血漿中4種蒽醌的分析方法及其在藥代動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了同時(shí)測(cè)定血漿中大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的分析方法，包括步驟(1)樣品的制備和步驟(2)檢測(cè)，以及在藥代動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用。該分析方法具有良好的專屬性、精密度和準(zhǔn)確度較高，線性范圍較寬，可用于中藥組合物的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定。
【專利說明】血漿中4種蒽醌的分析方法及其在藥代動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于現(xiàn)代中藥應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及血漿中大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的LC-MS/MS檢測(cè)方法，以及在藥代動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]質(zhì)譜是以分子量測(cè)定為基礎(chǔ)的分析方法，近年來，其與高效液相色譜法(HPLC)或毛細(xì)管電泳法(CE)等分離機(jī)制的聯(lián)用不僅提高了其抗雜質(zhì)干擾的能力和節(jié)省了分析時(shí)間，而且大大提高了測(cè)定的靈敏度。軟電離技術(shù)，如電噴霧離子化技術(shù)(ESI)的發(fā)展，則擴(kuò)大了分子量檢測(cè)的范圍。此外，電噴霧離子化技術(shù)可在大氣壓下進(jìn)行，方便與液相色譜儀連結(jié)，使液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC/MS)成為了一種高靈敏度、高選擇性且快速分析的技術(shù)，其能在短時(shí)間之內(nèi)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)分析物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定。通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC/MS/MS)能更清楚地了解藥物在動(dòng)物活體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)規(guī)律，從而讓研究人員能夠更好地掌握藥物的藥理作用。另外還可以省去復(fù)雜、繁瑣且耗時(shí)的樣本前處理工作。
[0003]糖敏靈丸是在臨床驗(yàn)證的有效方開郁清胃顆?；A(chǔ)上加減變化與劑型改革而成。糖敏靈丸由黃連、大黃、黃芩、白芍、柴胡、枳實(shí)、山楂、烏梅、半夏、天花粉共十味常用中藥組成，具有開郁清胃、滋陰降火、通腑瀉濁之功效。臨床觀察證實(shí)其對(duì)II型糖尿病的血糖有明顯的改善作用，尤其是對(duì)體型偏胖的早中期II型糖尿病患者效果更加顯著。同時(shí)，藥理實(shí)驗(yàn)揭示糖敏靈能顯著增強(qiáng)高熱量飼料誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型糖尿病大鼠和自發(fā)性II型糖尿病大鼠的胰島素敏感性。
[0004]大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚是糖敏靈中的4種有效成份，但是目前還沒有可以同時(shí)檢測(cè)血漿樣本中這4種成份的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]糖敏靈制劑作為藥物，需要進(jìn)行必要的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，由于上述藥物活性成分在血中含量極低，需要精密儀器和精密方法進(jìn)行操作，本發(fā)明經(jīng)過研究，找到了適合測(cè)定這些物質(zhì)的方法。
[0006]本發(fā)明提供一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法定量檢測(cè)血漿樣本中大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的方法，以及在藥代動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用。
[0007]根據(jù)本發(fā)明，分析方法包括步驟(I)樣品的制備和步驟(2)檢測(cè)，步驟(I)樣品制備采用包括以下步驟的方法:
[0008]a.向待測(cè)樣品中依次加入有機(jī)溶劑、內(nèi)標(biāo)溶液，并混勻；
[0009]b.加入一倍以上體積提取溶劑，混勻；
[0010]c.離心，收集上清液，并蒸干；
[0011]d.步驟c的干燥物重新溶解，離心，取上清液。
[0012]分別考察了不加酸、加酸以及不同酸化條件后進(jìn)行液液萃取，結(jié)果表明，酸化后大黃酚和大黃素甲醚提取率明顯降低，而不加酸時(shí)各待測(cè)物提取回收率最高，因此，樣品不進(jìn)行酸化，直接采用乙醚液液萃取。
[0013]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式之一，步驟a中所述內(nèi)標(biāo)為1，8-二羥基蒽醌。
