專利名稱：用于預警腎移植后排斥反應的試劑盒及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種預警試劑盒，具體講，涉及ー種移植腎排斥預警試劑盒及其使用方法。
背景技術：
全球因慢性腎功能衰竭而行透析的人數已由1990年的42. 6萬人增加至2000年的106. 5萬人，預計到2010年將達到200余萬人。這ー人數的增長，致使全球透析費用迅速增長，對發(fā)達國家、發(fā)展中國家均造成了巨大的經濟負擔。我國約有100萬尿毒癥患者，每年新增12萬人，每年約有50萬患者需要腎移植。目前我國已累計開展各種器官移植近10 萬例，成為世界第二器官移植大國，其中最多的是腎臟移植，累計達8萬多例。移植受者和移植物有功能長期存活是器官移植追求的最終目標。隨著手術技術的進步、組織配型技術的提高和免疫抑制劑的發(fā)展，腎移植術后I年存活率已大大提高，但長期預后仍有待改善。急性排斥反應的反復發(fā)作和慢性排斥反應是引起移植物失功的主要原因，長期服用免疫抑制劑所帶來的毒副作用，如腎毒性、感染、誘發(fā)腫瘤等，亦影響移植物及受者的長期存活。反復發(fā)作的急性排斥反應與慢性排斥反應是引起移植物失功的重要原因，但臨床上缺乏有效的動態(tài)監(jiān)測與無創(chuàng)診斷手段。移植腎穿刺活檢是目前最可靠的診斷方法，但具有創(chuàng)傷性，可引起感染、出血、甚至移植物丟失等，不易被患者接受且不利于動態(tài)觀察。并且活檢取材也有一定的局限性，根據Banff標準，許多臨床懷疑移植腎排斥的患者在病理形態(tài)上可能并不能符合排斥的診斷標準。因此，迫切需要探索適合我國人群的、可靠的、可滿足動態(tài)觀察需要的移植腎排斥反應無創(chuàng)性診斷方法。該課題的完成將在很大程度上輔助延長患者移植后生存期，提高生存質量，減少國家醫(yī)療投入，節(jié)省家庭開支，具有極大的臨床應用價值和社會、經濟效益，并有助于我國移植界具有國際領先水平的自主知識產權成果的產出。移植腎排斥反應的無創(chuàng)診斷技術的研究現狀自20世紀80年代起，移植學界已開始動態(tài)觀察移植受者各種血清中多種細胞因子水平及變化，探索移植排斥反應的發(fā)生機制及其診斷方法。例如IL-6、可溶型IL-6受體(IL-6R)可溶性⑶30 (s⑶30)、肝細胞再生因子(hepatocytegrowth factor, HGF)、IL-18、轉移生長因子-β (Transforming GrowthFactor Beta, TGF-β )、IL-17、顆粒酶 B、穿孔素、FasL、粒溶素、CD154、I COS、CTLA4、PD-I等分子與移植腎排斥反應相關。中國人民解放軍第三〇九醫(yī)院器官移植中心在1994年對37例腎移植受者和55名正常人血清IL-6水平的動態(tài)測定，結果表明，移植腎急性排異患者血清IL-6水平明顯升高，而慢性排異患者IL-6水平無顯著變化，提示血清IL-6水平監(jiān)測是移植腎排斥反應的重要診斷指標之ー；隨后，又分別對血清免疫細胞抑制性受體(leukocyte-associated Ig-Iike receptor-l, LAIR-I),可溶型 LAIR-2 分子，HLA-G,血小板/T 細胞活化抗原 I (platelet and T cell activation antigen I, PTA1, CD226)和同種異體混合淋巴細胞反應中特異性表達的P140等與移植腎排斥反應的相關性進行了研究和報道。然而，盡管眾多科研工作者致力于篩選移植排斥特異性的生物標記，但至今尚未篩選出特異性分子應用于排斥反應的無創(chuàng)性診斷和鑒別診斷。目前國際上仍缺乏移植腎排斥反應的無創(chuàng)診斷和預警體系。移植排斥反應是ー個非常復雜的過程，細胞免疫和體液免疫機制均參與這個過程，而且，移植物的差異，手術的影響，移植受者個體的差異以及臨床上不同免疫抑制方案的應用等眾多因素的參與使移植排斥反應的診斷更加復雜和困難。另外，既往研究表明，通過檢測單個分子來明確診斷移植排斥反應有很大的難度。早期卵巣上皮癌的血清診斷體系的成功建立，為移植排斥反應的無創(chuàng)診斷提供了新的研究思路。2005年，耶魯大學的Gil等通過對已知蛋白標記的篩選，成功建立了由Leptin,泌乳刺激素(prolactin),骨橋蛋白(osteopontin, 0ΡΝ)和胰島素樣生長因子II (IGF- II )組成的早期卵巣上皮癌的血清診斷體系，將診斷敏感度、特異性、陽性預測值(positive predictive value, PPV)和陰性預測值(negtive predictive value, NPV)分別提高至 95%、95%、95% 和 94%。因此，在鑒定移植 排斥特異性標志物的同時，對已知的移植排斥相關的生物標記進行篩選和組合，通過多分子綜合分析，建立排斥反應的聯(lián)合標志物群診斷和預警體系，具有更強的可行性和更高的敏感度。Luminex技術是ー種多功能的液相芯片分析平臺。它整和了有色微球(color-coded microsphere or bead)、激光技術、應用流體學、高速數字信號處理器和計算機運算法則，具有極高的檢測特異性和靈敏度。微球的顔色是通過兩種熒光染料染色得到的，調節(jié)兩種熒光染料的比例可以獲得100種不同顔色的微球，每種顏色的微球可以攜帶ー種生物探針。探針通過羧基結合到微球表面，因此ー個反應孔內可以完成100種不同的生物學反應。Luminex技術通過鑒定微球的顔色來確定反應類型，而對反應的定量分析是通過靶物質上的報告分子完成的。它具備多參數高通量分析、節(jié)約試劑和標本、操作簡單等多種優(yōu)勢。采用Luminex液態(tài)芯片系統(tǒng)定量檢測候選分子，只需30ul樣本即可同時檢測多個指標，在4小時內可以完成分析，靈敏度可以達到3pg/ml。

發(fā)明內容
