專利名稱：一種黃連木芽染色體制片的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃連木芽染色體制片的方法。
背景技術(shù)：
黃連木(Pistacia chinensis Bunge)原產(chǎn)我國，它雌雄異株,又名偕木、偕樹等，屬于漆樹科黃連木屬落葉喬木。它耐干旱、鹽堿、瘠薄，適應(yīng)性強，分布范圍廣，是一種優(yōu)良的綠化、用材、觀賞、藥用和油料樹種。黃連木果實含油量35%，是制取生物柴油的上佳原料，已被專家列為未來20年最具有發(fā)展?jié)摿Φ纳锊裼驮蠘浞N之一，對解決目前及將來的能源危機(jī)具有重要的作用。

目前在我國掀起了有關(guān)黃連木研究的熱潮，現(xiàn)有技術(shù)中采用先直接酸解或先酸解再酶解的做法使得染色體分散不均；此外由于黃連木的染色體微小，只有1-2 ym，而現(xiàn)有技術(shù)中水解時間控制不當(dāng)，當(dāng)水解時間不足時，染色質(zhì)也著色，會使反差降低；而水解時間過長，細(xì)胞質(zhì)雖不著色，染色體染色也會較淡，無法清晰觀察到黃連木的染色體形態(tài)及數(shù)目。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，找到一種操作簡單方便的黃連木芽染色體的制片方法，使獲得的染色體分散均勻，背景淺，易于觀察，得出的染色體數(shù)目準(zhǔn)確度高。本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下
A、取材每年四月中上旬上午9-10時取黃連木樹上新生的嫩芽，沿嫩芽腹線縱向切割成兩部分作為材料；
B、預(yù)處理將切割好的嫩芽用蒸餾水清洗干凈，再用吸水紙吸干水分，之后放入濃度為
O.002 mol/L的8-羥基喹啉溶液中，放到暗處預(yù)處理2 h 50 min ；
C、固定將預(yù)處理后的嫩芽用吸水紙吸干，除去殘余的預(yù)處理液后放入卡諾氏I固定液中，在4°C冰箱中固定2 h 20 min，固定好后的材料轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存?zhèn)溆茫?br> D、酶解將固定好的嫩芽用蒸餾水漂洗3次，每次10min,吸干水分后放入2%纖維素酶溶液中，之后放入30°C水浴鍋中酶解40 min ；
E、再固定將酶解后的嫩芽再用卡諾氏I固定液固定20min ；
F、解離將再固定后的材料放入Imol/L鹽酸溶液中，然后放在60°C水浴鍋中解離5min,解離后用蒸餾水漂洗2次，每次5 min ；
G、染色將解離后的嫩芽置于載玻片上，取出呈現(xiàn)乳白色的組織塊，用吸水紙吸干組織塊周圍的水分，再用解剖刀將取下的組織塊切割成碎塊，滴入1-2滴卡寶品紅染色劑，染色15 min，然后用蒸餾水漂洗干凈；
H、壓片將材料重新移至載玻片上，搗碎組織塊，并使其均勻分散在載玻片上，蓋上蓋玻片，置于酒精燈上微熱，使細(xì)胞進(jìn)一步軟化和增強染色，靜置片刻，在蓋玻片上放一張濾紙，并用左手食指壓緊，右手持帶橡皮的鉛筆的橡皮頭端先輕后重的敲擊蓋片，使細(xì)胞壓平，然后放置在平整的桌面上，用拇指壓緊蓋玻片；I、鏡檢將壓片置于生物顯微鏡下觀察，選擇染色體分散、清晰的細(xì)胞在顯微攝影裝置下進(jìn)行顯微照相，以便進(jìn)行染色體計數(shù)，同時可用記號筆在載玻片和蓋玻片上分別做記號，以便再次觀察和照相方便查找。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了一種適宜黃連木芽染色體制片的方法，先用2%纖維素酶溶液將固定好的嫩芽酶解,去掉細(xì)胞壁纖維,使細(xì)胞分散好,也使染色體分散空間更大。再通過將預(yù)處理后的嫩芽放在卡諾氏I固定液中，在4°C冰箱中固定，保留了分裂圖象，呈現(xiàn)出染色體真實形態(tài)及結(jié)構(gòu)。然后將再固定后的材料放入I mol/L鹽酸溶液中，在60°C水浴鍋中酸解，可以使分生區(qū)組織細(xì)胞間的果膠質(zhì)分解，細(xì)胞壁軟化或部分分解，使細(xì)胞和染色體容易壓平。通過采用先酶解再固定最后酸解的方法使得染色體分散均勻；通過HCl水解時間嚴(yán)密的控制，使得染色體和背景顏色反差較大，能夠簡便、清晰的觀察到黃連木的染色體。采用本方法制片得出的黃連木染色體清晰，準(zhǔn)確度較高，為后續(xù)的核型分析、G帶、C帶分析等細(xì)胞生物學(xué)研究打下基礎(chǔ)，對于了解黃連木的遺傳背景，進(jìn)而進(jìn)行有選擇的雜交育種具有重要的意義，同時對黃連木細(xì)胞遺傳學(xué)的理論研究也具有重要的意義。


圖I 是黃連木 iPistacia chinensis Bunge)的染色體在 OLYMPUS CX/MD50(10X100)顯微攝影裝置照相示意圖。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例做詳細(xì)說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。實施例I
