專利名稱：一種肺炎衣原體抗原,制備該抗原的方法,利用該抗原檢測抗肺炎衣原體抗體的快速檢測 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于診斷肺炎衣原體感染的肺炎衣原體抗原，制備該抗原的方法，用該抗原測定抗肺炎衣原體抗體的方法及試劑。本發(fā)明在由肺炎衣原體引起的非典型肺炎的診斷中有重要意義。
背景技術(shù)：
衣原體是一種革蘭陰性、專性寄生于細(xì)胞內(nèi)的寄生物?？稍谌朔闻菥奘杉?xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、中性粒細(xì)胞中繁殖。它的生長具有獨特的周期，位于細(xì)胞外的衣原體原生小體(EB)別攝取到細(xì)胞內(nèi)形成包涵體，然后轉(zhuǎn)化成網(wǎng)狀小體(RB) ,RB具有繁殖 能力，但不具備感染能力。在細(xì)胞內(nèi)繁殖的RB很快轉(zhuǎn)化為EB，穿破包涵體和細(xì)胞壁到達(dá)細(xì)胞外。EB沒有繁殖能力，但具有感染能力。目前，已證實有四種衣原體，即沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、貓心衣原體和肺炎衣原體，其中肺炎衣原體可以通過空氣傳播感染人類。肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae,Cpn)是人類呼吸道疾病的重要病原體,主要引起人的非典型性肺炎、支氣管炎、鼻竇炎等呼吸道疾病。另外，流行病學(xué)和病原學(xué)研究認(rèn)為，肺炎衣原體感染與心血管疾病相關(guān)。Cpn經(jīng)飛沫或呼吸道分泌物傳播，可在家庭和集體場所相互感染。肺炎衣原體由于其獨特的寄生和抗原特性，常對人體造成直接或間接的危害，Cpn以被列為對中國人衛(wèi)生健康有重大影響的病原微生物之一。肺炎衣原體感染所致的臨床癥狀較輕，常被人們忽視，往往需要特異性的實驗室檢測才能被發(fā)現(xiàn)。另外臨床依據(jù)患者的癥狀和體征，很難鑒別細(xì)菌性、病毒性、肺炎支原體或肺炎衣原體的感染，以致在臨床用藥上存在困難，實驗室檢測有助于其鑒別診斷。微生物感染癥的實驗室檢測主要包括對感染部位等處的病原菌的檢測和對患者血清、體液中病原菌的抗體檢測兩種方法。病原菌的檢測包括病原菌分離培養(yǎng)、病原菌特異抗原檢測和基因檢測等方法。雖然培養(yǎng)法是肺炎衣原體實驗室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但肺炎衣原體是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生，培養(yǎng)條件要求苛刻，檢測靈敏度低，臨床適用性不強。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為代表的基因檢測技術(shù)雖然具有較高的特異性和敏感性，但其準(zhǔn)確性易受實驗條件和操作人員技術(shù)水平的影響。抗體檢測是肺炎衣原體感染較理想的實驗室檢測方法之一。Wang和Graystong早在1971年建立了的間接微量熒光實驗(微量IF)，微量IF實驗需要純化的衣原體EB，而且要求EB的形態(tài)或結(jié)構(gòu)完整，不能使用形態(tài)或結(jié)構(gòu)改變或破壞的EB。由于EB具有感染力和毒性，使用完整的的EB作抗原有潛在的傳染性，再加IF實驗步驟復(fù)雜，微量IF實驗在臨床檢驗中很少使用。隨后建立的肺炎衣原體抗體酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有檢測過程簡單、高通量檢測等特點，大多數(shù)試劑都使用完整的衣原體EB作抗原，但衣原體EB抗原可引起非特異性反應(yīng)。衣原體的代表性屬特異性抗原為脂多糖(LPS)，它與某些腸道菌Re突變體LPS有共同抗原，是肺炎衣原體的致病物質(zhì)，是一種細(xì)胞壁成分——內(nèi)毒素，其毒性作用可被特異性抗體中和。衣原體種特異性的抗原是其主要外膜蛋白(MOMP)，約占衣原體外膜蛋白的60%，分子量約為39. 