本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提供ー種移植腎排斥反應早期診斷試劑盒；本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提供ー種移植腎排斥反應預警試劑盒；本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提供以上試劑盒的使用方法；本發(fā)明的第四發(fā)明目的在于提供蛋白SCF、sRAGE、CXCL7NAP2、CCL14 a-HCCUsCD40L、GCSF、GRO、IL-IRa、MCP3、IL-20、MIPId、IL-28A、IL-29IFNA I 在移植腎急性排斥反應或移植腎排斥反應預警中的應用。為了實現本發(fā)明的第一個發(fā)明目的，采用的技術方案為本發(fā)明涉及ー種移植腎排斥反應早期診斷試劑盒，所述試劑盒包括檢測移植腎排斥反應的蛋白的抗體，所述抗體選自抗EGF,抗Eotaxin,抗FGF-2,抗Flt_3 ligand,抗Fractalkine，抗 G-CSF,抗 GM-CSF,抗 GR0,抗 IFN- α 2，抗 IFN- Y，抗 IL-10，抗 IL-12 (ρ40)，抗 IL-12 (ρ70)，抗 IL-13,抗 IL-15,抗 IL-17，抗 IL-Ira,抗 IL-1 α，抗 IL-1 β，抗 IL-2，抗IL-3，抗 IL-4，抗 IL-5，抗 IL-6，抗 IL-T,抗 IL-8，抗 IL-9，抗 ΙΡ-10，抗 MCP-I,抗 MCP-3，抗 MDC (CCL22)，抗 MIP-I α，抗 MIP-I β，抗 PDGF-AA,抗 PDGF-AB/BB,抗 RANTES,抗 TGF- α，抗 TNF- α，抗 TNF- β，抗 VEGF,抗 sCD40L,抗 sIL_2R α，抗 6Ckine，抗 BCA-1,抗 CTACK,抗ENA-78，抗 Eotaxin-2，抗 Eotaxin-3，抗 1-309，抗 IL-16，抗 IL-20，抗 IL-21，抗 IL-23，抗IL-28a，抗 IL-33，抗 LIF，抗 MCP-2，抗 MCP-4，抗 ΜΙΡ-ld，抗 SCF，抗 SDF-ΙΑ+β，抗 TARC，抗TPO,抗 TRAIL,抗 TSLP，抗 GCP2,抗 HCC-1,抗 I-TAC,抗 IL-11,抗 IL-29,抗 Lymphotactin,抗 M-CSF,抗 MIG,抗 ΜΙΡ-3 α，抗 ΜΙΡ-3 β，抗 ΝΑΡ2,抗 sCD30 (sTNFRSF8)，抗 sEGFR,抗sIL-lRI(sCD121a),抗 sIL-lRII(sCD121b)，抗 sIL_2Ra (SCD25)，抗 sIL_4R(sCD124)，抗 sIL-6R(sCD126)，抗 sRAGE，抗 sTNFRI(sTNFRSFlA)，抗 sTNFRII(sTNFRSFIB)，抗sVEGFRl(sFlt-1),抗 sVEGFR2 (sFlk-1)，抗 sVEGFR3(sFlt-4)，抗 sgpl30，抗 MIF，抗PAI-I (Total),抗sFas,抗sFasL,抗sICAM-1或抗sVCAM-1抗體中的至少一種，優(yōu)選至少兩種抗體，更優(yōu)選至少3種抗體，再優(yōu)選至少4種抗體，最優(yōu)選至少5種抗體。本發(fā)明該技術方案的第一優(yōu)選技術方案為所述試劑盒包括檢測移植腎排斥反應的蛋白的抗體，所述抗體選自抗SCF，抗sEGFR,抗sIL-2Ra，抗sRAGE,抗sTNFRI,抗 STNFR2,抗 SVEGFR2,抗 sVCAMl,抗 sFas,抗 CCL14 a-HCC1,抗 sCD40L,抗 Eotaxin,抗FGF2,抗 Flt31igand,抗 Fracktalkine,抗 GCSF,抗 GR0,抗 IFN Y，抗 IL-IRa，抗 IL-3,抗IL-4,抗 IL-6，抗 IL-12p70，抗 IL-13，抗 IP10，抗 MIPl a，抗 VEGF，抗 BCA-1，抗 IL-16，抗 MIPld,抗 IL-20,抗 IL-28A,抗 CXCL9MIG，抗 CXCL111TAC 或抗 CCL19MIP3 β 中的至少ー種抗體，優(yōu)選至少兩種抗體，更優(yōu)選至少3種，再優(yōu)選至少4種，最優(yōu)選至少5種。本發(fā)明該技術方案的第三優(yōu)選技術方案為所述試劑盒還含有(I) 96孔濾膜板和兩張封板膜；(2)所述試劑盒中蛋白抗體的標準品；(3)質控對照；(4)血清基質；(5)實驗液；(6)洗液；(7) streptavidin-phycoerythrin (藻紅蛋白_鏈霉親合素)標記抗體；(8)珠子稀釋液；(9)權利要求I所述的檢測移植腎排斥反應的蛋白的抗體；( 10)預包被抗體的珠子。本發(fā)明該技術方案的第四優(yōu)選技術方案為所述試劑盒中(I)所述96孔濾膜板和兩張封板膜購自Millipore公司，貨號MX-PLATE ；(2)所述標準品購自 Millipore 公司，貨號 MXH8060, MXH8062, MXH8063, LHSP-8063和 HSCR-8032 ；(3)所述質控對照購自 Millipore 公司，貨號為MXH6060, MXH6062, MXH6063, LHSP-6063 和 HSCR-6032 ；(4)所述血清基質購自 Millipore 公司，貨號為MXHSM，LHSP-SM, HSCR-SM ；(5)所述實驗液購自Millipore公司，貨號L-AB ；(6)所述洗液購自Millipore公司，貨號L-WB ；(7)所述 streptavidin-phycoerythrin 標記抗體購自 Millipore 公司，貨號L-SAPE9, L-SAPE3, L-SAPE10, L-SAPElI, L-SAPE6 ；(8)所述珠子稀釋液購自Millipore公司，貨號LBD ；(9)檢測抗體購自 Millipore 公司，貨號 MXH1060，MXH1062, MXH1063,LHSP-1063, HSCR-1032 ；(10)所述預包被抗體的珠子購自Millipore公司，貨號MXHPMX39，MXHP2PMX23, HSP, HASP-PAII, MXH3PMX9, HSCRPMX14 為實現本發(fā)明的第二發(fā)明目的，采用的技術方案為ー種移植腎排斥反應預警試劑盒，所述試劑盒包括檢測移植腎排斥反應的蛋白的抗體，所述抗體選自抗EGF，抗Eotaxin,抗 FGF-2,抗 Flt-3 ligand,抗 Fractalkine,抗 G-CSF,抗 GM-CSF,抗 GR0,抗IFN- α 2，抗 IFN- Y，抗 IL-10，抗 