專利名稱：通過測定半乳糖苷凝集素-3或者血小板反應蛋白-2的水平鑒定具有發(fā)生心力衰竭風險的 ...的制作方法
通過測定半乳糖苷凝集素-3或者血小板反應蛋白-2的水平鑒定具有發(fā)生心力衰竭風險的受試者的方法本發(fā)明涉及鑒定具有發(fā)生高血壓性終末器官損害風險(如充血性心力衰竭)的受試者的方法。充血性心力衰竭(HF)是一種常見但是嚴重和復雜的臨床綜合征，特別是在老年人中，特征為心臟收縮功能減退，運動承受力減弱，導致患者病情逐漸惡化，經(jīng)常產(chǎn)生心血管死亡。因此，大量患者在確診后的I到5年內(nèi)死亡。但是，盡管相當多的患者逐漸出現(xiàn)危及生命的并發(fā)癥，其他患者可能在較長時間內(nèi)保持穩(wěn)定。具有發(fā)生高血壓性終末器官損害例如心力衰竭風險的患者的早期鑒定可能防止病情迅速發(fā)展，因此最好在心力衰竭確實出現(xiàn)之前鑒定有可能出現(xiàn)心力衰竭的患者。此外，優(yōu)選地是能夠鑒定具有發(fā)生嚴重并發(fā)癥風險的患有心力衰竭的患者。目前的方法可以可靠地排除心力衰竭但是不能可靠地證明心力衰竭的存在，也不能預測已經(jīng)存在的心力衰竭的結(jié)果，或者需要昂貴的儀器和經(jīng)過特殊訓練的人員才能進行預測。因此需要簡單可靠的方法，預測心力衰竭發(fā)生的可能性以及已經(jīng)出現(xiàn)的心力衰竭的結(jié)果。本發(fā)明的目的是提供一種方法，通過這種方法可以鑒定具有發(fā)生高血壓性終末器官損害(例如心力衰竭)特別風險的患者，或者鑒定具有發(fā)生心力衰竭并發(fā)癥特別風險的患者。在鑒定之后，例如可以在心力衰竭或者其并發(fā)癥出現(xiàn)之前對這些患者進行治療，這具有巨大的臨床重要性。這通過本發(fā)明，通過提供一種方法實現(xiàn)，該方法用于鑒定具有發(fā)生高血壓性終末器官損害風險的受試者，包括以下的步驟(a)獲得所述受試者的生物樣品；(b)確定所述樣品中至少一種非肌細胞標記的水平；(C)將所述標記的水平與標準水平進行比較；以及(d)確定標記的水平是否預示發(fā)生高血壓性終末器官損害的風險。在產(chǎn)生本發(fā)明的研究中確定了特異的標記，這些標記可以用于預測哪些肥厚的心臟有衰竭的傾向。已知高血壓導致心臟肥厚，這是心力衰竭的最重要的風險因子之一。但是，不是所有的肥厚心臟最終都會衰竭。這些觀察結(jié)果提示除了導致肥厚的機制以外，在代償性心臟肥厚到衰竭的發(fā)展過程中還有其他機制在起作用。盡管最近的研究報導了導致心臟肥厚的許多分子和細胞的改變(Lorell BH等，Circulation 102 :470-479, 2000 ;Panidis 等，J AmColl Cardiol. 3 :1309-1320，1984)，至今仍然不清楚導致心力衰竭的其他因素。Boluyt及其同事已經(jīng)舉例證明了在具有心力衰竭的自發(fā)性高血壓大鼠中編碼胞外基質(zhì)組分的基因上調(diào)(Boluyt 等，Cardiovasc Res. 46 :239-249, 2000 ；Hypertension30 1362-1368,1997 ；Cardiovasc Res. 30 :836-840,1995 ；Eur Heart J. 16 suppl. N 19-30,1995).但是并不清楚這些基因的過量表達先于心力衰竭顯著的臨床綜合征出現(xiàn)，還是只是已經(jīng)出現(xiàn)的活性衰竭過程的結(jié)果。還使用了一些其他無偏方法確定心力衰竭的特異機制(Korstin S等，CircRes. 92 :715-724,2003 ；Hein S 等，Circulation 107 984_991，2003)。此外，最近的研究已經(jīng)顯示在衰竭的心臟中免疫機制被特異地激活(Vasan RS等，Circulation 107 1486-1491,2003)。但是這些以前的研究經(jīng)常將末期以及經(jīng)藥物治療的心肌與正常的心肌比較。因此得到的差異可能是衰竭及其治療引起的，因此這些研究沒有鑒定可能導致代償性肥厚心臟衰竭的因素，這些因素可用作鑒定具有發(fā)病風險的患者的標記。在產(chǎn)生本發(fā)明的研究中，將來自正在衰竭的肥厚心臟的大量基因的基因表達譜與仍然保持代償?shù)姆屎裥呐K(的基因)進行比較。這樣鑒定了在正在衰竭的與代償性肥厚的心臟中差異表達的基因。特別地，本發(fā)明基于下列發(fā)現(xiàn)，即特殊的非肌細胞基因在患病的心臟組織中有異常表達(實施例1和2)。根據(jù)本發(fā)明，使用非肌細胞(non-myocytical)標記。即標記來自非心肌細胞的細胞。這具有下列優(yōu)勢，即本發(fā)明的方法“探測”的是已知在應激肌細胞中出現(xiàn)的肌細胞變化(myoctic change)以外的其他過程。這使得不僅僅有機會確診心臟衰竭，而且還可以連續(xù)監(jiān)測已知患有心臟衰竭的病人，即監(jiān)測是否出現(xiàn)有可能預示重大有害事件的不利的非肌細胞過程(例如炎癥、瘢痕化等等)。根據(jù)本發(fā)明的方法，自個體患者采取生物學樣品。接下來，通過眾所周知的技術(shù)測量在所述的樣品中一個或者多個標記的水平。通常，將這一水平與標準的水平進行比較，以確定標記的水平是否是該個體可能出現(xiàn)心力衰竭的預示。標準水平基于所述標記在健康受試者中的水平。如果標記的水平與標準水平相比升高，則受試者具有發(fā)生CHF或者發(fā)生心力衰竭并發(fā)癥的風險。生物樣品可以是體液例如血液、血漿、血清、尿等等或者組織樣品例如心臟活檢的任何樣品。但是根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，生物學樣品是來自外周血的血漿樣品。外周血樣品可以很容易地取自患者，不需要復雜的侵入性步驟如導管插入?？梢愿鶕?jù)眾所周知的技術(shù)對生物學樣品進行加工，制備用于檢測的樣品。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，標記是一種蛋白質(zhì)。可以通過簡單可靠的方法例如使用針對蛋白特異的抗體的免疫方法，容易地測定該蛋白質(zhì)的水平。優(yōu)選地,蛋白質(zhì)是半乳糖苷凝集素-3(galectin_3),因為已經(jīng)證明在有衰竭傾向的心臟中半乳糖苷凝集素-3的水平有早期和特異的表達。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案，蛋白質(zhì)是血小板反應蛋白_2。已經(jīng)證明TSP2提高的心臟表達鑒定了那些有向明顯心力衰竭發(fā)展傾向的肥厚的心臟?？梢酝ㄟ^任何眾所周知的適宜的方法測定標記的水平。優(yōu)選地，標記的水平通過酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)測定，這樣提供了一個簡單、可重復的可靠方法。本發(fā)明還涉及使用一個或者多個非肌細胞標記，鑒定具有發(fā)生高血壓性終末器官損害例如充血性心力衰竭風險的受試者。根據(jù)本發(fā)明可以使用幾種非肌細胞標記。優(yōu)選地，標記是半乳糖苷凝集素-3和/或血小板反應蛋白_2。根據(jù)本發(fā)明確定的標記還可以用于高血壓性終末器官損害的預防和/或治療，特別是用于充血性心力衰竭的預防和/或治療。例如，通過例如抗體抑制半乳糖苷凝集素_3，和/或通過適宜的調(diào)節(jié)劑激活TSP-2，可能有利于阻止心力衰竭的發(fā)生。因此本發(fā)明還涉及半乳糖苷凝集素-3和/或其調(diào)節(jié)劑在制備藥物中的用途，用于預防和/或治療高血壓性終末器官損害。本發(fā)明還涉及血小板反應蛋白-2和/或其調(diào)節(jié)劑在制備藥物中的用途，用于預防和/或治療高血壓性終末器官損害。本發(fā)明通過以下的實施例和附圖進行進一步闡釋。

