專利名稱：基于近紅外光譜鑒別轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物的檢測領域，尤其涉及基于近紅外光譜鑒別轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的方法。
背景技術(shù)：
水稻是我國第一大糧食作物，年產(chǎn)量約占糧食總產(chǎn)量的38%，其生產(chǎn)關(guān)系著 國家的糧食安全。轉(zhuǎn)基因技術(shù)突破了水稻傳統(tǒng)育種的限制，為保障我國的糧食安全提供了新的途徑。隨著水稻基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因水稻的研究成果斐然。近20年來，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成功研發(fā)出抗蟲、抗病、抗除草劑、抗逆境和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因水稻，獲得了大量目標性狀遺傳和表達穩(wěn)定、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因水稻株系。隨著大量轉(zhuǎn)基因作物逐步走向市場，轉(zhuǎn)基因作物和轉(zhuǎn)基因作物加工的食物的安全性問題也開始受人們的關(guān)注。從本質(zhì)上講，轉(zhuǎn)基因作物和常規(guī)育成的作物品種沒有差別。常規(guī)育種一般是通過有性雜交來實現(xiàn)，而植物基因工程則是用農(nóng)桿菌、基因槍、電激、微注射等技術(shù)將外源重組DNA導入植物基因組中，盡管從理論上講，轉(zhuǎn)基因的遺傳特性及表型應該可以更加精確地預測，在應用上更為安全，但對轉(zhuǎn)基因作物進行安全性仍然很有必要。轉(zhuǎn)基因成分檢測方法，可分為定性檢測法和定量檢測法。目前常用的轉(zhuǎn)基因作物檢測方法有PCR檢測法、化學組織檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法、外源基因整合鑒定法、Westren雜交法、生物測定檢測法等。常規(guī)的一些轉(zhuǎn)基因植物的檢測方法已經(jīng)不能滿足目前快速、準確檢測的需要，這些方法有的需要轉(zhuǎn)膜、雜交，操作繁瑣、費用高，有的不適合批量樣本的檢測，嚴重限制了其應用。轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢是操作簡便、費用較低、適用性強。申請公布號為CN 102081075A的發(fā)明專利申請公開了一種鑒別轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括(I)分別測定非轉(zhuǎn)基因水稻C418和待檢測水稻限定條件下人工培養(yǎng)生長6周葉中莽草酸和半乳糖醛酸的含量；(2)如果待檢測水稻的莽草酸和半乳糖醛酸的含量相比非轉(zhuǎn)基因水稻的莽草酸和半乳糖醛酸的含量有顯著性下降，則待檢測水稻是轉(zhuǎn)基因水稻；由于莽草酸和半乳糖醛酸的檢測方法較為復雜，致使此發(fā)明操作步驟繁瑣，耗時長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了基于近紅外光譜鑒別轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的方法，該方法能夠快速、無損、簡便的鑒別轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻。一種基于近紅外光譜鑒別轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括以下步驟(I)向水稻種子樣本發(fā)射波數(shù)范圍為4000 lOOOOcnT1的近紅外光譜，并采集所有水稻種子樣本的漫反射光譜信息；(2)分別對所有的水稻種子樣本的漫反射光譜信息進行預處理，利用主成分分析法提取特征光譜區(qū)段中的光譜特征信息，選取主成分，并獲取各個主成分的得分；(3)以所有水稻種子樣本光譜信息對應的各個主成分得分作為輸入，以水稻種子樣本對應的水稻種子類型設定值作為輸出，建立模型；(4)按照步驟(I) (2)的操作獲取待測水稻種子光譜的各個主成分得分，將其帶入(3)中所述模型，獲得待測水稻種子類型。漫反射光是近紅外光進入待測樣品內(nèi)部后，經(jīng)過多次反射、折射、衍射、吸收，與待測樣品內(nèi)部分子發(fā)生了相互作用后返回至檢測器的光，因此漫反射光譜信息負載了待測樣品的結(jié)構(gòu)和組成信息。由于轉(zhuǎn)基因水稻種子和非轉(zhuǎn)基因水稻種子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和組成有所差另O，結(jié)合光譜信息處理技術(shù)，可提取出差別信息，并通過有效的數(shù)據(jù)處理方法將光譜圖像信息間的細小差異進一步突出顯示，轉(zhuǎn)變?yōu)榭勺R別的信號，用于轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因水稻的鑒別。