IL-12 (ρ40)，抗 IL-12 (ρ70)，抗 IL-13，抗 IL-15，抗 IL-17， 抗 IL-Ira,抗 IL-I α，抗 IL-I β，抗 IL-2，抗 IL-3，抗 IL-4，抗 IL-5，抗 IL-6，抗 IL-T,抗IL-8，抗 IL-9，抗 IP-IO，抗 MCP-I,抗 MCP-3，抗 MDC(CCL22)，抗 MIP-I α，抗 MIP-I β，抗PDGF-AA，抗 PDGF-AB/BB，抗 RANTES，抗 TGF- α，抗 TNF- α，抗 TNF- β，抗 VEGF，抗 sCD40L，抗 sIL-2R α，抗 6Ckine,抗 BCA-1,抗 CTACK,抗 ENA-78,抗 Eotaxin-2,抗 Eotaxin-3,抗1-309，抗 IL-16,抗 IL-20,抗 IL-21，抗 IL-23，抗 IL_28a,抗 IL-33，抗 LIF,抗 MCP-2，抗 MCP-4，抗 MIP-ld，抗 SCF，抗 SDF-ΙΑ+β，抗 TARC，抗 ΤΡ0，抗 TRAIL,抗 TSLP，抗GCP2,抗 HCC-1,抗 I-TAC,抗 IL-11,抗 IL-29,抗 Lymphotactin,抗 M-CSF,抗 MIG,抗 ΜΙΡ-3 α，抗 ΜΙΡ-3 β，抗 ΝΑΡ2,抗 sCD30 (sTNFRSF8)，抗 sEGFR,抗 sIL-lRI (sCD121a)，抗 sIL-lRII(sCD121b),抗 sIL_2Ra (sCD25)，抗 sIL_4R(sCD124)，抗 sIL_6R(sCD126)，抗 sRAGE，抗 sTNFRI(sTNFRSFlA)，抗 sTNFRII(sTNFRSFIB)，抗 sVEGFRl(sFlt-1)，抗sVEGFR2 (sFlk-1)，抗 sVEGFR3 (sFlt-4)，抗 sgpl30,抗 MIF,抗 PAI-I (Total)，抗 sFas,抗sFasL，抗sICAM-I或抗sVCAM-1抗體中的至少ー種，優(yōu)選至少兩種抗體，更優(yōu)選至少3種抗體，再優(yōu)選至少4種抗體，最優(yōu)選至少5種抗體。本發(fā)明該技術方案的第一優(yōu)選技術方案為所述試劑盒包括檢測移植腎排斥反應的蛋白的抗體，所述抗體選自抗SCF，抗sEGFR，抗sIL-2Ra，抗SRAGE，抗sTNFRI，抗STNFR2，抗 SVEGFR2，抗 sVCAMl，抗 sFas，抗 CCL14 a -HCCl，抗 sCD40L，抗 Eotaxin，抗 FGF2，抗 Flt31igand,抗 Fracktalkine,抗 GCSF,抗 GR0,抗 IFN Y，抗 IL-IR α，抗 IL-3,抗 IL-4,抗 IL-6，抗 IL-12p70，抗 IL-13，抗 IP10，抗 MIPl α，抗 VEGF，抗 BCA-1，抗 IL-16，抗 MIPId，抗IL-20，抗IL-28A，抗CXCL9MIG，抗0乂ぼ111了4(或抗0(し1910 3 0中的至少ー種抗體，優(yōu)選至少兩種抗體，更優(yōu)選至少3種,再優(yōu)選至少4種,最優(yōu)選至少5種。本發(fā)明該技術方案的第二優(yōu)選技術方案為，所述試劑盒還含有 (I) 96孔濾膜板和兩張封板膜；( 2 )所述試劑盒中蛋白抗體的標準品；(3)質控對照；(4)血清基質；(5)實驗液；(6)洗液；(7) streptavidin-phycoerythrin 你I己抗體；(8)珠子稀釋液；
(9)權利要求10所述的檢測移植腎排斥反應的蛋白的抗體；( 10)預包被抗體的珠子。本發(fā)明該技術方案的第三優(yōu)選技術方案為所述試劑盒中(I)所述96孔濾膜板和兩張封板膜購自Millipore公司，貨號MX-PLATE ；(2)所述標準品購自 Millipore 公司，貨號 MXH8060, MXH8062, MXH8063, LHSP-8063和 HSCR-8032 ；(3)所述質控對照購自 Millipore 公司，貨號為MXH6060, MXH6062, MXH6063, LHSP-6063 和 HSCR-6032 ；
(4)所述血清基質購自 Millipore 公司，貨號為MXHSM，LHSP-SM, HSCR-SM ；(5)所述實驗液購自Mi 11 ipore公司，貨號L-AB ；(6)所述洗液購自Millipore公司，貨號L-WB ；(7)所述 streptavidin-phycoerythrin 標記抗體購自 Millipore 公司，貨號L-SAPE9, L-SAPE3, L-SAPE10, L-SAPElI, L-SAPE6 ；(8)所述珠子稀釋液購自Millipore公司，貨號LBD ；(9)檢測抗體購自 Millipore 公司，貨號 MXH1060，MXH1062, MXH1063,LHSP-1063, HSCR-1032 ；(10)所述預包被抗體的珠子購自Millipore公司，貨號MXHPMX39，MXHP2PMX23, HSP, HASP-PAII, MXH3PMX9, HSCRPMX14 為了實現本發(fā)明的第三個發(fā)明目的，采用的技術方案為本發(fā)明的試劑盒的使用方法為包括以下步驟(I)采集全血，室溫靜置，IOOOrpm離心5 15分鐘收取上清，分裝后冷凍保存?zhèn)溆茫?2)用實驗液或洗滌液預濕實驗板，置于振蕩器振搖5 20分鐘；吸走實驗板孔中的液體，吸干實驗板底；(3)相應孔分別加入梯度稀釋的標準品、質控對照和樣品；(4)在背景孔、標準品和質控對照孔中加入血清基質；(5)每孔加入珠子；(6)封板后將實驗板振搖4°C孵育過夜或室溫下孵育O. 5^2h ;吸走實驗板孔中的液體，吸干實驗板底；利用洗液洗滌實驗板兩次；(7)每孔加入相應的檢測抗體；室溫下振搖實驗板O. 5^2h ；(8)姆孔加入streptavidin-phycoerythrin標記抗體；室溫下振搖實驗板孵育2(T40min ;用洗液洗滌洗扳兩次；(9)每孔加入鞘液，檢測分析得到實驗結果。本發(fā)明所述的試劑盒的使用方法的第一優(yōu)選技術方案為，包括以下步驟(I)采集全血，室溫靜置Ih后，IOOOrpm離心10分鐘收取上清，分裝后_80°C冰箱保存?zhèn)溆?ml ；(2)應用200 μ I實驗液或洗滌液預濕實驗板，置于振蕩器振搖1(Γ15分鐘；應用負壓吸引器吸走實驗板孔中的液體，紙巾吸干實驗板底；(3)相應孔分別加入25 μ I梯度稀釋的標準品、質控對照和樣品；(4)在背景孔、標準品和質控對照孔中加入血清基質25 μ I ;