圖1是流程圖，顯示實施以前報導的統(tǒng)計方法的步驟以及用于數(shù)據(jù)采集的綜合截止點(cutoff point)。多步驟的數(shù)據(jù)篩選將在心力衰竭易感大鼠中有差異表達的基因的數(shù)目縮減到49個。HF-S，心力衰竭易感大鼠；EST' s，延伸序列標簽。圖2顯示了實時PCR定量mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達的結(jié)果，mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物來自10周大的大鼠心肌活檢物中四個選擇的基因，(a)那些以后出現(xiàn)迅速心臟失代償?shù)拇笫笈c那些在17周的研究時間段中仍然保持代償?shù)拇笫笙啾?，TSP2出現(xiàn)顯著過量表達，(b)骨活化素(Osteoactivin)的表達，(C)膠原蛋白VI的表達，(d)腦鈉肽的表達水平。數(shù)據(jù)相對于持家基因親環(huán)素進行標準化。Comp，代償?shù)?；DeCOm，失代償?shù)?*，p < O. 01代償組對失代償
組；#p < O. 05 SD 對 Ren-2 大鼠；每組 η = 4。圖3顯示在誘導心肌梗死之后小鼠的存活百分比。所有的TSP2缺失(TSP2_null)小鼠(虛線)在手術(shù)后72小時內(nèi)死亡(η= 16)。除去手術(shù)以后的立即死亡，在野生型小鼠(實線)中沒有觀察到死亡(η = 22)。圖4是柱狀圖，其顯示了心肌梗死(MI)之后O天和48小時心肌膠原含量的光密度分析結(jié)果(每個切片10個隨機視野)。與野生型小鼠相比，在ΜΙ48小時之后TSP2-缺失小鼠不能進行活性的纖維化。*，P < O. 01，野生型對缺失品系，ΜΙ48小時之后;#ρ < O. 01，野生型小鼠MI后第O天對48小時。圖5顯示了梗死的左心室壁的光學顯微鏡和電子顯微鏡照片。蘇木素/伊紅染色的切片顯示在血管周圍的完整基質(zhì)，在野生型小鼠中沒有間隙出血的跡象(a)。在TSP+小鼠中出現(xiàn)廣泛的組織損傷和間隙出血(b)。梗死的左心室壁電子顯微鏡照片(野生型品系)(C)。注意相對保持較好的血管和基質(zhì)結(jié)構(gòu)。TSP2缺失的小鼠的切片顯示了心肌基質(zhì)中廣布的損傷以及間隙區(qū)域的出血(*) (d)。圖6顯示了 HF-S、HF_R和ARB處理的大鼠的血液動力學參數(shù)。對給服和沒有給服ARB (從7-11周，0. 05mg/kg/天坎地沙坦(candesartan))的Ren_2轉(zhuǎn)基因大鼠進行血液動力學測定。A，LVW/BW(% )，左心室肥大的代表性測量。B，LW/BW(% )，表明了充血性心力衰竭的發(fā)生，以及C，LVEDP顯示了舒張期功能障礙的程度。HF-S和HF-R動物都具有左心室肥厚。具有高纖維化評分的動物具有更高的LW/BW和LVEDP。參數(shù)在處死之前測定。對于HF-S 和 HF-R 每一種都是 N = 4，對于 ARB，N = 8。*，HF-S 對 HF-R 和 ARB，P < O. 05。圖7顯示了苦味酸天狼猩紅(picrosirius red)染色的大鼠心肌切片左心室膠原體積級分分析的結(jié)果。柱狀圖顯示了 LV間隙膠原的定量。1，對照；2，HF-R ;3，HF-S ;4，ARB.每組 N = 4-6 ；#,P < O. 01 對對照；*，P < O. 05HF-S 對 HF-R ;#，P < O. 05 在 HF-R 對SD中。圖8顯示了在Ren-2大鼠中差異表達的基因的斑點印跡。在HF_S，HF-R和ARB處理的大鼠組之間比較半乳糖苷凝集素_3mRNA的水平。斑點的密度和直徑與相比于SD對照的基因表達的水平直接相應。A，Phsopho-1mager掃描的分別來自HF-S，HF-R和ARB處理的大鼠圖像。畫圈的點代表半乳糖苷凝集素_3mRNA的表達。B，柱狀圖，顯示了用光密度單位定量的半乳糖苷凝集素-3的量。每組N = 2,每個樣品平行點兩個點。
圖9半乳糖苷凝集素-3，細胞周期蛋白Dl和E2F-1的免疫印跡。大鼠心肌勻漿中半乳糖苷凝集素-3的表達水平A1，代表性印跡;A2，以對GAPDH標準化的以光密度單位進行的定量；細胞周期蛋白Dl :B1，代表性印跡；B2，以對GAPDH標準化的光密度單位進行的定量。圖10表明了半乳糖苷凝集素_3，巨噬細胞和MHC-1I的免疫組化共定位。從HF-S大鼠心肌得到的平行切片使用A，用蘇木精復染的抗-半乳糖苷凝集素-3小鼠單克隆抗體；B，巨噬細胞特異的抗-CD68小鼠單克隆抗體；c，抗MHC-1I抗原的0X-6小鼠單克隆抗體染色。不同的顯微鏡視野顯示了密集的巨噬細胞浸潤。D，HF-R動物中的巨噬細胞浸潤很少見到(E)，以及在SD對照中保持完好的心肌形態(tài)，F(xiàn)。圖11。人受試者中的LVH和HF的心電描記與超聲心動描記評估和實時定量PCR測定心肌半乳糖苷凝集素_3基因表達。A,根據(jù)Skowlow和Lyon標準(SV1+RV5 > 35mm)評價左心室的肥厚。小于55%的EF被認為是失代償?shù)臓顟B(tài)。B，使用人半乳糖苷凝集素-3探針進行實時PCR。描述了在人心肌活組織檢查中半乳糖苷凝集素-3基因表達。結(jié)果對持家基因親環(huán)素進行標準化。N = 6，*，P < O. 05HF對LVH。圖12顯示在10周的活組織檢查中的半乳糖苷凝集素_3mRNA表達。
