專利名稱：一種直接測定土壤植酸酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植酸酶活性測定，具體的說是一種直接測定土壤植酸酶活性的方法。
背景技術(shù)：
植酸酶屬于磷酸單酯水解酶，是一類特殊的酸性磷酸酶，可催化植酸以及植酸鹽水解成肌醇與磷酸鹽。1968年,Shien等確定第一個被分離純化的植酸酶來源于土曲霉,并且從68個土樣中對2000個菌株進行研究發(fā)現(xiàn)，在所得的22株黑曲霉中有21株能產(chǎn)生植酸酶。從此以后，陸續(xù)從十幾種微生物中分離得到植酸酶。植酸酶主要來源于微生物。微生物來源的植酸酶分解植酸鹽的最終產(chǎn)物主要是單磷酸肌醇和無機正磷酸鹽。植酸及其鹽類廣泛存在于植物組織和相應(yīng)的糧食產(chǎn)品中，占其總量的1_3%，其中磷含量占植物總磷的60-90%，是磷和肌醇的主要儲存形式。植酸酶是催化植酸水解成肌醇與磷酸的一類酶的總稱，因此，植酸酶已在飼料和食品工業(yè)中廣泛地得到應(yīng)用。而對植酸酶活性的檢測成為衡量 飼料、食品、土壤等中的磷素可利用性的一項重要指標。目前在植酸酶活性的檢測工作中，常使用紫外分光光度法對酶反應(yīng)產(chǎn)物正磷酸鹽進行檢測，并根據(jù)植酸酶活性單位的定義，由磷標準曲線計算出待檢植酸酶的活性。世界公認的測定方法中，被廣泛認可和使用較多的方法是Gostbrocades和BASF公司1991年提出的植酸酶活性的測定方法，但此方法在操作上仍存在不簡便，方法穩(wěn)定性不夠，測定結(jié)果誤差相對較大等缺點。而目前對于土壤中的植酸酶活性的測定方法仍沒有形成一套完整且效果較好的體系，更多的是將土壤制成懸濁液后取定量懸液進行培養(yǎng)測定，而此方法操作不簡便，誤差較大，不能夠完全真實的反應(yīng)土壤植酸酶活性特征。因此，建立一種對土壤植酸酶活性的直接測定方法，提高土壤植酸酶活性測定的效率和準確性，對于評價土壤磷素利用狀況具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種直接測定土壤植酸酶活性的方法。為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種直接測定土壤植酸酶活性的方法，將甲苯加入到待測定土壤中，而后進行底物培養(yǎng)在待測土壤中加入PH5. 5的乙酸緩沖液、植酸鈉；待培養(yǎng)終止加入顯色液終止酶促反應(yīng)并顯色，顯色后在415nm下測定顯色液吸光度，即可獲得土壤植酸酶。所述待測定土壤過篩后稱取I. OOg加入O. 2mL甲苯抑制土壤微生物活性。所述底物培養(yǎng)是向經(jīng)甲苯處理過的測定土壤中加入O. 25mol Ι^ρΗδ. 5的乙酸緩沖液后，再加入2mL濃度O. 00761mol Γ1的植酸鈉溶液，輕搖混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)在30-40°C恒溫條件下密閉培養(yǎng)O. 5-1. 5小時。所述待培養(yǎng)終止加入顯色液終止酶促反應(yīng)并顯色，是將底物培養(yǎng)后待測定土壤中加入2mL的顯色液，搖勻顯色20 - 30min后過濾，取上清液在415nm下測定吸光度。所述顯色液為鑰酸銨溶液(100g L—1)、釩酸銨溶液(2. 35g L—1)和稀硝酸(濃硝酸水=1:2的混合液，所述鑰酸銨溶液、釩酸銨溶液和稀硝酸按體積比為1:1:2的混合。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點I.本發(fā)明采用甲苯抑制土壤中的微生物活性，控制了土壤微生物在對植酸酶活性測定過程中的影響。2.本發(fā)明直接將土壤進行培養(yǎng)，調(diào)節(jié)植酸酶最適pH以及最適溫度，使土壤中的植酸酶活性得到最真實的表達。3.本發(fā)明采用終止/顯色液，既是酶促反應(yīng)終止液，又是產(chǎn)物反應(yīng)液，同時顏色反應(yīng)不受溫度和時間限制，操作穩(wěn)定可靠。