(5)姆孔加入25 μ I珠子；(6)封板后將實驗板置于振蕩器振搖4°C孵育過夜或室溫下孵育Ih ;應用負壓吸引器吸走實驗板孔中的液體，紙巾吸干實驗板底；每孔加入200μ I洗液，應用負壓吸引器吸走實驗板孔中的液體，紙巾吸干實驗板底，洗扳兩次；(7)每孔加入25 μ I檢測抗體，室溫下振蕩器振搖實驗板Ih ；(8)姆孔加入25 μ I streptavidin-phycoerythrin標記抗體,室溫下振蕩器振搖實驗板孵育30min ;每孔加入200 μ I洗液,應用負壓吸引器吸走實驗板孔中的液體,紙巾吸干實驗板底，洗扳兩次；(9)每孔加入150 μ I鞘液，流式點陣儀檢測，軟件分析，得到實驗結果。
本發(fā)明所述的試劑盒的使用方法的第二優(yōu)選技術方案為，在步驟(3)中標準品、質控對照和樣品的按照I :4 5的比例逐級稀釋。標準品和質控對照的初始濃度米用了 與 Luminex 檢測試劑盒 Human Cytokine/Chemokine (MPXHCYT0-60K) > HumanCytokine/Chemokine Panel II (MPXHCYP2-62K)、Human Cytokine/Chemokine Panel III(MPXHCYP3-63K)、Human Soluble Cytokine Receptor Panel (HSCR-32K-PMX 14)、HumanSepsis Panel I (HSEP-63K)中相同的濃度。本發(fā)明所述的試劑盒的使用方法的第三優(yōu)選技術方案為，在步驟(9)中所述的鞘液購自Iuminex公司，貨號為#40-50000。本發(fā)明所述的試劑盒的使用方法的第四優(yōu)選技術方案為，在步驟(9)中所述的流式點陣儀為luminex200，軟件為MILLIPLEX Analyst分析。本發(fā)明的第四發(fā)明目的在于提供蛋白SCF、sRAGE、CXCL7NAP2、CCL14 a -HCCUsCD40L、GCSF、GRO、IL-IRa、MCP3、IL-20、MIPId、IL-28A、IL-29IFNA I 在移植腎急性排斥反應或移植腎排斥反應預警中的應用。其中，所述的蛋白的篩選方法為首先，采集腎移植受者的移植術后多個時間點的血清，并對臨床病例進行分析和分組；然后應用Luminex系統(tǒng)對各組血清中96種細胞因子及趨化因子的表達水平進行檢測；最后，統(tǒng)計學方法篩選出移植排斥反應相關的標志物，聯(lián)合應用這些標志物群，建立以多因子綜合分析為特征的移植腎排斥反應的診斷和預警體系O本發(fā)明應用美國密理博公司(Millipore)的Luminex檢測試劑盒MPXHCYT0-60K、MPXHCYP2PMX23、MPXHCYP2-62K、MPXHCYP3-63K、HSCR-32K-PMX14、HSEP-63K-06，共檢測 96種細胞因子、細胞因子受體以及趨化因子在急性排斥反應組和移植腎功能穩(wěn)定組病人血清中的表達水平。具體實驗過程見各試劑盒說明書。應用統(tǒng)計學分析軟件SPSS16. O對檢測數據進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后，非正態(tài)分布資料應用minitabl5. O進行數據轉換，經數據轉換后為正態(tài)分布的應用T檢驗分析急性排斥反應組和移植腎功能穩(wěn)定組間表達水平有顯著性差異的標記物，未能轉換為正態(tài)分布的資料經非參分析的方法分析表達水平有顯著性差異的標記物。分析后共得到 35 個有顯著性差異的標記物SCF, sEGFR, sIL_2Ra，sRAGE, sTNFRI, sTNFR2, sVEGFR2,sVCAMl, sFas, CCL14a -HCCl, sCD40L，Eotaxin, FGF2, Flt31igand, Fracktalkine, GCSF,GRO, IFNy , IL-IRa，IL-3, IL-4, IL-6, IL_12p70, IL-13, ΙΡΙΟ,ΜΙΡΙ a ,VEGF,BCA-1, IL-16,MIPId, IL-20, IL-28A, CXCL9MIG, CXCLl 11TAC, CCL19MIP3 β。其中，蛋白 SCF, 11 sRAGE,CXCL7NAP2, CCL14a -HCCl, sCD40L, GCSF, GRO, IL-IRa ， MCP3, IL-20, MIPId, IL-28A，IL-29IFNA I未見有在移植腎急性排斥反應或移植腎排斥反應預警中的報道。下面對本發(fā)明的內容進行詳細說明發(fā)明人應用液態(tài)蛋白質芯片Iuminex檢測技術對142例急性移植腎排斥反應病人和移植腎功能穩(wěn)定的移植受者共266份血清中的96種細胞因子/趨化因子及其受體的表達水平進行了監(jiān)測和綜合分析，建立了含至少ー種聯(lián)合標志物的移植腎排斥反應預警系統(tǒng)和含至少ー種因子聯(lián)合標志物的移植腎排斥反應早期診斷系統(tǒng)，對急性排斥反應的預測和準確率達到98. 6%，內部交叉驗證率分別為97. 1%和97. 2%。其中，優(yōu)選的，移植腎排斥反應預警系統(tǒng)中優(yōu)選含有至少3種所述的蛋白抗體，移植腎排斥反應早期診斷系統(tǒng)含有至少4種所述的蛋白抗體。其中，所述試劑盒中所含有的本發(fā)明所述的蛋白因子越多，其準確度越高，但會增加實際操作中的復雜性。