實施例實施例1血小板反應蛋白-2 :表達的增加鑒定有衰竭傾向的心肌肥厚心肌肥厚增加了心力衰竭(HF)的風險，但是至今為止很難預測哪種肥厚的心肌會迅速地發(fā)展為衰竭。根據(jù)本發(fā)明推理，除了與肥厚相關(guān)的基因以外，在衰竭明顯出現(xiàn)之前，有獨特的與衰竭相關(guān)的基因表達，這樣就可以對易于衰竭的肥厚的心臟進行分子預測。在12-14周大、發(fā)展為HF的高血壓純合腎素過表達(Ren-2)大鼠心臟基因的表達(12336個克隆)，與到17周大時仍然保持代償?shù)耐C大鼠的基因表達進行比較。在代償性肥厚階段(10周大)取心臟活檢物，使發(fā)明者能檢測所鑒定的基因表達的改變是否出現(xiàn)在后來向HF發(fā)展之前。鑒定了在HF大鼠的心肌中過表達的49個基因，其中基質(zhì)基因占最大一組。血小板反應蛋白-2(TSP2)只在此后向HF發(fā)展的大鼠的活檢物中選擇性地過量表達，而腦鈉肽(BNP)在這個早期階段在所有大鼠中的表達都升高。為了檢測TSP2缺失對心臟基質(zhì)的影響，在TSP2缺失的小鼠中誘導心肌梗死(MI);這個步驟導致所有TSP2缺失的小鼠中心臟破裂；但是野生型小鼠沒有一只出現(xiàn)心臟破裂。結(jié)論是，鑒定TSP2是心臟基質(zhì)完整性的新型和重要的調(diào)節(jié)物。材料和方法轉(zhuǎn)基因大鼠和血液動力學研究純合Ren_2 大鼠獲自 Max-Delbriick-Zentrum fiir Molekulare Medizin,Berlin,德國。對Sprague Dawley(SD)背景的30只雄性Ren_2大鼠和作為對照的9只年齡相當?shù)腟D大鼠進行研究。在30只Ren-2大鼠中，8只在10周大時處死，8只Ren_2大鼠自7_13周大使用O. 05mg/kg/天的坎地沙坦進行處理，坎地沙坦是一種血管緊張素II受體類型I阻斷劑(ARB)。在剩下的14只未處理的Ren-2大鼠中，6只在13周發(fā)生心力衰竭臨床癥狀時處死，將其命名為HF-S大鼠。對剩下的8只Ren-2大鼠進行密切監(jiān)測，在17周時處死，這時它們?nèi)匀粵]有出現(xiàn)衰竭的臨床癥狀。這些大鼠被稱為HF-R大鼠。在處死前測定血液動力學參數(shù)，在處死之后測量心臟、肺臟重量和體重。對動物進行管理和處理的步驟經(jīng)過學院的動物管理委員會批準。10周大的Ren-2大鼠的活檢物對另外一組12只Ren-2大鼠和4只SD大鼠進行麻醉，在胸骨處剔下前胸上的毛。在自制的套環(huán)的幫助下將大鼠固定在位于溫暖襯墊之上的硬板上。將一個鈍的20號針頭插入氣管中作為氣管套管。套管與一個使用室內(nèi)空氣的容積循環(huán)式嚙齒動物呼吸機(model683, Harvard Apparatus, South Natick, MA)相連，潮氣量是 2. 5 到 3 毫升，呼吸速率是 80次呼吸/min。在顯微解剖鏡的視覺幫助下進行其他的步驟。在左側(cè)第四個肋間隙切一個5mm的切口，以通到胸部。在清楚地看到心臟之后，使用與緩慢旋轉(zhuǎn)的鉆頭相連的O. 35mm的定制針頭取活檢物。整個步驟持續(xù)大約15分鐘。在手術(shù)后存活的9只Ren-2大鼠中，5只在12到14周大時出現(xiàn)心力衰竭，而剩下的4只大鼠直至17周時仍然保持代償。RNA分離以及逆轉(zhuǎn)錄使用RNeasy Mini Kit 根據(jù) RNeasy Mini 實驗步驟(QIAGEN, Hilden, Germany),從左心室分離 RNA,儲存于-8CTC ο 在 2100Bioanalyser (Agilent Technologies, Amstelveen,The Netherlands)中使用 Eukaryote Total RNA nano-assay 檢測提取物的質(zhì)量。使用PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturus, CA,USA)根據(jù)生產(chǎn)商的說明，從10周大的大鼠心臟活檢物中分離RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶,250ng隨機引物(Invitrogen Life Technologies,Breda, The Netherlands)將 RNA 轉(zhuǎn)錄為 cDNA。cDNA 微陣列選擇從標準化的大鼠cDNA文庫中分離cDNA克隆，用于使用Incyte GEM-2/GEM-3大鼠cDNA文庫(總共12336個基因)的微陣列分析。將PCR擴增的每一個cDNA插入物以高密度陣列的形式印制在經(jīng)過處理的玻璃表面。在這些陣列元件上進行一式兩份的雜交，使用3個不同時間點的兩個SD和六個Ren-2大鼠心肌mRNA。對數(shù)值進行Log轉(zhuǎn)化使數(shù)據(jù)均勻，只有表達差異大于1. 7倍才認為是有差異的表達。采用的數(shù)據(jù)采集和驗證方案在以前有詳細描述(Tan 等，Proc Natl Acad Sc1. 99 :11387-11392,2002 ;Bandman 等，Ann NYAcad Sc1. ,975 :77-90,2002)。用于宏陣列(macroarray)的測序、膜點樣(spotting)和cDNA雜交從Incyte genomics獲得通過微陣列鑒定的差異表達的基因的克隆，并使用 5 ' -GGTGACACTATAGAAGAGC-3 '弓丨物(Eurogentec， Seraing, Belgium)測序。在通過測序?qū)π蛄羞M行確證以后，使用5 ' -ACCATGATTACGCCAAGCTC-3 '和
-ACGACGGCCAGTGAATTGAA-5;引物通過PCR反應對質(zhì)粒插入物進行擴增。然后將每個克隆一式兩份點樣于尼龍膜上(宏陣列)。使用個人fx-phospho imager (Cyclone SystemPackard, Meriden, CO, USA)對點印跡進行掃描。對每個雜交信號進行鑒定，并且使用Quantity One, Version 4. 2. 3 軟件(BioRad, Munich, Germany)進行光密度定量。選擇甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為持家基因用于印跡的內(nèi)標。生物信息學分析對選自微陣列分析和多步驟數(shù)據(jù)采集策略的49個HF特異候選基因的翻譯的蛋白質(zhì)序列進行生物信息學分析。根據(jù)對于這些蛋白質(zhì)生物學功能的注釋，選擇了三個候選基因用實時PCR進行進一步檢測，這三個基因以前沒有在心肌中發(fā)現(xiàn)，它們編碼基質(zhì)相關(guān)的蛋白。 引物、探針和實時PCR由GenBank 中已有的大鼠序列設計引物和探針，使用Primer Express軟件(PEApplied Biosystems,Foster City，CA，USA)。由來自 Ensembl-Mouse Genome SequencingConsortium和Ensembl-Human Genome Browser的保守外顯子拼接位點設計探針，這樣防止檢測對任何可能污染的基因組DNA產(chǎn)生識別(表I)。發(fā)現(xiàn)對于Taqman 檢測最佳的PCR條件是12. 5mL 2 XPCR Master Mix，終濃度為5mM MgCl2, 300nM每個引物，200nM探針以及IOng cDNA 模板，總體積是 25ml。使用 ABI Prism 7700 Sequence Detection System (PEApplied Biosystems, Foster City，CA，USA)進行擴增和檢測。相對于持家基因親環(huán)素A的表達水平報告PCR數(shù)據(jù)。