圖I為本發(fā)明實施例提供的不同土壤植酸酶活性特征圖。 具體實施方式
本發(fā)明采用甲苯抑制土壤中的微生物活性，從而控制微生物活動對酶活測定的影響；然后，在土壤中加入pH5. 5的乙酸緩沖液，再加入底物植酸鈉進行培養(yǎng)；培養(yǎng)后加入終止/顯色液，終止反應(yīng)并顯色，在415nm下測定吸光度即可獲得土壤植酸酶活性。具體方法詳述如下I)甲苯殺死微生物以及底物培養(yǎng)稱取I. OOg鮮待測土倒入50mL三角瓶中，用移液槍小心加入O. 2mL甲苯，迅速塞上瓶塞(注意試驗防護，甲苯有毒)。向處理過的土壤樣品中加入4mL0. 25mol Γ1 ρΗ5. 5的乙酸緩沖液，搖勻后，再加入2mL濃度O. 00761mol Γ1的植酸鈉溶液，輕搖混勻后塞上瓶塞放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)在30-40°C條件下培養(yǎng)O. 5-1. 5小時。其中，O. 25mol Γ'ρΗδ. 5的乙酸緩沖液是將34. 02g三水乙酸鈉和I. 24mL濃鹽酸加去離子水，用冰醋酸和氫氧化鈉調(diào)PH值至5. 50定容至IOOOmL(現(xiàn)配現(xiàn)用);植酸鈉溶液是稱取7. 81g質(zhì)量純度為90%植酸鈉加入乙酸緩沖液用冰乙酸或氫氧化鈉調(diào)pH至5. 5后定容至IOOOmL(現(xiàn)配現(xiàn)用)。在實驗過程中需設(shè)置對照組實驗，用以消除土壤的本底值對試驗數(shù)據(jù)的影響，即在操作過程中用2mL乙酸緩沖液代替植酸鈉溶液，其他操作同實驗組。2)終止/顯色測定將經(jīng)過步驟I)培養(yǎng)后的樣品取出，迅速加入2mL的終止/顯色液，搖勻顯色20-30min后用定性濾紙過濾,取濾液在415nm下測定吸光度。其中，終止/顯色液是體積比為鑰酸銨溶液(鑰酸銨溶液濃度為IOOg Γ1):釩酸銨溶液(釩酸銨溶液
2.358^):稀硝酸(稀硝酸由濃硝酸和水體積比，濃硝酸水=1:2) =1:1:2的混合液。3)植酸酶活性計算公式酶活(FTU/g)={(P-P0) XV}/ (mXh)式中P----測定實驗組總憐量/ U mo I P0――測定對照組總磷量/ μ molV——所加溶液總體積/mLm——干土重量/gh----培養(yǎng)時間/小時酶活單位μmol Pireleased g_1 dry soil tf1。實施例I采集不同土壤(黑土、褐土和棕壤)鮮土,過2mm篩后各稱取I. OOg于50mL三角瓶中，加入O. 2mL甲苯，4mL緩沖溶液，2mL植酸鈉溶液，輕搖混勻塞上瓶塞在37° C下培養(yǎng)I小時，取出，加入2mL終止/顯色液，搖勻，顯色20min，過濾，取濾液在415nm下測定吸光度，即可計算得到土壤植酸酶活性。其中，O. 25moir1 pH5. 5的乙酸緩沖液是將34. 02g三水乙酸鈉和I. 24mL濃鹽酸加去離子水，用冰醋酸和氫氧化鈉調(diào)pH值至5. 50定容至IOOOmL (現(xiàn)配現(xiàn)用)；植酸鈉溶液是稱取7. 81g90%植酸鈉加入乙酸緩沖液用冰乙酸或氫氧化鈉調(diào)pH至5. 5后定容至IOOOmL(現(xiàn)配現(xiàn)用)利用紫外分光光度計測定實施例I不同土壤(黑土、褐土和棕壤)植酸酶活性并進行運算結(jié)果(見圖I)。由圖I可知，植酸酶活性在黑土中為5. 2 μ mol Pireleased g_1drysoil h \ 揭土為 6· I μ mol Pi released g 1 dry soil h \ 掠壤為 I. 3 μ mol Pi releasedg_1dry soil IT1。各土壤植酸酶活性之間存在一定的差異,表明該方法能夠用來直接測定且準確表達不同土壤的植酸酶活性特征。