5kDa，與肺炎衣原體外膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、生長代謝調(diào)節(jié)、抗原性和毒力性密切相關(guān)，是人類特異性體液免疫反應(yīng)的主要靶位。除MOMP外衣原體其他主要外膜抗原以屬特異性為主，但也存在一些種特異性，如分子量為40kDa D外膜抗原是屬特異性，分子量為43k Da、46kDa和53kDa的蛋白質(zhì)是種特異性抗原，還有一種分子量為98kDa的大分子蛋白可能是種特異性抗原。如上所述，衣原體的抗原性很復(fù)雜，同屬的衣原體在不同種間其抗原性也存在著明顯的差異。感染有肺炎衣原體的個體所產(chǎn)生的肺炎衣原體抗體同樣表現(xiàn)出與其抗原復(fù)雜性相一致的多樣性。因次，應(yīng)用衣原體EB菌體作檢測抗原或純度不高EB來源的純化抗原均可產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。另外，雖然已建立了肺炎衣原體抗體檢測方法，但它們無法達(dá)到肺炎衣原體快速檢測的臨床需求。因此，制備一種特異性強、檢測敏感度高的肺炎衣原體抗原及一種簡單、高效生產(chǎn)肺炎衣原體抗原的方法，有利于建立更高效的肺炎衣原體診斷方法、提高肺炎衣原體診斷水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是提供一種肺炎衣原體種特異性抗原，該抗原具有高度的種特異性和免疫反應(yīng)性。本發(fā)明的第二目的是提供一種制備肺炎衣原體抗原的方法，該方法制備的肺炎衣原體抗原具有種特異性和免疫反應(yīng)性。本發(fā)明的第三目的是提供一種測定抗肺炎衣原體抗體的方法，該方法為快速“一步檢測法”，具有靈敏度高、特異性強，檢測速度快、操作簡便，無需專門設(shè)備，適用于臨床檢測、流行病學(xué)調(diào)查和場地檢疫等多種場合。本發(fā)明的第四目的是提供一種肺炎衣原體抗體快速檢測試劑，它是一種特異性強、靈敏度高、快速、簡便的“一步法”肺炎衣原體抗體檢測試劑。本發(fā)明的主要內(nèi)容(I)肺炎衣原體抗原，它是一種采用基因工程技術(shù)人工合成抗原。(2)上面(I)中肺炎衣原體抗原，它與沙眼衣原體抗體和鸚鵡熱衣原體抗體不發(fā)生非特異性交叉反應(yīng)。(3) 一種制備肺炎衣原體抗原的方法，包括PCR克隆擴增肺炎衣原體MOMP抗原基因序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體，大腸桿菌表達(dá)肺炎衣原體MOMP抗原蛋白，采用透析法、梯度稀釋法和凝膠層析法復(fù)性包涵體，獲得具有三維結(jié)構(gòu)和免疫活性的重組肺炎衣原體MOMP抗原。(4) 一種肺炎衣原體抗體快速檢測方法，包括應(yīng)用上面(1)-(2)種的肺炎衣原體抗原。(5)上面(4)中肺炎衣原體抗體快速檢測方法，包括(1)-(2)種的肺炎衣原體抗原固定到一種硝酸纖維素膜，一種標(biāo)記抗體(二抗)固定到固相載體上，待測樣品與標(biāo)記抗體(二抗)接觸，若待測樣品中存在肺炎衣原體抗體，則肺炎衣原體抗體與標(biāo)記二抗反應(yīng)形成抗體一標(biāo)記二抗復(fù)合物，“復(fù)合物”在硝酸纖維素膜水平移動，遇到固定到膜上的肺炎衣原體抗原產(chǎn)生反應(yīng)，帶有標(biāo)記物的“復(fù)合物”就被特異地固定到抗原上，固定抗原的位置就會有顯色反應(yīng)若待測樣品不含肺炎衣原體抗體，則“復(fù)合物”不能固定到抗原的位置上，此處就沒有顯色反應(yīng)，可依據(jù)硝酸纖維素膜上固定抗原位置是否有顯色反應(yīng)，來判斷檢測結(jié)果，即待測樣品中是否有肺炎衣原體抗體。(6)上面(5)檢測肺炎衣原體抗體檢測方法，其中待測樣品是人的血清、血漿或全血。(7)上面(5)或￠)中測定肺炎衣原體抗體檢測的方法，其中的標(biāo)記抗體(二抗)是標(biāo)記的抗人IgG抗體或抗人IgM抗體。