在TSP2+小鼠中的實驗性心肌梗死以及形態(tài)測定法在22只野生型(129SvJ品系)的小鼠和16只TSP2缺失突變體(TSP2+)小鼠中，通過閉塞冠狀動脈左前降支，誘導心肌梗死。兩只假手術(shù)小鼠作為對照。在乙醚麻醉之后，通過向腔靜脈中注射Iml 0.1M CdCl2殺死小鼠。用5%的緩沖福爾馬林灌注固定心臟10分鐘，在10%的緩沖福爾馬林中浸泡固定過夜。使用標準電子顯微鏡技術(shù)分析野生型和TSP2+小鼠的組織樣品。在每個切片中隨機選擇七個視野，進行計算機化面積測量，對纖維化的程度進行定量。每個視野代表了 400 μ m2的面積。選擇性地定量左心室間質(zhì)的膠原面積，不包括血管周圍和心外膜的膠原。膠原面積分數(shù)計算如下每個視野中苦味酸天狼猩紅染色的面積與總的心肌面積之比。以前對該步驟有詳細的報導(Cherayil等，Proc NatlAcad Sci USA,87 :7324-7328,1990 ；Cleutjens 等，Am J pathol.，147 :325-338,1995)。統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。使用單因素方差分析(ANOVA)與用于對多重比較進行校正的Dunnett事后分析相組合，對每個研究組(坎地沙坦處理的和兩組未處理的腎素轉(zhuǎn)基因大鼠)的數(shù)據(jù)進行比較。使用SD大鼠作為內(nèi)部對照組。使用統(tǒng)計包SPSS10. O (Chicago, IL, USA)進行分析。P值小于0. 05認為是統(tǒng)計顯著的。結(jié)果在Ren-2大鼠亞組中出現(xiàn)向顯著心力衰竭的迅速轉(zhuǎn)化和死亡在10周大處死的8只大鼠中以及在較后的日期處死的其他未處理的大鼠中觀察到了肥厚的左心室和右心室。在SD對照中沒有觀察到LVH。使用安慰劑處理的14只Ren-2大鼠中有6只在12到14周齡之間迅速向顯著的臨床HF轉(zhuǎn)化，與在17周觀察期期間保持代償?shù)?只大鼠相比，這些大鼠的心臟功能指標降低。在HF-S大鼠中觀察到胸膜積液和dP/dtmax的劇烈下降，在HF-R大鼠中這些改變不顯著(表2)。在13周對殺死的動物進行分析時，血管緊張素II阻斷完全防止了心臟肥厚和衰竭的產(chǎn)生(LV重量/體重％，2. 52 ±0. 36，dP/dt_，8400 ±202)。微陣列顯示了在心力衰竭易感的大鼠中有49個基因過表達。對于微陣列分析，我們首先研究了 HF-S和HF-R組之間基因表達的生物學變異性。在HF-S和HF-R兩個組中的大部分基因的表達水平非常相似。在研究表達的總共12336個基因中，多步數(shù)據(jù)采集(圖1)只獲得了 49個基因，其在HF-S大鼠中過表達。煙酰胺腺嘌呤
二核苷酸(NAD)轉(zhuǎn)氫酶是在處于衰竭中的心肌中唯一表達降低的基因。顯著地，骨活化素、TSP2、幾個原膠原和血小板反應蛋白-1的表達增加。所鑒定的基因中許多編碼具有已知功能的蛋白，而其他的是功能未知的基因，包括新基因和以前在心臟中沒有檢測出的基因。針對三個新的心臟基質(zhì)相關(guān)基因的生物信息分析由于沒有關(guān)于在HF中許多過表達的基因功能的信息，我們對所有49個基因進行了生物信息分析。起初，我們使用GeneFIND(基因家族鑒定網(wǎng)絡設計，Gene FamilyIdentification Network Design) System (http://www_nbrf· georgetown. edu)對HF 易感性基因作了廣泛的功能分類，GeneFIND將幾個檢索/比對工具組合在一起提供了迅速和精確的基因家族。這一策略表明大多數(shù)過表達的基因編碼基質(zhì)相關(guān)蛋白。讓人關(guān)注的是，3個選出的易感性基因(骨活化素，血小板反應蛋白-2和膠原VI)的功能以前在心肌中沒有報導。宏陣列顯示了 HF易感性基因通過血管緊張素II阻滯的標準化為了確證在這個由血管緊張素驅(qū)動的心力衰竭模型中腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活的作用，在使用亞增壓(sub-pressor)劑量的坎地沙坦對Ren_2大鼠亞組從7周到13周進行處理之后，我們對微陣列確定的靶基因的表達進行了重新分析。除了改善血液動力學以外，ARB處理阻止了所有HF-相關(guān)的候選基因的過表達(數(shù)據(jù)未顯示)。在10周的心肌活檢顯示TSP-2在隨后迅速向HF發(fā)展的大鼠中上調(diào)。為了評價在血液動力學和臨床上HF明顯出現(xiàn)之前3個基質(zhì)相關(guān)基因在心肌中的表達狀態(tài)，我們開發(fā)出了一種技術(shù)以獲得在自發(fā)博動的大鼠心臟中獲得活檢物。在活檢后，使大鼠恢復以檢查它對心力衰竭是否具有抵抗性或者易感性。這個新的方法使我們在衰竭變得明顯之前確定了基因表達的水平。TSP2的表達只在那些在12-14周內(nèi)發(fā)生心臟迅速失代償?shù)拇笫笾性谠缙诘姆屎耠A段(10周)明顯增加(圖2a)，而在接下來保持代償狀態(tài)的大鼠中，在該早期肥厚階段沒有上調(diào)，在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沾笫笮呐K中也沒有。其他HF相關(guān)候選基因例如骨活化素(圖2b)和膠原VI (圖2c)的表達水平，在隨后出現(xiàn)衰竭和與對照相比保持代償?shù)拇笫笾性谠缙诜屎耠A段都有升高。重要的是，廣泛使用的心臟肥厚和衰竭的標記在所有大鼠的10周活檢中都上調(diào)，而不論隨后是代償或者衰竭，因此不能區(qū)別有衰竭傾向和對衰竭有抗性的大鼠(圖2d)。與我們最初的微陣列研究一致，在出現(xiàn)心力衰竭之后這三個基因的表達進一步提高到它們在10周表達水平的2倍以上。代償?shù)拇笫?，盡管在10周時有高的骨活化素、膠原VI和BNP，在17周處死時這些基因的表達水平?jīng)]有進一步顯著提高(數(shù)據(jù)未顯示)。TSP-2敲除(TSP+)小鼠不能存活于急性心肌梗死與多種大鼠心力衰竭模型相反，對響應壓力超負荷一向產(chǎn)生心力衰竭的小鼠模型沒有仔細的文獻證明。因此，我們對22只野生型和16只TSP2+小鼠進行前心肌梗死，以研究TSP2在急性心肌結(jié)構(gòu)性損傷中的作用以及接下來在快速心肌重塑中的作用。因為所有的小鼠在MI之后前72小時內(nèi)由于心臟破裂而死亡，所以TSP2缺失的小鼠不能夠承受梗死。另一方面，100%的沒有死于手術(shù)后立即并發(fā)癥的野生型小鼠存活(圖3)。MI后48小時的計算機形態(tài)學測定顯示與野生型小鼠相比，在TSP2缺失的小鼠中，心肌膠原明顯的完全缺乏反應性的增加(分別是0. 38±0. 05%和0. 70±0. 04%；p<0. 05)(圖4)。光學顯微鏡和電子顯微鏡顯示在TSP2缺失的小鼠中有廣泛的心肌基質(zhì)破損。野生型小鼠中沒有一只顯示了這樣的表型(圖5)。討論