實施例2采集白衆(zhòng)土表層0-20cm鮮土,過2mm篩后稱取I. OOg于50mL三角瓶中，加入0. 2mL甲苯，4mL緩沖溶液，2mL植酸鈉溶液，輕搖混勻塞上瓶塞在35° C下培養(yǎng)I. 5小時，取出，力口入2mL終止/顯色液，搖勻，顯色30min，過濾，取濾液在415nm下測定吸光度，即可計算得到
土壤植酸酶活性。其中，0. 25mol L—1 pH 5. 5的乙酸緩沖液是將34. 02g三水乙酸鈉和I. 24mL濃鹽酸加去離子水，用冰醋酸和氫氧化鈉調(diào)pH值至5. 50定容至IOOOmL(現(xiàn)配現(xiàn)用);植酸鈉溶液是稱取7. 81g 90%植酸鈉加入乙酸緩沖液用冰乙酸或氫氧化鈉調(diào)pH至5. 5后定容至IOOOmL(現(xiàn)配現(xiàn)用)
權(quán)利要求
1.一種直接測定土壤植酸酶活性的方法，其特征在于將甲苯加入到待測定土壤中，而后進行底物培養(yǎng)在待測土壤中加入PH5. 5的乙酸緩沖液、植酸鈉；待培養(yǎng)終止加入顯色液終止酶促反應(yīng)并顯色，顯色后在415nm下測定顯色液吸光度，即可獲得土壤植酸酶。
2.按權(quán)利要求I所述的直接測定土壤植酸酶活性的方法，其特征在于所述待測定土壤過篩后稱取I. OOg加入O. 2mL甲苯抑制土壤微生物活性。
3.按權(quán)利要求I所述的直接測定土壤植酸酶活性的方法，其特征在于所述底物培養(yǎng)是向經(jīng)甲苯處理過的測定土壤中加入O. 25mol L_1pH5. 5的乙酸緩沖液后,再加入2mL濃度O. 00761mol Γ1的植酸鈉溶液，輕搖混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)在30 - 40°C恒溫條件下密閉培養(yǎng)O. 5 - I. 5小時。
4.按權(quán)利要求I所述的直接測定土壤植酸酶活性的方法，其特征在于所述待培養(yǎng)終止加入顯色液終止酶促反應(yīng)并顯色，是將底物培養(yǎng)后待測定土壤中加入2mL的顯色液，搖勻顯色20 - 30min后過濾，取上清液在415nm下測定吸光度。
5.按權(quán)利要求I或4所述的直接測定土壤植酸酶活性的方法，其特征在于所述顯色液為鑰酸銨溶液、釩酸銨溶液和稀硝酸的混合液，所述鑰酸銨溶液、釩酸銨溶液和稀硝酸按體積比為1:1:2的混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及植酸酶活性測定，具體的說是一種直接測定土壤植酸酶活性的方法。將甲苯加入到待測定土壤中，而后進行底物培養(yǎng)在待測土壤中加入pH5.5的乙酸緩沖液、植酸鈉；待培養(yǎng)終止加入顯色液終止酶促反應(yīng)并顯色，顯色后在415nm下測定顯色液吸光度，即可獲得土壤植酸酶。本發(fā)明對土壤中的植酸酶采用直接培養(yǎng)的方法進行測定，操作簡便又穩(wěn)定可靠，基本上達到了對土壤植酸酶活性測定有效、快速的目的。適于對土壤植酸酶活性的直接測定。
文檔編號G01N21/31GK102866150SQ20121027558
公開日2013年1月9日 申請日期2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月3日
發(fā)明者張艾明, 陳振華, 陳利軍, 梁文舉 申請人:中國科學院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所