[0014]對(duì)多種化合物進(jìn)行篩選,其中1，8-二羥基蒽醌與大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚均屬大黃素型蒽醌類化合物，質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度相當(dāng)。為提高方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，選擇1，8-二羥基蒽醌為內(nèi)標(biāo)。
[0015]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式之一，步驟a中所述有機(jī)溶劑為甲醇。
[0016]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式之一，步驟b中所述提取溶劑為乙醚。
[0017]分別考察了甲醇沉淀蛋白法、乙酸乙酯、氯仿和乙醚液液萃取法，結(jié)果表明甲醇沉淀蛋白法和乙醚液液萃取法提取率較高。但甲醇沉淀蛋白法中，大黃素的提取回收率略低于乙醚液液萃取法，大黃酚和內(nèi)標(biāo)的提取回收率略高于乙醚液液萃取法。由于大黃素在所有待測(cè)物中提取回收率最低，為保證所有待測(cè)物的準(zhǔn)確度，選擇乙醚液液萃取法。
[0018]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式之一，步驟d重新溶解所用溶劑為乙腈-水。
[0019]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式之一，步驟(2)采用的液相色譜條件如下:色譜柱為C18色譜柱，流動(dòng)相為乙臆_0.01-0.1%氨水溶液，體積比為10:90-90:10。
[0020]優(yōu)選的，流動(dòng)相為乙腈-0.05%氨水溶液體積比為70:30。
[0021]為獲得高分離度和離子強(qiáng)度，對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。乙腈為有機(jī)相時(shí)待測(cè)物響應(yīng)提高，背景噪音降低。分別考察了乙腈-水、乙腈_5mM甲酸銨水溶液、乙腈-0.5mM甲酸銨水溶液和乙腈-0.05%氨水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明在水相中加入少量氨水，可以提高待測(cè)物在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)，同時(shí)可以改善峰形，因此選擇乙腈-0.05%氨水溶液(70:30, v/v)為流動(dòng)相。
[0022]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式之一，步驟(2)檢測(cè)所用質(zhì)譜采用電噴霧離子化源，電離模式為負(fù)離子選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)。
[0023]各待測(cè)物在ESI源負(fù)離子模式下響應(yīng)強(qiáng)度較高，而在正離子模式下基本無響應(yīng)。
[0024]優(yōu)選的，大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚的碰撞誘導(dǎo)裂解電壓分別為30eV,25eV,23eV,26eVo
[0025]本發(fā)明所述方法可成功用于糖敏靈制劑藥代動(dòng)力學(xué)的測(cè)定。
[0026]本發(fā)明所述糖敏靈丸由下列重量份的原料制成:
[0027]天花粉10-30份柴胡10-30份枳實(shí)3~15份大黃I~6份半夏I~12份黃芩3~15份黃連I~12份白芍3~15份烏梅5~20份山楂3~15份。
[0028]制備方法如下:所述的黃芩加水提取兩次，每次I小時(shí)，提取液加濃鹽酸調(diào)ph值至
1.5~2.0，80°C保溫I小時(shí)，抽濾，濾餅干燥，得黃芩提取物；所述的黃連加75%乙醇提取2次每次2小時(shí)，提取液減壓回收乙醇，加入濃鹽酸調(diào)ph值至1.0~2.0，抽濾，濾餅干燥，得黃連提取物；其余8味藥用水回流提取2次，每次I小時(shí)，提取液減壓濃縮至1: 1，加入95%乙醇至含醇量70%，濾過，濾液減壓濃縮至稠膏加入黃連提取物與黃芩提取物，即得糖敏靈制劑的藥物活性成分。藥物活性成分與微晶纖維素按適當(dāng)比例混合，按照常規(guī)方法制備成濃縮丸。
[0029]本發(fā)明所述糖敏靈制劑包括:片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉針劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜?jiǎng)⒌蝿?、貼劑、滴丸。因?yàn)樗幬锘钚猿煞窒嗤员景l(fā)明提供的方法可以用于多種不同制劑的糖敏靈藥代動(dòng)力學(xué)的檢測(cè)。
[0030]本申請(qǐng)相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而言所具有的優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0031]1、可以一次性檢測(cè)多種藥物活性成分的數(shù)據(jù)。
[0032]2、可用于多種藥物活性成分的藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定。
[0033]3、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高。
[0034]本發(fā)明附加的方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1.空白血漿樣品中1，8- 二羥基蒽醌(IS)的SRM色譜圖。