成功觀察并統(tǒng)計出了黃連木芽染色體的數(shù)目
A、取材采取黃連木樹上新生的嫩芽，沿嫩芽腹線縱向切割成兩部分；
B、預(yù)處理將切割好的用蒸餾水清洗干凈，吸水紙吸干水分后放入濃度為O.002 mol/L的8-羥基喹啉溶液中，在暗處預(yù)處理2 h 50 min ；
C、固定將預(yù)處理過的嫩芽用吸水紙吸干，除去殘余的預(yù)處理液后放入卡諾氏I固定液中，在4°C冰箱中固定2 h20 min，固定好后的材料轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存?zhèn)溆茫?br> D、酶解將固定好的嫩芽用蒸餾水漂洗3次，每次10min，吸干水分后放入2%纖維素酶溶液中，在30°C水浴鍋中酶解40 min ；
E、再固定酶解后的嫩芽再用卡諾氏I固定液固定20min ；
F、解離將在固定后的材料用Imol/L鹽酸60°C水浴鍋中解離5 min，解離后用蒸餾水漂洗2次，每次5 min ；
G、染色將解離后的嫩芽置于載玻片上，用尖頭鑷子挑選呈現(xiàn)出乳白色的組織塊，用吸水紙吸干組織塊周圍的水分，解剖刀切割成碎塊，滴入2滴卡寶品紅染色劑,染色15 min ；
H、壓片將材料重新移至載玻片上，用尖頭鑷子的后端搗碎組織塊，并使其均勻分散，蓋上蓋玻片；置于酒精燈上微熱，使細(xì)胞進(jìn)一步軟化和增強染色；靜置片刻，在蓋玻片上放一張濾紙，并用左手食指壓緊，右手持帶橡皮的鉛筆的橡皮頭端先輕后重的敲擊蓋片，使細(xì)胞壓平，放置在平整的桌面上，用大拇指壓緊蓋玻片；
I、鏡檢將壓片置于XSP-35生物顯微鏡下觀察鏡檢，選擇染色體分散、清晰的細(xì)胞在OLYMPUS CX/MD50顯微攝影裝置下進(jìn)行顯微照相，以便進(jìn)行染色體計數(shù)。同時可用記號筆在載玻片和蓋玻片上分別做記號，以便再次觀察和照相，鏡檢結(jié)果見圖I。上述實施例結(jié)果表 明，本方法是一種有效的黃連木芽染色體制片的方法，并且該制片方法操作簡單方便，染色體分散均勻且背景較淺，染色體數(shù)目容易計數(shù)，采用本方法制片得出的染色體數(shù)目準(zhǔn)確度高。
權(quán)利要求
1. 一種黃連木芽染色體制片的方法，其特征是 A、取材每年四月中上旬上午9-10時取黃連木樹上新生的嫩芽，沿嫩芽腹線切割成兩部分； B、預(yù)處理將切割好的嫩芽用蒸餾水清洗干凈，吸水紙吸干水分后放入濃度為O.002mol/L的8-羥基喹啉溶液中，在暗處預(yù)處理2 h 50 min ； C、固定將預(yù)處理后的嫩芽用吸水紙吸干，除去殘余的預(yù)處理液后放入卡諾氏I固定液中，在4°C冰箱中固定2 h 20 min,固定好后的材料轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存?zhèn)溆茫? D、酶解將固定好的嫩芽用蒸餾水漂洗3次，每次10min,吸干水分后放入2%纖維素酶溶液中，在30°C水浴鍋中酶解40 min ； E、再固定將酶解后的嫩芽再用卡諾氏I固定液固定20min ； F、解離將再固定后的材料放入Imol/L鹽酸溶液中，在60°C水浴鍋中解離5 min，解離后用蒸餾水漂洗2次，每次5 min ； G、染色將解離后的嫩芽置于載玻片上，取呈現(xiàn)出乳白色的組織塊，用吸水紙吸干組織塊周圍的水分，用解剖刀將取下的組織塊切割成碎塊，滴入1-2滴卡寶品紅染色劑，染色15min,然后用蒸懼水漂洗； H、壓片將材料重新移至載玻片上，搗碎組織塊，并使其均勻分散在載玻片上，蓋上蓋玻片，置于酒精燈上微熱，使細(xì)胞進(jìn)一步軟化和增強染色，靜置片刻，在蓋玻片上放一張濾紙，并用左手食指壓緊，右手持帶橡皮的鉛筆的橡皮頭端先輕后重的敲擊蓋片，使細(xì)胞壓平，然后放置在平整的桌面上，用拇指壓緊蓋玻片； I、鏡檢將壓片置于生物顯微鏡下觀察，選擇染色體分散、清晰的細(xì)胞在顯微攝影裝置下進(jìn)行顯微照相，以便進(jìn)行染色體計數(shù)，同時用記號筆在載玻片和蓋玻片上分別做記號。
全文摘要
本發(fā)明提供一種黃連木芽染色體制片的方法，采用0.002mol/L的8-羥基喹啉溶液進(jìn)行低溫預(yù)處理；卡諾氏固定液固定；2%纖維素酶30℃水浴鍋中酶解40min，再用卡諾氏固定液固定20min，1mol/L鹽酸60℃水浴中解離5min，用蒸餾水漂洗；將組織塊切割成碎塊，卡寶品紅染色劑染色15min；壓片法制片，鏡檢，在OLYMPUSCX/MD50顯微攝影裝置下進(jìn)行顯微照相。本發(fā)明的制片方法操作簡單方便，確定了進(jìn)行黃連木芽染色體制片的最佳取材時間、取材部位以及制片方法，使獲得的染色體分散均勻，背景淺，易于觀察，得出的染色體數(shù)目準(zhǔn)確度高。
文檔編號G01N1/30GK102830002SQ201210299270
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月22日
發(fā)明者施江, 王小燕, 王曉凌, 辛莉, 高雙成, 史國安 申請人:河南科技大學(xué)