在這一研究中證明TSP2在心臟中表達的提高鑒定了那些傾向于向顯著心力衰竭發(fā)展的肥厚心臟。進一步顯示在對急性心臟負荷產(chǎn)生有效應答時需要TSP2。相反，已知的肥厚標記例如BNP在所有形式的心臟肥厚中總是表達增加，因此不能夠區(qū)別有衰竭傾向和抵抗衰竭的肥厚形式。
盡管在血管和血栓形成疾病中對血小板反應蛋白家族進行了廣泛研究，還沒有報導證實血小板反應蛋白在心力衰竭中的重要作用。我們的發(fā)現(xiàn)提示TSP2在心臟基質(zhì)生物學中可能具有直接或者間接的關(guān)鍵功能。
TSP2是一種分泌的基質(zhì)細胞糖蛋白，其功能多樣，并沒有被完全認識。由于在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)或者果蠅基因組中沒有發(fā)現(xiàn)TSP2的相近直向同源物，看起來這個蛋白是為了應對在脊椎動物中細胞基質(zhì)相互作用復雜性的增加而進化。以前在TSP2缺失小鼠中的研究已經(jīng)表明TSP2表達的缺失導致具有不規(guī)則外形的異常大的膠原纖絲，這是TSP2組織細胞外基質(zhì)作用的證據(jù)。而且，TSP2缺失的小鼠的皮膚脆弱，抗張強度下降。TSP2缺失的皮膚成纖維細胞的基質(zhì)附著缺陷，在它們的培養(yǎng)物中基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的水平增加。本研究發(fā)現(xiàn)了 TSP2在心肌中的兩個表面上相互矛盾的功能。在 Ren-2大鼠中的慢性高血壓中，TSP2在心臟中表達的增加鑒定了那些傾向出現(xiàn)心力衰竭的動物。盡管這種應答看起來表明TSP2的表達是有害的，但是與在延長的時間內(nèi)仍然保持代償?shù)拇笫笾械膽鹣啾?，有可能這種應答反映出隨后向顯著衰竭發(fā)展的大鼠中的一種升高的、已經(jīng)被激活的損傷應答。很明確TSP2的表達是成年動物中對損傷的應答所特有的。另一方面在小鼠的實驗性心肌梗死中，TSP2的存在明顯地保護了心臟不破裂。盡管由于涉及了不同的物種，兩個實驗系統(tǒng)很難比較，而且就TSP2缺失小鼠而言，可能存在復雜的代償性改變，但是兩組結(jié)果都證明了 TSP2在損傷之后產(chǎn)生完整的功能性細胞外基質(zhì)中起到的重要作用。就TSP2缺失的小鼠中切割皮膚傷口的愈合而言，TSP2的缺失看起來是有益的， 因為在這種特殊的傷口愈合形式中,所產(chǎn)生的血管生成的增加和MMP2的增加加速了愈合， 盡管已知在該組織中存在在膠原纖維已經(jīng)存在的結(jié)構(gòu)的改變。但是提示由于心肌基質(zhì)中類似的異常情況導致心臟組織事先具有固有的薄弱狀況，使心臟在梗死之后易出現(xiàn)破裂。
這里的數(shù)據(jù)提示TSP2在心臟中表達的增加在向衰竭發(fā)展之前發(fā)生。因為已經(jīng)知道血小板反應蛋白可以與整聯(lián)蛋 白結(jié)合，所以TSP2可能通過整聯(lián)蛋白信號介導了促纖維變性(pro-fibrotic)的效果。最近 Zhang 等(J Clin Invest 111 :833-841, 2003)報導了具有適配子蛋白基因Grb2單倍體機能不全(haploinsufficiency)的小鼠,對于壓力超負荷產(chǎn)生的心臟纖維化有抵御作用。在能夠由于機械壓力導致的整聯(lián)蛋白介導的粘著斑激酶的激活中有Grb2的參與。在我們的研究中我們發(fā)現(xiàn)β I整聯(lián)蛋白是在高血壓的Ren2 大鼠的心臟中表達顯著升高并且在衰竭的心臟中表達進一步升高的基因之一。我們最近的觀察結(jié)果一心臟成纖維細胞的體外伸展提高了 β I整聯(lián)蛋白的蛋白水平，證明了這一發(fā)現(xiàn) (S. Pokharel 和 Y. Μ. Pinto,未發(fā)表的數(shù)據(jù))。
應當注意用于膠原定量的苦味酸天狼猩紅染色技術(shù)依賴于膠原纖維的大小、排列和裝配，才能顯示可見的橙紅色偏振。由于TSP2缺失小鼠具有異常的膠原纖絲和纖維結(jié)構(gòu)，特別組織較差的纖維和無規(guī)更大的纖絲，測量的雙折射可能會受到這些改變的影響。
總之，根據(jù)本發(fā)明提出TSP2發(fā)揮心臟基質(zhì)完整性的至關(guān)重要的調(diào)節(jié)物的功能。由于在實驗和臨床形式的壓力超負荷誘導的心力衰竭中都具有細胞外基質(zhì)形成的特征，TSP2的早期表達可能反映出了在代償性肥厚向心力衰竭的轉(zhuǎn)變中重要的基質(zhì)應答。這些觀察結(jié) 果表明TSP2心臟中過表達的早期檢測可以鑒定那些易于出現(xiàn)心力衰竭的肥厚的心臟，可 以促進易于發(fā)展為心力衰竭的病人的早期發(fā)現(xiàn)和可能的治療。
實施例2
半乳糖苷凝集素_3標志了傾向于出現(xiàn)衰竭的肥厚的心臟中活化的巨噬細胞
巨噬細胞趨化蛋白和多種不同的細胞因子心肌表達的升高提示在心力衰竭(HF) 中有巨噬細胞的參與。但是還不清楚巨噬細胞是否僅僅對已經(jīng)出現(xiàn)的損傷產(chǎn)生應答還是積 極地參與HF的早期階段。為了研究高血壓性HF中的這些機制，發(fā)明人使用了純合的高血 壓性TGR(mRen2)27(Ren-2)大鼠。這些大鼠在10周齡時一律出現(xiàn)心臟肥厚，此后一些大鼠 保持代償性直至17周，而其他的大鼠在12到14周齡時出現(xiàn)衰竭和死亡。該研究表明心臟 中半乳糖苷凝集素-3的表達特異地標志出傾向出現(xiàn)衰竭的肥厚的心臟。在有衰竭傾向的 肥厚的心臟中巨噬細胞看起來被早期和特異地激活，并且來源于巨噬細胞的介體如半乳糖 苷凝集素_3可能導致心臟纖維化的發(fā)展和向HF的發(fā)展。
材料和方法
轉(zhuǎn)基因大鼠和血液動力學研究
純合Ren_2 大鼠獲自 Max-Delbriick-Zentrum fiir Molekulare Medizin,Berlin, Germany。我們研究了 16只雄性Ren_2大鼠和作為對照的8只年齡相當?shù)膩碜苑寝D(zhuǎn)基因 背景的Sprague Dawley(SD)大鼠。在16只Ren_2大鼠中，8只Ren_2大鼠在7-13周齡使 用O. 05mg/kg/天的坎地沙坦進行處理，坎地沙坦是一種血管緊張素II受體類型I阻斷劑 (ARB)。在8只未處理的Ren-2大鼠中，4只在13周發(fā)生HF時處死。對剩下的4只Ren_2 大鼠進行密切監(jiān)測，在17周時處死，這時它們?nèi)匀粵]有出現(xiàn)衰竭的臨床癥狀。在處死前和 在10周時進行血液動力學測量。在處死之后測量心臟、肺臟重量和體重。對動物進行管理 和處理的步驟經(jīng)過學院的動物管理委員會批準。
10周大的Ren-2大鼠的心肌活檢