(8)上述(5)-(7)中標(biāo)記抗體是膠體金或彩色膠乳標(biāo)記的抗體。(9) 一種快速檢測肺炎衣原體抗體的試劑，它所用抗原為上述(1)-(2)中的肺炎衣原體抗原。(10)上述(9)中用于快速檢測肺炎衣原體抗體的試劑，其中的標(biāo)記抗體是膠體金標(biāo)記抗體或彩色膠乳標(biāo)記抗體。下面對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。本發(fā)明的肺炎衣原體抗原是一種通過基因工程技術(shù)獲得的重組肺炎衣原體主要外膜蛋白(MOMP)。本發(fā)明肺炎衣原體抗原，主要通過將肺炎衣原體主要外膜蛋白(MOMP)基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體PET，MOMP基因-PET表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性重組菌，IPTG誘導(dǎo)重組菌表達(dá)肺炎衣原體MOMP蛋白，經(jīng)細(xì)菌裂解、包涵體溶解和重組蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)性與純化等步驟獲得。 下面將詳述本發(fā)明中制備肺炎衣原體抗原的方法。從基因BANK獲取肺炎衣原體MOMP基因序列，根據(jù)已知的肺炎衣原體MOMP抗原基因設(shè)計引物，PCR克隆擴增或人工合成肺炎衣原體MOMP抗原基因序列。目的基因經(jīng)雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切過的原核表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(大腸桿菌)、篩選陽性重組菌。陽性克隆菌提取質(zhì)粒、雙酶切鑒定和測序鑒定，證明插入基因目的基因正確。重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、離心得誘導(dǎo)表達(dá)重組菌，菌體重懸于上樣緩沖液后超聲裂解，離心獲得包涵體形式的蛋白沉淀，經(jīng)洗滌后溶于尿素溶液的變性表達(dá)蛋白。變性蛋白需要經(jīng)過結(jié)構(gòu)復(fù)性與純化才能獲得天然蛋白的免疫反應(yīng)原性和達(dá)到肺炎衣原體抗體檢測的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。對于肺炎衣原體MOMP重組蛋白包涵體復(fù)性方法，可應(yīng)用透析法、梯度稀釋法、凝膠層析法等，優(yōu)選透析法和梯度稀釋法相結(jié)合的方法，因為它們易于控制，蛋白復(fù)率高。對于包涵體復(fù)性后肺炎衣原體MOMP蛋白純化方法，可應(yīng)用凝膠層析、親和層析等，優(yōu)選凝膠層析法，因為它最易于控制，收率高。通過基因重組獲得的肺炎衣原體MOMP抗原具有較高的種特異性和敏感性。對于快速測定抗體的方法，這里列舉的是優(yōu)選的方法，如應(yīng)用各種標(biāo)記抗體的免疫層析測定，應(yīng)用各種標(biāo)記抗體的免疫滲濾法等。下面詳述免疫層析測定方法。抗肺炎衣原體抗體免疫層析測定方法包括下述步驟肺炎衣原體抗原固定到固相載體I上，標(biāo)記抗體(二抗)固定到固相2上，待測樣品與標(biāo)記抗體(二抗)接觸，若待測樣品中存在肺炎衣原體抗體，則肺炎衣原體抗體與標(biāo)記二抗反應(yīng)形成抗體-標(biāo)記二抗復(fù)
合物，“復(fù)合物”在固相載體I水平移動，遇到固定到載體I上的肺炎衣原體抗原產(chǎn)生反應(yīng)，帶有標(biāo)記物的“復(fù)合物”就被特異地固定到抗原上，固相載體上固定抗原的位置就會有顯色反應(yīng)；若待測樣品不含肺炎衣原體抗體，則“復(fù)合物”不能固定到抗原的位置上，此處就沒有顯色反應(yīng)，可依據(jù)固相載體上固定抗原位置是否有顯色反應(yīng)，來判斷檢測結(jié)果，即待測樣品中是否有肺炎衣原體抗體。對于固定相載體1，可應(yīng)用例如硝酸纖維素膜(NC膜)、PVDF膜等。優(yōu)選硝酸纖維素膜。對于固相載體2，可應(yīng)用例如玻纖纖維素膜，無紡布等任何一種形式。優(yōu)選玻璃纖維素作結(jié)合物釋放墊，因為它最易于控制。對于標(biāo)記的抗體，這里指的是用不同標(biāo)記物標(biāo)記的抗抗體，這里指的是抗入IgG·抗體和抗入IgM抗體,或是其部分分解產(chǎn)物,如F(ab' )2,Fab等,可依據(jù)被檢測抗體的種類適當(dāng)應(yīng)用。已知肺炎衣原體感染后，I 2周后出現(xiàn)IgM，IgG抗體出現(xiàn)較晚，但可保持較長時間。