本發(fā)明所述的標記物蛋白的篩選過程為( I)采集腎移植受者的移植術前及術后多個時間點的血清、尿樣和PBMC，并對臨床病例進行分析和分組。(2)應用Luminex系統(tǒng)對各組血清和尿液中96種細胞因及趨化因子的表達水平進行檢測。(3)統(tǒng)計學方法(ANOVA)篩選出移植排斥反應相關的標志物，聯(lián)合應用這些標志物群，建立以多因子綜合分析為特征的移植腎排斥反應的診斷和預警體系。本發(fā)明的試劑盒是在美國密理博公司(Mi 11 ipore )的Luminex檢測試劑盒Human Cytokine/Chemokine (MPXHCYT0-60K)、Human Cytokine/Chemokine Panel II(MPXHCYP2-62K)、Human Cytokine/Chemokine Panel III (MPXHCYP3-63K)、Human SolubleCytokine Receptor Panel (HSCR-32K-PMX14)> Human Sepsis Panel I (HSEP-63K)的基礎上，對急性移植腎排斥反應病人和移植腎功能穩(wěn)定的移植受者血清中的96種細胞因子/趨化因子及其受體的表達水平進行了分析得到的，本發(fā)明試劑盒中的試劑的大部分購自Millipore公司，公眾可通過本發(fā)明中公開的貨號從市場上購得。Luminex檢測試劑盒的原理為雙抗體夾心法。本發(fā)明通過建立排斥反應的聯(lián)合標志物群診斷和預警體系，具有更強的可行性和更高的敏感度。


圖I為實施例2中移植腎排斥反應早期診斷試劑盒的診斷曲線下面積圖；圖2為實施例3中移植腎排斥反應早期診斷試劑盒的診斷曲線下面積圖；圖3為實施例5中移植腎排斥反應預警試劑盒的診斷曲線下面積圖；圖4為實施例6中移植腎排斥反應預警試劑盒的診斷曲線下面積圖；圖5為移植腎功能穩(wěn)定組和急性移植腎排斥反應組在早期診斷系統(tǒng)中各因子在血清中的濃度比較圖，其中O為穩(wěn)定組，I為排斥組；圖6為移植腎功能穩(wěn)定組和急性移植腎排斥反應組在預警系統(tǒng)中各因子在血清中的濃度比較圖，其中O為穩(wěn)定組，I為排斥組。以下具體實施方式
僅對本發(fā)明的內容做進ー步的解釋和說明，并不對本發(fā)明的內容構成限制。
具體實施例方式實施例I移植腎排斥反應早期診斷試劑盒顯著性差異標記物的篩選I、采集腎移植受者的移植術后多個時間點的血清，并對臨床病例進行分析和分組。I. I選取術前基礎病或者并發(fā)癥少，手術未發(fā)生嚴重并發(fā)癥的移植腎受者，分別在腎移植受者移植術后I天、7天、14天、21天、28天、2個月、3個月 12個月采集全血2ml，室溫靜置Ih后，IOOOrpm離心10分鐘收取上清，分裝后_80°C冰箱保存?zhèn)溆?。另外隨時收取 急性排斥反應組患者在急性排斥反應確診后的血清。I. 2根據腎移植患者血清肌酐、尿素氮、移植腎B超、臨床表現、穿刺病理診斷結果和激素沖擊治療是否有效等綜合分析和病例篩選，將收集病例分為兩組急性排斥反應組和移植腎功能穩(wěn)定組。急性排斥反應組33例，移植腎功能穩(wěn)定組38例。I. 3急性排斥反應組入組標準①未發(fā)生腎移植外科并發(fā)癥、感染以及其他嚴重并發(fā)癥的腎移植患者；②活檢穿刺病理診斷為急性排斥反應的病例；③未經活檢穿刺的病例根據臨床診斷和激素沖擊治療的有效性進行判斷腎移植患者血清肌酐>120μ mol/L，尿素氮>8. 3mmol/L，移植腎B超顯示移植腎體積増大、血流減少、血管阻力増加，臨床表現為發(fā)熱，伴乏力關節(jié)酸痛、體重増加、血壓升高、尿量減少和移植腎脹痛等，穿刺病理診斷結果為急性排斥反應，激素沖擊治療后血清肌酐下降10%以上。1.4移植腎功能穩(wěn)定組入組標準①未發(fā)生腎移植外科并發(fā)癥、感染以及其他嚴重并發(fā)癥的腎移植患者；②未發(fā)生排斥反應；③移植腎功能恢復較快(14天內血清肌酐降至正常(〈120 μ mol/L))。2、應用Luminex系統(tǒng)對各組血清中96種細胞因子及趨化因子的表達水平進行檢測。2. I選取移植腎功能穩(wěn)定組病人血清肌酐恢復正常時(腎移植木后7天或14天)的血清樣本共38份急性排斥反應組發(fā)生排斥反應并確診后時收取的血清32份；2. 2應用美國密理博公司(Millipore) Luminex檢測試劑盒(MPXHCYT0-60K、MPXHCYP2PMX23、MPXHCYP2-62K、MPXHCYP3-63K、HSCR-32K-PMX14、HSEP-63K-06)共檢測 96種細胞因子、細胞因子受體以及趨化因子在急性排斥反應組和移植腎功能穩(wěn)定組病人血清中的表達水平；具體實驗過程見各試劑盒說明書；其中，移植腎功能穩(wěn)定組和急性移植腎排斥反應組早期診斷系統(tǒng)中各因子在血清中的濃度比較如圖5所示，其中O為穩(wěn)定組，I為排斥組；簡要實驗過程為應用assay buffer200 μ I預濕實驗板，置于振蕩器振搖10分鐘后應用負壓吸引器吸走實驗板孔中的液體，紙巾吸干實驗板底后分別加入25μ I梯度稀釋的標準品、對照和樣品，隨后每孔加入25μ I珠子，封板后將實驗板置于振蕩器振搖4°C孵育過夜，洗板后加入檢測抗體，室溫振蕩器振搖實驗板lh，再加入streptavidin-phycoerythrin 標記抗體后孵育 30min,洗板后 luminex200 上機檢測，MILLIPLEX Analyst 軟件分析；3、統(tǒng)計學方法篩選出移植排斥反應相關的標志物，聯(lián)合應用這些標志物群，建立以多因子綜合分析為特征的移植腎排斥反應的診斷體系。應用統(tǒng)計學分析軟件SPSS16. O對檢測數據進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后，非正態(tài)分布資料應用minitabl5. O進行數據轉換，經數據轉換后為正態(tài)分布的應用T檢驗分析急性排斥反應組和移植腎功能穩(wěn)定組間表達水平有顯著性差異的標記物，未能轉換為正態(tài)分布的資料經非參分析的方法分析表達水平有顯著性差異的標記物。分析后共得到35個有顯著性差異的標記物SCF, sEGFR, sIL-2Ra，sRAGE, sTNFRI, sTNFR2, sVEGFR2, sVCAMl,sFas, CCL14 a -HCCI, sCD40L, Eotaxin, FGF2, Flt31igand, Fracktalkine, GCSF, GRO, IFNy，IL-IR a，IL-3, IL-4, IL-6, IL_12p70, IL-13, IP10, MIPl a，VEGF, BCA-1, IL-16, MIPId, IL-20，IL-28A, CXCL9MIG, CXCLl11TAC, CCL19MIP3β。