對另外一組12只Ren-2大鼠和4只SD大鼠進行麻醉，將一個鈍的20號針頭插 入氣管中作為氣管套管。套管與一個使用室內(nèi)空氣的容積循環(huán)式嚙齒動物呼吸機(model 683, Harvard Apparatus, South Natick, MA)相連，潮氣量是 2. 5 到 3 毫升，呼吸速率是 80 次呼吸/min。在顯微解剖鏡的視覺幫助下在左側(cè)第四個肋間隙切一個5_的切口，以通到 胸部。使用O. 35mm的定制針頭取活檢。
cDNA 微陣列
選擇從標準化的大鼠cDNA文庫(總共12336個基因)中分離cDNA克隆，用于微 陣列分析(Incyte Genomics, CA, USA，大鼠GEM-2/3)。將PCR擴增的每一個cDNA插入物 印制在玻璃表面上成為高密度陣列。在這些玻璃芯片上用3個不同時刻的兩個SD和六個 Ren-2大鼠心肌mRNA進行一式兩份雜交。將表達顯示出統(tǒng)計顯著(P < O. 001)改變的靶基 因(在HF-S組中至少有2倍過表達)再次印制在亞陣列上進一步進行分析，這樣使每個基 因都獨立地分析了四次，提高了可靠性水平。采用的數(shù)據(jù)采集(Tan FL等，Pioc Natl Acad Sc1. 99 :11387-11392,2002)和驗證方案在以前有詳細描述(Bandman O 等，Ann NY Acad Sc1. ,975 :77-90,2002)。
引物和探針
根據(jù)GenBank 中的序列，使用 Primer Express Software (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)設計半乳糖苷凝集素_3特異的引物(正向 5' -CCCGACTGGACCACTGACA-3'，反向，5' -CAGCATGCGAGGCATGACT-3'以及探針，5' -TGC CCTACGATATGCCCTTGCCTG-3')。
RNA分離和實時PCR
使用RNeasy Mini Kit 根據(jù) RNeasy Mini 實驗步驟(QIAGEN, Hilden, Germany), 從大鼠左心室分離 RNA,儲存于 _80°C。使用 Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus, CA, USA)根據(jù)生產(chǎn)商的說明，從大鼠心臟活檢物中分離RNA。發(fā)現(xiàn)對于Taqman 檢測最佳的PCR 條件是12. 5μπι 2 X PCR Master Mix，終濃度為5mM MgCl2, 300nM每個引物，200nM探針以及IOng cDNA模板，總體積是25 μ I。
測序、膜點樣和宏陣列的cDNA雜交
從Incyte Genomics獲得通過微陣列鑒定的差異表達的基因的克隆，并使用 5' -GGTGACACTATAGAAGAGC-3'引物(Eurogentec, Seraing, Belgium)測序。在確證身份以后，使用 5' -ACCATGATTACGCCAAGCTC-3'和 3' -ACGACGGCCAGTGAATTGAA-5'引物通過 PCR反應對質(zhì)粒插入物進行擴增。然后將每個克隆一式兩份點樣與尼龍膜上(宏陣列)。使用個人 fx_phospho imager (Cyclone System Packard,Meriden, CO, USA)對斑點印跡進行掃描。
蛋白質(zhì)分離和Western印跡·
根據(jù)以前的描述進行蛋白質(zhì)分離和Western印跡。用含有Tween20的Tris緩沖鹽水(TBS-T)將一抗(半乳糖苷凝集素-3，Bioreagents ;ED_1 和 0X-6 由 Dr. M. de Winther, Department of Molecular Genetics, University of Maastricht, The Netherlands 惠贈)稀釋為1/1000。二抗(辣根過氧化物酶體綴合的IgG, Cell Signaling Technology) 用TBS-T稀釋為1/2000。根據(jù)生產(chǎn)商的說明使用增強化學發(fā)光(ECL, Amersham, Arlington Heights, IL, USA)呈現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶。
免疫組化、半乳糖苷凝集素細胞化學和共聚焦顯微鏡術(shù)如以前的描述(Gabius 等,Anal Biochem. :189 :91-94,1990)通過特異的抗半乳糖苷凝集素-3單克隆抗體以及生物素化的半乳糖苷凝集素_3呈現(xiàn)半乳糖苷凝集素_3的表達和可接近的結(jié)合位點。如其他文獻的詳細描述(Andre等，Chembiochem. 2 :822_830，2001)，在保持活性的條件下使半乳糖苷凝集素-3生物素化。在激光共聚焦掃描顯微鏡術(shù)中，使用FITC標記的親和素檢測半乳糖苷凝集素結(jié)合位點。使用德克薩斯紅標記的二抗以免疫細胞化學的方式呈現(xiàn)增殖細胞核抗原(PCNA)。關(guān)于該步驟在其他文獻中有進一步的詳細描述(Broers等，J Cell Sc1. 112 (Pt 20) :3463-3475,1999)。
心臟成纖維細胞增殖和脯氨酸摻入檢測
如以前的描述(Pokharel等，Hypertension, 40 :155-161, 2002),從 2 日齡的新生 Sprague-Dawley大鼠中分離大鼠心臟成纖維細胞。細胞在添加10%胎牛血清(FBS)、1% L-谷氨酸、50U/ml青霉素和0. lg/L鏈霉素的Dulbecco改進Eagle' s培養(yǎng)基(DMEM)中， 在37°C下在濕潤的含有5% CO2的空氣中培養(yǎng)。接種后24小時將細胞用含有O. 5% FBS 的培養(yǎng)基孵育24小時使其休眠。然后使用鼠的重組半乳糖苷凝集素_3(對照、10μ g/ml 和30 μ g/ml)處理細胞24小時。使用放射性標記的甲基[3H]胸苷摻入(0. 5 μ Ci每孔)檢測測定分裂細胞的數(shù)目。使用LKB-Wallace beta計數(shù)儀(FSA Laboratory Supplies, Loughborough, UK)檢測成纖維細胞和閃爍液體混合物中的放射性。
使用[3H]脯氨酸摻入檢測測定分泌的膠原。簡而言之，心臟成纖維細胞接種于6 孔培養(yǎng)板中至90-100%匯合。在孵育的最后24小時中，加入15yCi/ml的L-[3H]脯氨酸。 使用10%三氯乙酸(TCA)沉淀條件培養(yǎng)基中摻入的[3H]脯氨酸，用液閃計數(shù)儀計數(shù)。
統(tǒng)計分析
數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。使用單因素方差分析(ANOVA)與用于對多重比較進行 校正的Dunnett事后分析相組合，對每個研究的數(shù)據(jù)進行比較，使用SD大鼠作為內(nèi)部對照 組。使用統(tǒng)計包SPSS 10. O (Chicago, IL, USA)進行分析。P值小于0. 05認為是統(tǒng)計顯著 的。
結(jié)果
HF-S大鼠中惡化的心臟功能以及心臟纖維化