步驟(I)中，所述水稻種子樣本為轉(zhuǎn)基因水稻種子樣本和非轉(zhuǎn)基因水稻種子樣本，轉(zhuǎn)基因水稻為轉(zhuǎn)蛋白基因水稻或轉(zhuǎn)調(diào)控基因水稻。步驟(2)中，為了去除高頻隨機噪聲、基線漂移、樣本不均勻等因素的影響，需要對光譜進行預處理。光譜預處理方法的選取影響著預處理效果以及光譜有效信息的提取，通過比較分析，預處理方法優(yōu)選為標準正態(tài)變換法。所述特征光譜區(qū)段是指轉(zhuǎn)基因水稻種子和非轉(zhuǎn)基因水稻種子光譜信息中存在較為明顯區(qū)別的區(qū)段，通過對光譜區(qū)段光譜信息進行數(shù)字化處理，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻種子和非轉(zhuǎn)基因水稻種子的鑒別；本發(fā)明中所述特征光譜區(qū)段優(yōu)選為波數(shù)范圍為4000 lOOOOcnT1 或 4000 8000CHT1 的光譜區(qū)段。利用主成分分析法提取光譜特征信息，主成分分析(PCA)的目的是將光譜數(shù)據(jù)降維，把原變量轉(zhuǎn)換成一組彼此正交的新變量的線性組合，消除了多變量共存中相互重疊的信息，同時，新變量能最大限度地表征原變量的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特征。由于主成分分析法的新變量數(shù)量少、彼此不相關(guān)，更有利于對光譜信息的分析。主成分分析方法可在Unscrambler軟件(由美國CAMO制造)上實現(xiàn)。主成分的選取與原始信息的有效提取密切相關(guān)，在選擇主成分時，取累計貢獻率>85%，但主成分選取不宜過多，否則會引入不必要的噪聲并造成過擬合；采用的標準正態(tài)變換進行預處理時，通過比較分析，主成分數(shù)優(yōu)選為4 8。步驟(2)優(yōu)選為利用標準正態(tài)變換法分別對所有的水稻種子樣本的漫反射光譜圖進行預處理，利用主成分分析法提取預處理后的波數(shù)范圍為4000 SOOOcnT1光譜信息中的光譜特征信息，選取5個主成分，并獲取各個主成分的得分。步驟(2)優(yōu)選為利用標準正態(tài)變換法分別對所有的水稻種子樣本的漫反射光譜圖進行預處理，利用主成分分析法提取預處理后的波數(shù)范圍為4000 lOOOOcnT1光譜信息中的光譜特征信息，選取6個主成分，并獲取各個主成分的得分。步驟(3)中，水稻種子樣本對應的水稻種子類型為轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因，在模型中可設置轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的設定值分別為-I和I。所述模型優(yōu)選為偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型，PLS-DA法是基于PLS回歸的一種判別分析方法，在構(gòu)造因素時因考慮到了輔助矩陣以代碼形式提供的類成員信息，因此具有聞效的鑒別能力，可提聞水稻類型鑒別的精確度。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為
(I)本發(fā)明操作簡單、省時省力，僅需獲取水稻種子的近紅外光譜，即可進行轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因水稻的鑒別；(2)本發(fā)明鑒別精度高、結(jié)果可靠，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因水稻的快速、無損鑒別。


圖I為實施例I驗證集中轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻預測值和實際值回歸圖。
具體實施例方式實施例II、建立模型 (I)分別選取80粒轉(zhuǎn)基因水稻種子和40粒非轉(zhuǎn)基因水稻種子作為水稻種子樣本，利用Nicolet Nexus870 (Thermo Corporation USA)傅里葉變換近紅外光譜儀向水稻種子樣本發(fā)射波數(shù)范圍為4000 lOOOOcnT1的近紅外光譜，利用OMNIC 6. O軟件采集所有水稻種子樣本的漫反射光譜圖；設置近紅外光譜儀掃描次數(shù)32次，分辨率4CHT1。采集時室溫控制在25 °C左右，濕度保持穩(wěn)定。以上轉(zhuǎn)基因水稻為轉(zhuǎn)TCTP基因水稻和轉(zhuǎn)0smil66基因水稻，其獲取方法可為轉(zhuǎn)基因材料分別采用水稻的成熟胚為外植體誘導、培養(yǎng)愈傷組織，挑選胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，通過包含植物表達載體P1301-TCTP和pl301-mil66的根癌農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化到水稻愈傷中，經(jīng)一系列篩選分化得到轉(zhuǎn)基因水稻。