因此，在標(biāo)記的抗體與上述樣品中的抗體接觸的步驟中，優(yōu)選由標(biāo)記不同種類的抗體而得到的標(biāo)記的抗體在測定中單獨進(jìn)行反應(yīng)，對于標(biāo)記不同種類抗體得到的標(biāo)記的抗體，這里指的是標(biāo)記的抗IgM抗體，標(biāo)記的抗IgG抗體等。標(biāo)記抗體可適用的標(biāo)記物可以應(yīng)用膠體金、銀、硒和彩色膠乳等。對于本發(fā)明試劑，優(yōu)選分別以膠體金標(biāo)記抗IgM抗體和抗IgG抗體的免疫層析檢測試劑。本發(fā)明試劑可需要聯(lián)合其它組分并按照免疫層析檢測試劑的特點進(jìn)行組合。例如，在PVC襯板上設(shè)有加樣端吸水層、檢測層和吸水端吸水層，在檢測層和加樣端吸水層之間設(shè)有金標(biāo)抗體層；在檢測層上包被有抗原形成的檢測線和由抗鼠IgG抗體形成的控制線。


圖I顯示了發(fā)明試劑一檢測板的外觀結(jié)構(gòu)示意圖I-檢測板2-加樣孔3-檢視窗圖2顯示了發(fā)明試劑-檢測條的外部結(jié)構(gòu)示意圖4-加樣端吸水層 5-金標(biāo)抗體層 6-控制線 7-檢測線8-檢測層9-吸水端吸水層 10-襯板
具體實施例方式I)重組肺炎衣原體MOMP抗原重組表達(dá)、結(jié)構(gòu)復(fù)性與純化肺炎支原體MOMP基因參考GenBank序列M64064進(jìn)行全基因合成，合成時去除了信號肽序列并且進(jìn)行了大腸桿菌稀有密碼子優(yōu)化，引入酶切位點BamHI/XhoI。合成目的基因共 IlOlbp (366aa)。基因合成序列>CpnMOMPSequence
GGCGGATCCTTGCCTGTAGGTAACCCTTCTGATCCAAGCTTATTAATTGATGGTACAATCTGGGAGGGTGCTGCAGGTGATCCTTGCGATCCTTGCGCTACTTGGTGCGACGCTATTAGCTTACGTGCTGGTTTTTACGGTGACTATGTTTTCGACCGTATCTTAAAAGTAGATGCACCTAAAACATTTTCTATGGGTGCCAAGCCTACTGGTTCCGCTGCTGCAAACTATACTACTGCCGTAGATCGTCCTAACCCGGCCTACAATAAGCATTTACACGATGCAGAGTGGTTCACTAATGCAGGCTTCATTGCCTTAAACATTTGGGATCGCTTTGATGTTTTCTGTACTTTAGGTGCTTCTAATGGTTACATTCGTGGTAACTCTACAGCGTTCAATCTCGTTGGTTTATTCGGTGTTAAAGGTACTACTGTAAATGCAAATGAACTCCCAAACGTTTCTTTAAGTAACGGTGTTGTTGAACTTTACACAGACACCTCTTTCTCTTGGAGCGTAGGCGCTCGTGGTGCCTTATGGGAATGCGGTTGTGCAACTTTGGGTGCTGAATTCCAATATGCACAGTCCAAACCTAAAGTTGAAGAACTTAATGTGATCTGTAACGTATCGCAATTCTCTGTAAACAAACCTAAGGGCTATAAAGGCGTTGCTTTCCCTTTGCCAACAGACGCTGGCGTAGCAACAGCTACTGGTACAAAGTCTGCGACCATCAATTATCATGAATGGCAAGTAGGTGCCTCTCTCTCTTACCGTCTCAACTCTTTAGTGCCATACATTGGTGTACAATGGTCTCGCGCAACTTTTGATGCTGATAACATCCGCATTGCTCAGCCAAAACTCCCTACAGCTGTTTTAAACTTAACTGCATGGAACCCTTCTTTACTCGGTAATGCCACAGCATTGTCTACTACTGATTCGTTCTCAGACTTCATGCAAATTGTTTCCTGTCAGATCAACAAGTTTAAATCTCGTAAAGCTTGTGGTGTTACTGTAGGTGCTACTTTAGTTGATGCTGATAAATGGTCACTTACTGCAGAATTTAATTAACGAGC GTGCTGCTCACGTATCTGGTCAGTTCCGTTTCTAACTCGAGGGC重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定。