在8只安慰劑處理的大鼠中觀察到肥厚的左右心室。相反，在坎地沙坦處理和非 轉(zhuǎn)基因?qū)φ沾笫笾袥]有出現(xiàn)LV增加。8只沒有處理的大鼠中4只在12-14周齡期間發(fā)生顯 著的臨床HF，伴隨出現(xiàn)下降的心臟功能指標。剩余4只大鼠在17周的研究階段中保持代 償化。在HF-S大鼠中明顯出現(xiàn)伴隨著胸膜積液(肺臟重量/體重％ =HF-S, 10. 61 ±0. 7對 HF-R,4. 97±0· 2,P < 0. 001)和左心室舒張末期壓力(LVEDP)升高的顯著HF，這些在HF-R 大鼠和或ARB處理的大鼠中不存在(圖6a，b和c)。在10周時所有安慰劑處理的Ren_2 大鼠均出現(xiàn)LVH但是沒有失代償?shù)难簞恿W的證據(jù)(LV重量/體重％ Ren-2, HF-S, 3. 88±0· 08 ;非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?. 15±0· 2，以及dP/dtmax :Ren_2，8556±296對非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?8780±373)。由計算機輔助的光密度測量測定的心肌膠原含量顯示與HF-R大鼠相比，HF-S 大鼠中具有更高程度的心臟纖維化。ARB使LVH和心肌膠原含量標準化，這樣它仍然可以與 具有正常血壓背景的品系的相當(圖7)。
微陣列顯示了 HF易感大鼠中免疫相關(guān)基因的豐度
首先，我們檢查了 HF-S和HF-R組之間基因表達的生物變異性。來自兩個組的樣 品對之間大部分基因的表達水平高度相關(guān)。我們重點關(guān)注衰竭和未衰竭的肥厚心臟之間差 異表達的基因。對數(shù)據(jù)進行Log轉(zhuǎn)化，只有超過2倍閾值的表達水平的統(tǒng)計顯著的差異(P <0.05)才認為是差異表達。半乳糖苷凝集素_3是最突出過表達的基因，在HF大鼠中表 達升高5倍以上(表3)。有趣的是，主要組織相容性復合體抗原II (MHC-1I)和免疫球蛋白 受體基因也在這些過表達的基因中。
宏陣列顯示HF易感性基因被血管緊張素II阻滯的標準化
為了驗證在HF中差異表達的基因，我們首先測序然后將這些基因重新點樣在尼 龍膜上(宏陣列)，在不同的生物樣品中重復雜交，這樣對克隆的身份進行確證。開始由微 陣列確定的7個主要指標基因在這里也有過量表達。為了確證在這個由血管緊張素驅(qū)動 的HF模型中腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活的作用，在使用亞增壓劑量的坎地沙坦對 Ren-2大鼠的亞組從7周到13周進行處理之后，我們對微陣列確定的靶基因的表達進行了 重新分析。血管緊張素II阻滯完全阻止了心臟肥厚和衰竭的發(fā)生。在基因表達水平上，它 阻止了所有HF-相關(guān)的候選基因的過表達。引起注意的是半乳糖苷凝集素_3的表達也被 阻止了。
Western印跡顯示在正在衰竭的心肌中半乳糖苷凝集素_3具有高表達
考慮到半乳糖苷凝集素_3轉(zhuǎn)錄水平的強烈增加，我們重點關(guān)注了它在心肌中的蛋白質(zhì)水平。與在微陣列/宏陣列中得到的結(jié)果相當，在相同的動物組(具有最大程度的心臟纖維化，在13周時迅速發(fā)生心臟失代償)中觀察到了最高水平的半乳糖苷凝集素_3 表達(HF-S，94. 6±8· 9 ;HF_R，35±5. 6，P < O. 01)(圖 8a 和 b)。
⑶68陽性、MHC-1I抗原和半乳糖苷凝集素_3的共定位
我們通過免疫組化對半乳糖苷凝集素_3在大鼠心肌中的分布進行了監(jiān)測。從組織學上看，HF易感的大鼠顯示了成片的纖維化區(qū)域。在沒有受到影響的區(qū)域中組織的結(jié)構(gòu)保持完好。相反在ARB處理的和SD大鼠中，以及在肥厚的未衰竭的HF-R大鼠中都沒有看到這些高度纖維化的區(qū)域。重要的是，半乳糖苷凝集素_3陽性區(qū)域顯示了顯著的組織損傷和高度的纖維化。從形態(tài)學上看，半乳糖苷凝集素_3陽性細胞相當大。為了確證這些細胞是巨噬細胞的假設，我們使用巨噬細胞特異的抗體(ED-1)進行了連續(xù)切片分析。半乳糖苷凝集素-3陽性的區(qū)域與巨噬細胞特異染色共定位(Co-localized)。這些巨噬細胞也強烈表達MHC-1I抗原，表明這些細胞在抗原呈遞中的積極作用。這些特征在HF-R大鼠和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩胁⒉伙@著。
在心臟成纖維細胞中的半乳糖苷凝集素-3 結(jié)合位點
在確定半乳糖苷凝集素-3在巨噬細胞中有強烈表達之后，我們確定半乳糖苷凝集素_3是否結(jié)合心臟成纖維細胞。我們使用生物素化的半乳糖苷凝集素_3呈現(xiàn)心臟成纖維細胞上的半乳糖苷凝集素_3結(jié)合位點。在O. 1% Triton透化的細胞中，半乳糖苷凝集素-3結(jié)合位點的存在導致靜止細胞中的彌散細胞質(zhì)和細胞核外染色(圖10a)。相反，增殖的成纖維細胞在細胞核周圍有增強的染色，顯示了與有絲分裂相關(guān)的染色特征的改變(圖 10b)。這個型式由共聚焦顯微鏡術(shù)獨立監(jiān)測。實際上，這些實驗確證了在增殖的(即PCNA 陽性)心臟成纖維細胞的細胞核周圍可接近的半乳糖苷凝集素_3配基緊密存在(圖10c、 d和e)，反映了半乳糖苷凝集素_3過表達狀態(tài)中細胞周期的激活。
半乳糖苷凝集素_3誘導成纖維細胞增殖和膠原產(chǎn)生
在提供了心臟成纖維細胞中存在可接近位點的證據(jù)之后，我們確定了半乳糖苷凝集素_3是否促進心臟成纖維細胞的生長。使用重組的半乳糖苷凝集素_3，我們進行了增殖試驗。加入不同濃度的半乳糖苷凝集素_3 (0,10和30 μ g/ml)，使用或者不使用血清富集。我們觀察到使用10和30 μ g/ml外源半乳糖苷凝集素-324小時后心臟成纖維細胞增殖顯著增加(30 μ g/ml半乳糖苷凝集素-3, 347± 17. 5計數(shù)每分鐘(cpm) ; 10 μ g/ml半乳糖苷凝集素_3，309 ±4. 8cpm ;對照，145 ±4. 8 ;p < O. 01)。然后我們通過加入外源半乳糖苷凝集素-3，使用放射性脯氨酸摻入測定，監(jiān)測了心臟成纖維細胞膠原的產(chǎn)生。在培養(yǎng)基中含有30 μ g/ml半乳糖苷凝集素_3時,脯氨酸摻入提高了大約66% (30 μ g/ml半乳糖苷凝集素-3，1066±56cpm ;對照，707±52. 8cpm ；p < O. 05)。更低濃度的半乳糖苷凝集素_3不能產(chǎn)生顯著的作用(10 μ g/ml半乳糖苷凝集素_3 992±72cpm，p = O. 13)。
10周時的心肌活檢顯示在后來快速發(fā)展為HF的大鼠中高半乳糖苷凝集素_3表達