[0036]圖2.空白血漿中加入1，8- 二羥基蒽醌(IS)對(duì)照品溶液后的SRM色譜圖。
[0037]圖3.大鼠灌胃給予糖敏靈后0.67h，血漿樣品中1，8_ 二羥基蒽醌(IS)的SRM色譜圖。
[0038]圖4.空白血漿樣品中大黃酚的SRM色譜圖。
[0039]圖5.空白血漿中加入大黃 酚對(duì)照品溶液后的SRM色譜圖。
[0040]圖6.大鼠灌胃給予糖 敏靈后0.67h，血漿樣品中大黃酚的SRM色譜圖。
[0041]圖7.空白血漿樣品中大黃素和蘆薈大黃素的SRM色譜圖。
[0042]圖8.空白血漿中加入大黃素和蘆薈大黃素對(duì)照品溶液后的SRM色譜圖。
[0043]圖9.大鼠灌胃給予糖敏靈后0.67h，血漿樣品中大黃素和蘆薈大黃素的SRM色譜圖。
[0044]圖10.空白血漿樣品中大黃素甲醚的SRM色譜圖。
[0045]圖11.空白血漿中加入大黃素甲醚對(duì)照品溶液后的SRM色譜圖。
[0046]圖12.大鼠灌胃給予糖敏靈后0.67h，血漿樣品中大黃素甲醚的SRM色譜圖。
[0047]圖13.大鼠灌胃給予糖敏靈后，大黃素的藥-時(shí)曲線。
[0048]圖14.大鼠灌胃給予糖敏靈后，蘆薈大黃素的藥-時(shí)曲線。
[0049]圖15.大鼠灌胃給予糖敏靈后，大黃酚的藥-時(shí)曲線。
[0050]圖16.大鼠灌胃給予糖敏靈后，大黃素甲醚的藥-時(shí)曲線。
[0051]圖17.大黃素[Μ-Η離子的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖。
[0052]圖18.蘆薈大黃素[Μ-Η離子的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖。
[0053]圖19.大黃酚[Μ-Η離子的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖。
[0054]圖20.大黃素甲醚[Μ-Η離子的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖。
[0055]圖21.1, 8- 二羥基蒽醌(IS) [M_H]_離子的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】:
[0056]以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0057]本發(fā)明是經(jīng)過篩選獲得的，篩選方法如下:
[0058]試驗(yàn)例I血漿樣品中4種蒽醌分析方法的建立
[0059]LC-MS/MS 條件
[0060]色譜柱:HypersilGold-C18(150X 2.1mm, 5 μ m, Thermo)[0061]預(yù)柱-Security Guard-C18 (4.0mmX 3.0mm 1.d, 5 μ m, Phenomenex)
[0062]流動(dòng)相:乙腈-0.05%氨水溶液(70:30)
[0063]柱溫:25°C
[0064]流速:250μ L.mirf1
[0065]離子源:電噴霧離子化源(ESI)
[0066]電離模式:負(fù)離子模式
[0067]MS/MS:選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)。用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z239 — 211 (內(nèi)標(biāo)，1，8- 二羥基蒽醌)，m/z253 — 225 (大黃酚)，m/z269 — 225 (大黃素)，m/z269 — 240 (蘆薈大黃素)，m/z283 — 240 (大黃素甲醚)。
[0068]質(zhì)譜參數(shù):噴霧電壓:3500V;離子源電壓:10eV;毛細(xì)管溫度:350 °C ;鞘氣:N2(35psi)；
[0069]輔助氣=N2(IOpsi);碰撞氣體壓力:Arl.0mTorr (lTorr=133.3Pa) ;1，8_ 二羥基蒽醌、大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚的碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)電壓分別為28eV，30eV,25eV,23eV,26eV ;掃描時(shí)間:0.5s。
[0070]溶液的制備
[0071](I)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制取大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚適量，精密稱定，分別置于IOmL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，獲得濃度分別為0.154mg-mL-1,
0.152mg.mL'0.212mg.πι?Λ·θ.122mg.mL—1的對(duì)照品溶液。分別精密量取大黃素、蘆薈大黃素、大黃酹和大黃素甲醚對(duì)照品溶液5.0,4.0,2.5,5.0mL,置于同一 IOOmL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分另Ij為7.70 μ g.mL—U.08 μ g.mL—1，5.30 μ g.mL—1，6.10 μ g.ml/1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。