實施例2將實施例I得到的35個有顯著性差異的標記物進行分析，對這些表達水平有顯著性差異的標記物進行Iogstic回歸分析后得到4個因子SCF、sEGFR、sIL2Ralpha和Eotaxin組成的移植腎急性排斥反應的預警診斷系統(tǒng)，統(tǒng)計學分析得到預測陽性率為
91.4。ROC診斷曲線下面積為97. 5%，見附圖I。其中，試劑盒的具體組成為(1)96孔濾膜板和兩張封板膜；購自Millipore公司，貨號MX-PLATE ；(2)所述試劑盒中蛋白抗體的標準品；購自Millipore公司，貨號MXH8060，MXH8062，MXH8063, LHSP-8063 和 HSCR-8032 ；(3)質控對照；購自 Millipore 公司，貨號為MXH6060, MXH6062, MXH6063, LHSP-6063 和 HSCR-6032 ；(4)血清基質；購自 Millipore 公司，貨號為MXHSM，LHSP-SM, HSCR-SM ；(5)實驗液；購自Millipore公司，貨號L-AB ；(6)洗液；購自 Millipore 公司，貨號 L-WB ；(7)streptavidin-phycoerythrin 標記抗體；購自 Millipore 公司，貨號 L-SAPE9,L-SAPE3, L-SAPE10, L-SAPElI, L-SAPE6 ；(8)珠子稀釋液；液購自Millipore公司，貨號LBD ；(9)抗SCF的抗體、抗sEGFR的抗體、抗sIL2Ralpha的抗體和抗Eotaxin的抗體；購自 Millipore 公司，貨號 MXH1060，MXH1062, M皿063，LHSP-1063, HSCR-1032 ；(10)預包被抗體的珠子，購自Millipore公司，貨號L-AB ；貨號MXHPMX39，MXHP2PMX23, HSP, HASP-PAII, MXH3PMX9, HSCRPMX14。實施例3 :移植腎急性排斥反應早期診斷試劑盒的組成將實施例I得到的35個有顯著性差異的標記物進行分析，對這些表達水平有顯著性差異的標記物進行Iogstic回歸分析后得到14個因子sTNFR2、Flt3Ligand、Fractalkine、ILlra、IL2、MDC、MIPlalpha、SDFlalphabeta、TARC、TRAIL、SCF、CCL20、MIP3alpha和XCLlLymphotactin ;統(tǒng)計學分析得到早期診斷系統(tǒng)預測陽性率為98. 6%，ROC診斷曲線下面積為99. 8%，見附圖2。其中，試劑盒的具體組成為
(1)96孔濾膜板和兩張封板膜；購自Millipore公司，貨號MX-PLATE ；(2)所述試劑盒中蛋白抗體的標準品；購自Millipore公司，貨號MXH8060，MXH8062，MXH8063, LHSP-8063 和 HSCR-8032 ；(3)質控對照；購自 Millipore 公司，貨號為MXH6060, MXH6062, MXH6063, LHSP-6063 和 HSCR-6032 ；(4)血清基質；購自 Millipore 公司，貨號為MXHSM，LHSP-SM, HSCR-SM ；(5)實驗液;購自Millipore公司，貨號L-AB ；(6)洗液；購自 Millipore 公司，貨號 L-WB ； (7)streptavidin-phycoerythrin 標記抗體；購自 Millipore 公司，貨號 L-SAPE9,L-SAPE3, L-SAPE10, L-SAPElI, L-SAPE6 ；(8)珠子稀釋液；液購自Millipore公司，貨號LBD ；(9)抗 sTNFR2 的抗體、抗 Flt3Ligand 的抗體、抗 Fractalkine 的抗體、抗 ILlra的抗體、抗IL2的抗體、抗MDC的抗體、抗MIPlalpha的抗體、抗SDFlalphabeta的抗體、抗TARC的抗體、抗TRAIL的抗體、抗SCF的抗體、抗CCL20的抗體、抗MIP3alpha的抗體和抗 XCLlLymphotactin 的抗體；購自 Millipore 公司，貨號 MXH1060，MXH1062, MXH1063,LHSP-1063, HSCR-1032 ；(10)預包被抗體的珠子，購自Millipore公司，貨號L-AB ；貨號MXHPMX39，MXHP2PMX23, HSP, HASP-PAII, MXH3PMX9, HSCRPMX14。實施例4移植腎排斥反應預警試劑盒的顯著性差異標記物的篩選I、采集腎移植受者的移植術后多個時間點的血清，并對臨床病例進行分析和分組。I. I選取術前基礎病或者并發(fā)癥少，手術未發(fā)生嚴重并發(fā)癥的移植腎受者，分別在腎移植受者移植術后I天、7天、14天、21天、28天、2個月、3個月…12個月采集全血2ml，室溫靜置Ih后，IOOOrpm離心10分鐘收取上清，分裝后_80°C冰箱保存?zhèn)溆?。另外隨時收取急性排斥反應組患者在急性排斥反應確診后的血清。I. 2根據腎移植患者血清肌酐、尿素氮、移植腎B超、臨床表現、穿刺病理診斷結果和激素沖擊治療是否有效等綜合分析和病例篩選，將收集病例分為兩組急性排斥反應組和移植腎功能穩(wěn)定組。急性排斥反應組33例，移植腎功能穩(wěn)定組38例。1.3急性排斥反應組入組標準①未發(fā)生腎移植外科并發(fā)癥、感染以及其他嚴重并發(fā)癥的腎移植患者。②活檢穿刺病理診斷為急性排斥反應的病例③未經活檢穿刺的病例根據臨床診斷和激素沖擊治療的有效性進行判斷腎移植患者血清肌酐>120μ mol/L，尿素氮>8. 3mmol/L，移植腎B超顯示移植腎體積増大、血流減少、血管阻力増加，臨床表現為發(fā)熱，伴乏力關節(jié)酸痛、體重増加、血壓升高、尿量減少和移植腎脹痛等，穿刺病理診斷結果為急性排斥反應，激素沖擊治療后血清肌酐下降10%以上；1.4移植腎功能穩(wěn)定組入組標準①未發(fā)生腎移植外科并發(fā)癥、感染以及其他嚴重并發(fā)癥的腎移植患者。②未發(fā)生排斥反應③移植腎功能恢復較快(14天內血清肌酐降至正常(〈120 μ mol/L))