為了評估在HF成為血液動力學和臨床上明顯之前在心肌中的半乳糖苷凝集素_3 的表達狀態(tài)(即10周齡)，我們開發(fā)了獲得自主搏動的大鼠心臟中心臟活檢物的技術(shù)。活檢后，使大鼠恢復以確定其是否抵抗或易感HF。通過實時PCR測量，只在后來發(fā)展為HF的大鼠中半乳糖苷凝集素_3的心肌表達增加(任意單位5. 8±0. 17)，而其在隨后仍保持代償?shù)拇笫笾?3.4±0. 2)以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沾笫蟮男呐K中(2. 5±0.033)以相對較低的水平表達(圖12)。
討論
本研究的目的是確定在肥厚的心室向衰竭轉(zhuǎn)化的過程中的特異機制。我們證明半乳糖苷凝集素_3，一種巨噬細胞表達的蛋白，在衰竭傾向的肥厚心臟中早期和特異地表達。而且，我們確定半乳糖苷凝集素_3與心臟成纖維細胞內(nèi)的結(jié)合位點結(jié)合，激活心臟成纖維細胞增殖和膠原產(chǎn)生，提示這一過程可能導致了心肌硬化并且很可能導致向HF的發(fā)展。
以前的研究已經(jīng)提示了巨噬細胞和炎性應答在HF中的作用。但是這些研究留下了未解答的問題，即巨噬細胞的激活是在HF之前出現(xiàn)還是僅僅伴隨HF出現(xiàn)。而且，也沒有對巨噬細胞與心臟纖維化關(guān)聯(lián)的特異機制進行解釋。
作為首先在腹膜巨噬細胞表面發(fā)現(xiàn)的抗原，半乳糖苷凝集素_3是半乳糖苷凝集素家族中唯一的嵌合類型成員。它具有凝集素基團，其與β半乳糖苷以及蛋白質(zhì)共同具有不依賴于鈣的特異性，它位于巨噬細胞的吞噬細胞杯和吞噬體內(nèi)。除了其抗凋亡和生長促進作用以外，半乳糖苷凝集素_3還調(diào)控單核細胞趨化性、化動性以及調(diào)節(jié)細胞因子的可獲得性。而且，最近的研究還提示在通過Fe Y受體(FcyR)交聯(lián)之后，半乳糖苷凝集素_3在巨噬細胞的吞噬作用中起重要的作用。
有趣的是，我們還觀察到Fe Y R在我們的HF模型中的過表達(表3)。
從10周齡的大鼠得到的活檢顯示只有在向迅速衰竭轉(zhuǎn)化的大鼠中才出現(xiàn)半乳糖苷凝集素_3表達的增加。考慮到半乳糖苷凝集素_3的促炎和成纖維生長促進作用，這個階段表達的增加可能促進了有利于衰竭的環(huán)境。與我們的發(fā)現(xiàn)一致，巨噬細胞的肝臟類似物(即枯否細胞)表達的半乳糖苷凝集素_3也參與在肝臟中誘導合成過量的纖絲形成膠原。這提示半乳糖苷凝集素_3是一個巨噬細胞相關(guān)的促纖維化介體，也是另外一種炎癥浸潤細胞因子，它在巨噬細胞浸潤的特征條件下具有影響心臟重塑的能力。半乳糖苷凝集素_3如何加快向HF發(fā)展的另一個假說來自對半乳糖苷凝集素_3是晚期糖基化終產(chǎn)物的第三個受體(RAGE-3)的發(fā)現(xiàn)，該受體在膠原交聯(lián)和心肌硬化方面起關(guān)鍵的作用。
我們還證明了半乳糖苷凝集素_3與細胞內(nèi)受體結(jié)合并且誘導心臟成纖維細胞增殖，增加膠原產(chǎn)生。盡管半乳糖苷凝集素_3開始是作為糖結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn)的，但是已知半乳糖苷凝集素_3與細胞內(nèi)除了糖綴合物以外的靶也發(fā)生特異相互作用。以前的研究提出了幾個作為半乳糖苷凝集素-3結(jié)合位點的分子，包括Mac-2結(jié)合蛋白和層粘連蛋白。但是， 仍然不知道是什么誘導增殖細胞中半乳糖苷凝集素-3結(jié)合元件迅速地向核周圍遷移。它是半乳糖苷凝集素_3結(jié)合位點從正在分裂的細胞核向外運輸(離心遷移)還是這些受體在指導下從胞漿向細胞核的轉(zhuǎn)移(向心遷移)，這還需要進一步的探究。
本研究提示免疫系統(tǒng)激活以及半乳糖苷凝集素_3的產(chǎn)生在從左心室肥厚向HF發(fā)展過程中的重要作用，并表明在促免疫和促纖維化的因子之間的聯(lián)系。在HF之前半乳糖苷凝集素_3表達的增加可能反映了在肥厚的正在衰竭的心室中巨噬細胞早期和異常的激活。反過來，半乳糖苷凝集素_3可能釋放由活化的巨噬細胞向心臟纖維化的信號。對半乳糖苷凝集素_3的外周檢測可以作為HF的指示，在治療上，對半乳糖苷凝集素_3的作用進行抑制可能成為新的治療靶標，以抵消過度心臟纖維化。
實施例3人血清中半乳糖苷凝集素_3的分析
在患有心血管疾病的患者的血清中檢測半乳糖苷凝集素_3水平。使用商品化的通過EL I SA測量半乳糖苷凝集素-3的試劑盒。結(jié)果總結(jié)在表4-6中。顯示半乳糖苷凝集素_3在患有心血管疾病如心力衰竭、LVH的患者的血清中顯著升高。而且，也找到了健康對照受試者中半乳糖苷凝集素_3水平的上限，這個上限在大多數(shù)CHF患者中都被超過了。
根據(jù)本發(fā)明，第一次證明在人受試者的血清中對半乳糖苷凝集素_3水平的測定， 將患病與非患病的受試者可靠地區(qū)分開，這樣，與已知的肌細胞標記(BNP)相結(jié)合，為非肌細胞的疾病過程提供了額外的信息。
數(shù)據(jù)表格
LVH=高血壓，肥厚
CHF =心力衰竭
Infl =炎性血管疾病
Poscon =疾病的混和組
Infarct =梗死的患者
Healthy =健康對照
表1.候選基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物實時定量RT-PCR引物和探針的序列
權(quán)利要求
1.確定非肌細胞標記水平的試劑在制備用于鑒定具有心力衰竭發(fā)展風險的受試者的試劑中的用途，其中所述鑒定是通過如下方法進行的，所述方法包括 (a)確定來自所述受試者的生物樣品中的非肌細胞標記的水平，其中的非肌細胞標記選自由半乳糖苷凝集素-3和血小板反應蛋白2組成的組； (b)將所述標記的水平與標準水平進行比較；以及 (c)如果相對標準水平而言所述標記的水平是升高的，則確定具有心力衰竭發(fā)展的風險。
2.權(quán)利要求1中的用途，其中的生物樣品是來自外周血的血漿樣品或血清樣品。
3.權(quán)利要求1或者2中的用途，其中通過酶聯(lián)免疫吸附測定測量標記的水平。
4.權(quán)利要求1，2或3中的用途，其中所述標記是半乳糖苷凝集素_3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過測定半乳糖苷凝集素-3或者血小板反應蛋白-2的水平鑒定具有發(fā)生心力衰竭風險的受試者的方法。本發(fā)明涉及確定具有發(fā)生高血壓性終末器官損害風險(例如，特別是心力衰竭)的受試者的方法，包括(a)得到所述受試者的生物樣品；(b)確定所述樣品中至少一種非肌細胞標記的水平；(c)將所述標記的水平與標準水平進行比較；以及(d)確定標記的水平是否指示了發(fā)生高血壓性終末器官損害的風險。非肌細胞標記優(yōu)選是半乳糖苷凝集素-3或者血小板反應蛋白2。
文檔編號G01N33/94GK102998458SQ20121032122
公開日2013年3月27日 申請日期2004年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月9日
發(fā)明者Y·M·品托 申請人:馬斯特里赫特大學