng)Sal I、BamH I酶切4小時(shí)后用T4 DNA連接酶4°C過夜連接。將制備好的感受態(tài)DH5a菌200 μ 1，冰浴，吸取1μ I連接產(chǎn)物加入管中，轉(zhuǎn)化DH5 a菌，輕拍混勻，冰浴30分鐘，42°C水浴90秒，取出離心管再冰浴2分鐘，加入800 μ I室溫的2 X YT培養(yǎng)液混勻，37°C搖床220rpm振蕩培養(yǎng)I小時(shí)，分別將50 μ 1、200 μ I及剩下的全部轉(zhuǎn)化菌涂于3個(gè)含卡那霉素抗性的2 X YT培養(yǎng)板上，37°C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日挑去白色菌落接種于LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，用堿裂解法提取質(zhì)粒，取質(zhì)粒用Sal I、BamH I雙酶切 4 小時(shí)，酶切體系為pET42a-NGAL 質(zhì)粒 DNA 10 μ 1，Sal I I μ I,BamH I I μ 1，IOX 緩沖液K 2 μ 1，ddH20 6 μ 1，并取酶切產(chǎn)物10 μ I行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(詳見圖I)。
三NGAL重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)將轉(zhuǎn)化pET42a_NGAL的細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)，測(cè)細(xì)菌OD值達(dá)O. 6-0. 8時(shí)加入IPTG (至終濃度lmmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)。培養(yǎng)后每克濕菌以10倍體積的PBS緩沖液(pH7.3)重懸，混勻后超聲破菌，破菌完全后于4°C 10，000印111離心151^11，上清以0.454 111微孔濾膜過濾。分別取少量上清與沉淀SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白可溶性，經(jīng)鑒定表達(dá)蛋白破菌后幾乎都存在上清中，為可溶性表達(dá)。 四NGAL重組蛋白純化上清經(jīng)過濾后用Amersham的AKTAprime上柱純化，Binding buffer平衡后用Elution buffer線性洗脫，收集主洗脫峰，用His-Binding buffer稀釋10倍后進(jìn)行HisTrap HP再次純化，純化后的產(chǎn)物用PBS平衡過的分子篩，收集蛋白。將獲得的蛋白用HiTrap Desalting置換緩沖體系為 EK切割buffer (50mmol/L Tris_HCl，PH8. O)，按EK酶與蛋白I 1000的質(zhì)量比加入EK酶，4°C搖床60rpm切割24h。切割后用His-Binding buffer稀釋后HisTrap HP純化，15% SDS-PAGE電泳鑒定，NGAL重組蛋白分子量為25Kda左右，詳見圖2，純化后目的蛋白純度達(dá)到95 %以上。五NGAL重組蛋白濃度、純度測(cè)定I Lowry法測(cè)定NGAL蛋白含量Lowry法測(cè)定的試劑盒購(gòu)于上海美季生物技術(shù)有限公司。試劑A : I) 10 克 Na2CO3, 2 克 NaOH 和 O. 25 克酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6 · 4H20)。溶解于500毫升蒸餾水中；2)0. 5克硫酸銅(CuSO4 · 5H20)溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份㈧與I份⑶混合，即為試劑甲。試劑B:在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉(Na2WO4 · 2H20)，25克鑰酸鈉(Na2MoO4 · 2H20)及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克硫酸鋰(Li2SO4)，50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟)。稀釋至I升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水I倍，使最終的酸濃度為IN左右。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用O. 9% NaCl溶液。詳見下表
權(quán)利要求
1.人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的B細(xì)胞表位肽段，其特征在于所述人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的B細(xì)胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的B細(xì)胞表位肽段，其特征在于所述人NGAL的B細(xì)胞表位肽段偶聯(lián)有載體蛋白BSA或KLH。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的B細(xì)胞表位肽段，其特征在于所述人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的B細(xì)胞表位肽段N末端引入半胱氨酸。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的B細(xì)胞表位肽段制備的雜交瘤細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的交瘤細(xì)胞，其特征在于所述雜交瘤細(xì)胞的生物保藏編號(hào)為CCTCC NO C201262o
6.權(quán)利要求I所述的人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的B細(xì)胞表位肽段制備的特異性單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的特異性抗體，其特征在于所述特異性抗體為所述人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的B細(xì)胞表位肽段制備的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。
8.權(quán)利要求I所述的人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的B細(xì)胞表位肽段在制備急性腎損傷的診斷試劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求6所述的特異性抗體及特異性抗體的免疫復(fù)合物在制備急性腎損傷的診斷試劑中的應(yīng)用。
10.基于診斷急性腎損傷的雙抗夾心ELISA試劑盒，由緩沖液、單克隆抗體、洗滌液、酶標(biāo)抗體、TMB底物、終止液組成，其特征在于所述單克隆抗體由保藏編號(hào)為CCTCC NO C201262的雜交瘤分泌，所述酶標(biāo)抗體為被辣根過氧化物酶標(biāo)記的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白重組蛋白為抗原制備的多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及急性腎損傷的診斷技術(shù)，所述人NGAL的B細(xì)胞表位肽段及其制備的雜交瘤細(xì)胞；B細(xì)胞表位肽段、其特異性抗體及特異性抗體的免疫復(fù)合物在制備急性腎損傷的診斷試劑中的應(yīng)用；本發(fā)明制備的B細(xì)胞表位肽段免疫小鼠制備的單克隆抗體具有純度高(SDS-PAGE檢測(cè)純度＞96％)、效價(jià)高(ELISA效價(jià)達(dá)1∶256000)、特異性好、可大批量制備等優(yōu)點(diǎn)；通過本發(fā)明制備的單克隆抗體、多克隆抗體可用于病人尿液NGAL含量的檢測(cè)，如可采用“雙抗體夾心”ELISA反應(yīng)模式，即酶標(biāo)記人抗NGAL單抗、酶標(biāo)板包被抗NGAL多抗和被測(cè)樣品NGAL抗原形成“雙抗體夾心”結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102775473SQ20121026928
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月30日
發(fā)明者姚靜, 張憲, 石延賓, 秦川, 胡偉, 魏勇, 黃洪濤 申請(qǐng)人:重慶業(yè)為基生物科技有限公司