2、應用Luminex系統(tǒng)對各組血清中96種細胞因子及趨化因子的表達水平進行檢測。2. I選取移植腎功能穩(wěn)定組病人血清肌酐恢復正常時(腎移植木后7天或14天)的血清樣本共38份急性排斥反應組發(fā)生排斥反應并確診后時收取的血清32份2. 2應用美國密理博公司(Millipore) Luminex檢測試劑盒MPXHCYT0-60K、MPXHCYP2PMX23、MPXHCYP2-62K、MPXHCYP3-63K、HSCR-32K-PMX14、HSEP-63K-06 ;共檢測 96種細胞因子、細胞因子受體以及趨化因子在急性排斥反應組和移植腎功能穩(wěn)定組病人血清中的表達水平。具體實驗過程見各試劑盒說明書。其中，移植腎功能穩(wěn)定組和急性移植腎排斥反應組在預警系統(tǒng)中各因子在血清中的濃度比較如圖6所示，其中O為穩(wěn)定組，I為排斥組；簡要實驗過程應用assay buff er200 μ I預濕實驗板，置于振蕩器振搖10 分鐘后應用負壓吸引器吸走實驗板孔中的液體，紙巾吸干實驗板底后分別加入25 μ I梯度稀釋的標準品、對照和樣品，隨后每孔加入25 μ I珠子，封板后將實驗板置于振蕩器振搖4°C孵育過夜，洗板后加入檢測抗體，室溫振蕩器振搖實驗板lh，再加入streptavidin-phycoerythrin 標記抗體后孵育 30min,洗板后 luminex200 上機檢測，MILLIPLEX Analyst 軟件分析3、統(tǒng)計學方法篩選出移植排斥反應相關的標志物，聯(lián)合應用這些標志物群，建立以多因子綜合分析為特征的移植腎排斥反應預警體系。應用統(tǒng)計學分析軟件SPSS16. O對檢測數據進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后，非正態(tài)分布資料應用minitabl5. O進行數據轉換，經數據轉換后為正態(tài)分布的應用T檢驗分析急性排斥反應組和移植腎功能穩(wěn)定組間表達水平有顯著性差異的標記物，未能轉換為正態(tài)分布的資料經非參分析的方法分析表達水平有顯著性差異的標記物。分析后共得到35個有顯著性差異的標記物SCF, sEGFR, sIL-2Ra，sRAGE, sTNFRI, sTNFR2, sVEGFR2, sVCAMl,sFas, CCL14 a -HCCI, sCD40L, Eotaxin, FGF2, Flt31igand, Fracktalkine, GCSF, GRO, IFNy，IL-IR a，IL-3, IL-4, IL-6, IL_12p70, IL-13, IP10, MIPl a，VEGF, BCA-1, IL-16, MIPId, IL-20，IL-28A, CXCL9MIG, CXCLl11TAC, CCL19MIP3β。實施例5移植腎排斥反應預警試劑盒將實施例4得到的35個有顯著性差異的標記物進行分析，對這些表達水平有顯著性差異的標記物進行Iogstic回歸分析后得到3個因子IL-lRa，s⑶40L和IL-20組成的移植腎急性排斥反應的預警診斷系統(tǒng)，統(tǒng)計學分析得到預測陽性率為91. 4。ROC診斷曲線下面積為97. 5%，見附圖3。其中，試劑盒的具體組成為(I) 96孔濾膜板和兩張封板膜；購自Millipore公司，貨號MX-PLATE ；(2)所述試劑盒中蛋白抗體的標準品；購自Millipore公司，貨號ΜΧΗ8060，ΜΧΗ8062，ΜΧΗ8063, LHSP-8063 和 HSCR-8032 ；(3)質控對照；購自 Millipore 公司，貨號為MXH6060, MXH6062, MXH6063, LHSP-6063 和 HSCR-6032 ；(4)血清基質；購自 Millipore 公司，貨號為MXHSM，LHSP-SM, HSCR-SM ；(5)實驗液;購自Millipore公司，貨號L-AB ；
(6)洗液；購自 Millipore 公司，貨號 L-WB ；(7)streptavidin-phycoerythrin 標記抗體；購自 Millipore 公司，貨號 L-SAPE9,L-SAPE3, L-SAPE10, L-SAPElI, L-SAPE6 ；(8)珠子稀釋液；液購自Millipore公司，貨號LBD ；(9)抗IL-IRa的抗體，抗sCD40L的抗體和抗IL-20的抗體；購自Millipore公司，貨號 MXH1060，MXH1062, MXH1063, LHSP-1063, HSCR-1032 ；(10)預包被抗體的珠子，購自Millipore公司，貨號L-AB ;貨號MXHPMX39，MXHP2PMX23, HSP, HASP-PAII, MXH3PMX9, HSCRPMX14。實施例6移植腎排斥反應預警試劑盒 將實施例4得到的35個有顯著性差異的標記物進行分析，對這些表達水平有顯著性差異的標記物進行Iogstic回歸分析后得到11個因子sIL-1R1，sVCAMl, SICAM-I,Fracktalkine, IL-IRa，IP10, MDC, MIPla，SDF α β，TRAIL 和 SCF 組成的移植腎急性排斥反應的預警診斷系統(tǒng)，統(tǒng)計學分析得到預測陽性率為98. 6%，ROC診斷曲線下面積為
99.8%。，見附圖4。其中，試劑盒的具體組成為(1)96孔濾膜板和兩張封板膜；購自Millipore公司，貨號MX-PLATE ；(2)所述試劑盒中蛋白抗體的標準品；購自Millipore公司，貨號MXH8060，MXH8062，MXH8063, LHSP-8063 和 HSCR-8032 ；(3)質控對照；購自 Millipore 公司，貨號為MXH6060, MXH6062, MXH6063, LHSP-6063 和 HSCR-6032 ；(4)血清基質；購自 Millipore 公司，貨號為MXHSM，LHSP-SM, HSCR-SM ；(5)實驗液；購自Millipore公司，貨號L-AB ；(6)洗液；購自 Millipore 公司，貨號 L-WB ；(7)streptavidin-phycoerythrin 標記抗體；購自 Millipore 公司，貨號 L-SAPE9,L-SAPE3, L-SAPE10, L-SAPElI, L-SAPE6 ；(8)珠子稀釋液；液購自Millipore公司，貨號LBD ；(9)抗 sIL-lRI 的抗體，抗 sVCAMl 的抗體,抗 SICAM-1 的抗體,抗 Fracktalkine的抗體,抗IL-IRa的抗體，抗IPlO的抗體，抗MDC的抗體，抗MIPl a的抗體，抗SDFa^的抗體，抗TRAIL的抗體和抗SCF的抗體；購自Millipore公司，貨號MXH1060，MXH1062,MXH1063, LHSP-1063, HSCR-1032 ；(10)預包被抗體的珠子，購自Millipore公司，貨號L-AB ；貨號MXHPMX39，MXHP2PMX23, HSP, HASP-PAII, MXH3PMX9, HSCRPMX14。