[0072]分別精密量取適量混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，甲醇稀釋制成混合對(duì)照品溶液，其中大黃素濃度為 3.850，11.55，38.50,96.2，192.5，385.0, 770.0ng.πι?Λ 蘆薈大黃素濃度為 3.040,9.12，30.40,76.00，152.0,304.0,608.0ng.πι?Λ 大黃酚濃度為 2.650,7.950，26.50,66.25，132.5,265.0,530.0ng.πι?Λ 大黃素甲醚濃度為 3.050,9.15,30.50,76.25，152.5, 305.0,610.0ng.mL 1
[0073](2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制取1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品適量，精密稱定，置于IOmL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，獲得濃度為0.502mg.mL—1的儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液0.05mL,置于IOOmL量瓶中，甲醇稀釋并定容至刻度，獲得濃度為251.0ng.mL—1的內(nèi)標(biāo)溶液。
[0074]各儲(chǔ)備液及標(biāo)準(zhǔn)系列溶液置4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0075]血漿樣品預(yù)處理
[0076]取肝素抗凝血漿200 μ L，置2mL塑料EP管中，依次加入內(nèi)標(biāo)溶液50 yL(l, 8_ 二羥基蒽醌溶液，251.0ng.mL-1)和甲醇100 μ L。潤(rùn)旋混合IOs,加入無水乙醚1.2mL,潤(rùn)旋混合5min, 8000r.mirT1離心5min,分取上層乙醚溶液于45°C下氮?dú)獯蹈?殘洛用100 μ L乙腈-水(7:3)溶解，12000r.mirT1離心5min,取上清液20μ L進(jìn)樣,記錄色譜圖。
[0077]分析方法的確證
[0078](I)方法的專屬性大鼠空白血漿200 μ L，除用100 μ L流動(dòng)相代替內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下方法操作，獲得空白樣品的色譜圖(圖1、4、7和10);將一定濃度的大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的混合對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液(結(jié)構(gòu)見下圖)加入空白血漿中，依法操作，獲得相應(yīng)的色譜圖(圖2、5、8和11)，取大鼠灌胃糖敏靈后的血漿樣品，同法操作，得色譜圖(圖3、6、9和12)。其中1，8-二羥基蒽醌(IS)、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的保留時(shí)間分別為2.0，2.3，2.5，2.8，4.1,8.3min ;結(jié)果
表明,血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。
[0079]
【權(quán)利要求】
1.一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法定量檢測(cè)血漿樣本中大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的方法，包括步驟(I)樣品的制備和步驟(2)檢測(cè)，其特征在于步驟(I)樣品制備采用包括以下步驟的方法: a.向待測(cè)樣品中依次加入有機(jī)溶劑、內(nèi)標(biāo)溶液，并混勾; b.加入一倍以上體積提取溶劑，混勻； c.離心，收集上清液，并蒸干； d.步驟c的干燥物重新溶解，離心，取上清液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中所述內(nèi)標(biāo)為1，8_二羥基蒽醌。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中所述有機(jī)溶劑為甲醇。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中所述提取溶劑為乙醚。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟d重新溶解所用溶劑為乙腈-水。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于液相色譜條件如下:色譜柱為C18色譜柱，流動(dòng)相為乙臆-0.01-0.1 %氛水溶液,體積比為10: 90-90: 10。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述流動(dòng)相為乙腈-0.05%氨水溶液體積比為 70: 30
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于質(zhì)譜采用電噴霧離子化源，電離模式為負(fù)離子選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚的碰撞誘導(dǎo)裂解電壓分別為30eV，25eV，23eV，26eV。
10.如權(quán)利要求1至9任意一項(xiàng)在測(cè)定糖敏靈制劑藥代動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103575830SQ201210272432
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月1日
【發(fā)明者】佟玲, 周水平, 朱永宏, 馬曉慧, 靳元鵬, 鄂秀輝 申請(qǐng)人:天士力制藥集團(tuán)股份有限公司