非轉(zhuǎn)基因水稻為中花11水稻。(2)利用標準正態(tài)變換法分別對所有的水稻種子樣本的漫反射光譜圖進行預處理，得到預處理后的光譜信息；利用Unscrambler軟件中的主成分分析法提取各個預處理后的波數(shù)范圍為4000 lOOOOcnT1光譜信息中的光譜特征信息,選取主成分數(shù)為6,獲取各個主成分的得分(如表I所示)；(3)以所有水稻種子樣本光譜信息對應的各個主成分得分作為輸入，以水稻種子樣本對應的水稻種子類型設定值作為輸出，建立PLS-DA模型；水稻種子樣本對應的水稻種子類型設定值設置如下轉(zhuǎn)TCTP基因水稻和轉(zhuǎn)mi 166基因水稻設定為-I，非轉(zhuǎn)基因水稻設定為I。限于篇幅，僅將其中20粒水稻種子樣本的數(shù)據(jù)列于此，見表I。表I用于模型建立的部分數(shù)據(jù)庫
Πζ ΠζΓΤ5 Πζ
~ I. 3530-O. 79300. 77001.08200. 3880-O. 1170
~2I. 17000. 58900. 7120-0.85400.8270-O. 5790
32.04501.2560-0.0391-0.97100. 5480-O. 7620
~-0.4370-O. 15201.08500.48200.4580-O. 3600
權(quán)利要求
1.一種基于近紅外光譜鑒別轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)向水稻種子樣本發(fā)射波數(shù)范圍為4000 lOOOOcnT1的近紅外光譜，并采集所有水稻種子樣本的漫反射光譜信息； (2)分別對所有的水稻種子樣本的漫反射光譜信息進行預處理，利用主成分分析法提取預處理后的特征光譜區(qū)段中的光譜特征信息，選取主成分，并獲取各個主成分的得分； (3)以所有水稻種子樣本光譜信息對應的各個主成分得分作為輸入，以水稻種子樣本對應的水稻種子類型設定值作為輸出，建立模型； (4)按照步驟(I) (2)的操作獲取待測水稻種子光譜的各個主成分得分，將其帶入(3)中所述模型，獲得待測水稻種子類型。
2.如權(quán)利要求I所述的基于近紅外光譜鑒別轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于，步驟(2)中，預處理方法為標準正態(tài)變換法。
3.如權(quán)利要求I所述的基于近紅外光譜鑒別轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述特征光譜區(qū)段為波數(shù)范圍為4000 lOOOOcnT1的光譜區(qū)段。
4.如權(quán)利要求I所述的基于近紅外光譜鑒別轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述特征光譜區(qū)段為波數(shù)范圍為4000 SOOOcnT1的光譜區(qū)段。
5.如權(quán)利要求I所述的基于近紅外光譜鑒別轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于，步驟(2)中，主成分數(shù)為4 8。
6.如權(quán)利要求3或4所述的基于近紅外光譜鑒別轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于，步驟(2)中，主成分數(shù)為5。
7.如權(quán)利要求I所述的基于近紅外光譜鑒別轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述模型為偏最小二乘判別分析模型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于近紅外光譜鑒別轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括以下步驟(1)向水稻種子樣本發(fā)射近紅外光譜，并采集所有水稻樣本的漫反射光譜信息；(2)分別對所有的水稻種子樣本的漫反射光譜信息進行預處理，利用主成分分析法提取預處理后的特征光譜區(qū)段的光譜特征信息，選取主成分，并獲取各個主成分的得分；(3)以所有水稻種子樣本光譜信息對應的各個主成分得分作為輸入，以水稻種子樣本對應的水稻種子類型設定值作為輸出，建立模型；(4)獲取待測水稻種子光譜的各個主成分得分，將其帶入(3)中所述模型，獲得待測水稻種子類型。本發(fā)明鑒別精度高、操作簡單、成本低，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的快速、無損鑒別。
文檔編號G01N21/35GK102841072SQ20121028638
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月13日
發(fā)明者朱誠, 張龍, 丁艷菲, 王珊珊 申請人:中國計量學院