權利要求
1.一種移植腎排斥反應預警試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測移植腎排斥反應的蛋白的抗體，所述抗體為 sIL-lRl，sVCAMl, SICAM-I，Fracktalkine, IL-IRa，IP10,MDC, MIPl a，SDF a ^ , TRAIL 和 SCF。
2.根據權利要求I所述的移植腎排斥反應預警試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還含有 (1)96孔濾膜板和兩張封板膜； (2)所述試劑盒中蛋白抗體的標準品； (3)質控對照； (4)血清基質； (5)實驗液； (6)洗液； (7)藻紅蛋白-鏈霉親合素標記抗體； (8)珠子稀釋液； (9)權利要求I所述的檢測移植腎排斥反應的蛋白的抗體； (10)預包被抗體的珠子。
3.根據權利要求2所述的移植腎排斥反應預警試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中 (1)所述96孔濾膜板和兩張封板膜購自Millipore公司，貨號MX-PLATE； (2)所述標準品購自Millipore 公司，貨號 MXH8060, MXH8062, MXH8063, LHSP-8063 和HSCR-8032 ； (3)所述質控對照購自Millipore 公司，貨號為MXH6060, MXH6062, MXH6063, LHSP-6063 和 HSCR-6032 ； (4)所述血清基質購自Millipore公司，貨號為MXHSM，LHSP-SM,HSCR-SM ； (5)所述實驗液購自Millipore公司，貨號L-AB； (6)所述洗液購自Millipore公司，貨號L-WB； (7)所述藻紅蛋白-鏈霉親合素標記抗體購自Millipore公司，貨號L-SAPE9，L-SAPE3，L-SAPE10, L-SAPElI, L-SAPE6 ； (8)所述珠子稀釋液購自Millipore公司，貨號LBD； (9)檢測抗體購自Millipore 公司，貨號 MXH1060，MXH1062，MXH1063，LHSP-1063, HSCR-1032 ； (10)所述預包被抗體的珠子購自Millipore公司，貨號MXHPMX39，MXHP2PMX23,HSP,HASP-PAII, MXH3PMX9, HSCRPMX14。
4.權利要求I所述試劑盒的使用方法，其特征在于 (1)采集全血，室溫靜置，IOOOrpm離心5 15分鐘收取上清，分裝后冷凍保存?zhèn)溆茫? (2)用實驗液或洗滌液預濕實驗板，置于振蕩器振搖5 20分鐘；吸走實驗板孔中的液體，吸干實驗板底； (3)相應孔分別加入梯度稀釋的標準品、質控對照和樣品； (4)在背景孔、標準品和質控對照孔中加入血清基質； (5)每孔加入珠子； (6)封板后將實驗板振搖4°C孵育過夜或室溫下孵育0.5 2h ;吸走實驗板孔中的液體，吸干實驗板底；利用洗液洗滌實驗板兩次； (7)每孔加入相應的檢測抗體；室溫下振搖實驗板O.5 2h ; (8)每孔加入藻紅蛋白-鏈霉親合素標記抗體；室溫下振搖實驗板孵育20 40min;用洗液洗滌洗扳兩次； (9)每孔加入鞘液，檢測分析得到實驗結果。
5.根據權利要求4所述的試劑盒的使用方法，其特征在于 (1)采集全血，室溫靜置Ih后，IOOOrpm離心10分鐘收取上清，分裝后_80°C冰箱保存?zhèn)溆?ml ； (2)應用200μ I實驗液或洗滌液預濕實驗板，置于振蕩器振搖10 15分鐘；應用負壓吸引器吸走實驗板孔中的液體，紙巾吸干實驗板底； (3)相應孔分別加入25μ I梯度稀釋的標準品、質控對照和樣品； (4)在背景孔、標準品和質控對照孔中加入血清基質25μI ; (5)姆孔加入25μ I珠子； (6)封板后將實驗板置于振蕩器振搖4°C孵育過夜或室溫下孵育Ih;應用負壓吸引器吸走實驗板孔中的液體，紙巾吸干實驗板底；每孔加入200μ I洗液，應用負壓吸引器吸走實驗板孔中的液體，紙巾吸干實驗板底，洗扳兩次； (7)每孔加入25μ I檢測抗體，室溫下振蕩器振搖實驗板Ih ； (8)每孔加入25μ I藻紅蛋白-鏈霉親合素標記抗體，室溫下振蕩器振搖實驗板孵育30min ;每孔加入200 μ I洗液,應用負壓吸引器吸走實驗板孔中的液體,紙巾吸干實驗板底，洗扳兩次； (9)每孔加入150μ I鞘液，流式點陣儀檢測，軟件分析，得到實驗結果。
6.根據權利要求4所述的使用方法，其特征在于，在步驟(3)中標準品、質控對照和樣品的按照I :4 5的比例逐級稀釋。
7.根據權利要求4所述的使用方法，其特征在于，在步驟(9)中所述的鞘液購自Iuminex 公司，貨號為 #40-50000。
8.根據權利要求4所述的使用方法，其特征在于，在步驟(9)中所述的流式點陣儀為luminex200,軟件為 MILLIPLEX Analyst 分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預警試劑盒，具體講，涉及一種移植腎排斥反應預警試劑盒及其使用方法。應用液態(tài)蛋白質芯片luminex檢測技術對142例急性移植腎排斥反應病人和移植腎功能穩(wěn)定的移植受者共266份血清中的96種細胞因子/趨化因子及其受體的表達水平進行了監(jiān)測和綜合分析，建立了一種移植腎排斥反應早期診斷系統(tǒng)，對急性排斥反應的預測和準確率達到98.6%，內部交叉驗證率分別為97.1%和97.2%。
文檔編號G01N33/53GK102854306SQ20121027436
公開日2013年1月2日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權日2011年12月23日
發(fā)明者石炳毅, 許曉光, 黃海燕 申請人:中國人民解放軍第三〇九醫(yī)院