檢測(cè)維生素b12的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測(cè)維生素B12的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有：包被有維生素B12偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板，酶標(biāo)記抗抗體工作液，維生素B12特異性抗體工作液，維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品溶液，底物顯色液，終止液，濃縮洗滌液，復(fù)溶液。本發(fā)明還公開了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)維生素B12的方法，它包括：首先進(jìn)行樣品前處理，然后用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，最后分析檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明提供的酶聯(lián)免疫試劑盒可用于檢測(cè)谷物類（玉米面、黃豆面、小米面、大米面）、牛奶、奶粉中維生素B12的含量，其操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本的篩查。
【專利說明】檢測(cè)維生素BI 2的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種用于檢測(cè)維生素B12的酶聯(lián)免疫試劑盒，其適用于谷物類(玉米面、黃豆面、小米面、大米面)、牛奶、奶粉中維生素B12的測(cè)定。
技術(shù)背景
[0002]維生素是各種生物維持正常生理功能所必需的一類低分子有機(jī)化合物，它們大多數(shù)是生化代謝過程中的主要輔酶，在體內(nèi)參與、調(diào)節(jié)、控制許多合成和分解代謝，當(dāng)生物體缺乏維生素時(shí)，就會(huì)引發(fā)物質(zhì)代謝障礙，引起多種疾病。維生素B12又叫鈷胺素，其主要生理功能是參與制造骨髓紅細(xì)胞，防止惡性貧血，防止大腦神經(jīng)受到破壞。維生素B12對(duì)于促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)特別是在促進(jìn)幼畜生長(zhǎng)發(fā)育方面效果顯著，在畜禽體內(nèi)主要以參與一碳單位和丙酸代謝發(fā)揮作用，影響遺傳物質(zhì)的合成，還能維持神經(jīng)功能的完整性，是畜禽不可缺少的營(yíng)養(yǎng)原料。養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，常規(guī)飼料中的維生素B12—般作為安全用量，額外添加適量維生素B12可以提高畜禽生產(chǎn)性能，帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益。
[0003]近年來(lái)，余林梁等報(bào)道了以HPLC測(cè)定維生素H，鄧富良等用HPLC同時(shí)測(cè)定注射用水溶性維生素中維生素H和葉酸，任一平、龍朝陽(yáng)等以HPLC測(cè)定食品中的葉酸，楊誼等以HPLC測(cè)定維生素B12。隋玉榮等用離子對(duì)色譜法測(cè)定了維生素B12及葉酸的含量，H.B.L1、Heudi用不同波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定了維生素H、葉酸和維生素B12，宋金春等通過優(yōu)化色譜條件，建立了同一波長(zhǎng)條件下HPLC同時(shí)測(cè)定注射用水溶性維生素中維生素H、葉酸及維生素B12含量的方法。另外維生素B12的測(cè)定方法主要有比色法、電化學(xué)分析法、離子交換法、激光共振拉曼光譜法等，這些方法均是先測(cè)定樣品中Co含量，由鈷含量換算成VB12的含量，操作繁瑣，選擇性較差。劉保生等建立了利用A0-R6G能量轉(zhuǎn)移熒光猝滅法測(cè)定維生素B12的新方法。免疫學(xué)檢測(cè)方法也應(yīng)用于維生素B12的檢測(cè)中，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定維生素B12含量的方法，簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，穩(wěn)定性好，能滿足維生素B12的現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的快速篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述不足提供一種用于維生素B12含量測(cè)定的酶聯(lián)免疫試劑盒，其操作簡(jiǎn)單適合現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的篩選。
[0005]本發(fā)明試劑盒，它包括:
[0006]( I)包被有維生素B12偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板；
[0007](2)維生素B12特異性抗體；
[0008](3)酶標(biāo)記抗抗體；
[0009](4)維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品溶液；
[0010](5)底物顯色液；
[0011](6)終止液；
[0012](7)濃縮洗滌液；[0013](8)復(fù)溶液。
[0014]所述維生素B12偶聯(lián)抗原為維生素B12半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述載體蛋白可為卵清蛋白、牛血清白蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白。
[0015]所述維生素B12半抗原的結(jié)構(gòu)如下:
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)維生素B12的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括有: (1)包被有維生素B12偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板； (2)維生素B12特異性抗體； (3)酶標(biāo)記抗抗體； (4)維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品溶液； (5)底物顯色液； (6)終止液; (7)濃縮洗滌液； (8)復(fù)溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特 征在于所述維生素B12偶聯(lián)抗原是由維生素B12半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述維生素B12半抗原結(jié)構(gòu)如下:

3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述維生素Β12半抗原的制備方法主要包括如下步驟: 0.50g維生素B12、0.1Og琥珀酸酐和Iml吡啶在20ml DMSO中的混合液，在80°C下攪拌反應(yīng)40小時(shí)，蒸除溶劑，乙醇-水體系多次重結(jié)晶后得到鄰苯二甲酸單維生素B12酯。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的維生素B12特異性抗體為維生素B12單克隆抗體。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記抗抗體的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶；酶標(biāo)記抗抗體是采用過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與抗抗體偶聯(lián)得到。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的終止液為f2mol/L的硫酸或鹽酸溶液，所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成，所述底物液A液為過氧化脲溶液，底物液B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液。
7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所用包被緩沖液為ρΗ9.(T9.6，0.0.2mol/L碳酸鹽緩沖液，所用封閉液為pH7.2~.6,0.lmol/L磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量百分比。
8.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的濃縮洗滌液為pH7.2~7.6，含0.5%~1.0%吐溫-0.01%。~0.05%。的疊氮化鈉防腐劑的0.1~0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述的復(fù)溶液為PH值為7.0-7.2，含有59TlO%酪蛋白、0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量百分比。
9.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為O μ g/L、0.2 μ g/L、0.6 μ g/L、1.8 μ g/L、5.4 μ g/L。
10.一種檢測(cè)樣品中維生素B12含量的方法，主要步驟包括: 1)將待測(cè)樣品進(jìn)行前處理； 2)用權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行檢測(cè)； 3)分析檢測(cè)結(jié)果。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK103575914SQ201210273343
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月2日
【發(fā)明者】萬(wàn)宇平, 吳鵬, 羅曉琴, 馮靜, 楊秀賢, 韓雪倩, 顧蓉蓉, 蒲小容 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司