分別用BamHI和XhoI對肺炎衣原體MOMP目的基因片段及pET30a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收后，16°C連接過夜，再轉(zhuǎn)入E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定。經(jīng)PCR及雙酶切鑒定，均證實有大小約I. IKb的基因片段插入載體，與預(yù)期的結(jié)果一致。測序結(jié)果表明插入目的基因片段為llOlbp，核酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中發(fā)表的肺炎衣原體MOMP基因序列完全相同，構(gòu)建的表達(dá)載體開放閱讀框正確，可以表達(dá)重組蛋白。重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)取50 μ lpET30a-cpnM0MP/BL21 (DE3)菌液加入到5ml含ΙΟΟμ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm搖菌過夜，次日按I : 50增菌于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至吸光A600為O. 6左右時，加入IPTG至濃度為lmmol/L，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4小時，5000rpm離心30分鐘，收集菌體，用TE緩沖液懸浮，充分混勻，_80°C，反復(fù)凍融3次，在功率370W，按超聲5分鐘，間隙5分鐘的頻率冰浴超聲180次，4°C，10000 X g離心15分鐘，收集沉淀，用2M的尿素(含50mmol/L Tris-HCl, pH 3. 0)洗滌2次，沉淀溶于8M尿素溶液(含50mmol/L Tris-HCl,pH 8. 0)，4°C保存。沉淀用SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)量。電泳條件，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。蛋白染色為考馬斯亮藍(lán)染色法，考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色3h，乙酸-乙醇脫色液脫色至背景無色為止。經(jīng)氨基酸分析重組蛋白含414個氨基酸，分子量為44. 6kDa，等點點為6. 43。重組蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)性與純化室溫條件下10mol/L，PH 7. 2PBS緩沖液對肺炎衣原體MOMP重組表達(dá)蛋白8mol/L尿素的溶解液進(jìn)行梯度透析稀釋，按溶液中尿素濃度分別為6m0l/L、4m0l/L、3m0l/L控制稀釋梯度，每個梯度稀釋的時間分別為3 4h。將完成稀釋復(fù)性的含3mol/L尿素的溶解液4°C放置24h。稀釋復(fù)性的溶解液10000r/min離心出去沉淀物質(zhì)，上清液通過以S-300為介質(zhì)的凝膠層析分離法進(jìn)行純化，從而獲得重組肺炎衣原體MOMP抗原。所得組肺炎衣原體MOMP抗原組分進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以確定蛋白質(zhì)的分子量及蛋白純度。電泳條件，濃縮膠濃度復(fù)5%，分離膠濃度為12%。蛋白染色為考馬斯亮藍(lán)染色法，考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色3h，乙酸-乙醇脫色液脫色至背景無色為止。主蛋白條帶出現(xiàn)在44. 6kDa處，蛋白純度達(dá)95%以上。2)肺炎衣原體抗體金標(biāo)快速檢測試劑的制備上述所得到基因重組肺炎衣原體MOMP蛋白作檢測抗原，在硝酸纖維素膜包被檢測線，參照圖2，制備肺炎衣原體抗體金標(biāo)快速檢測試劑，其組成成分包括在襯板10上設(shè)有加樣端吸水層4、檢測層8和吸水層9，在檢測層和加樣端吸水層4之間設(shè)有金標(biāo)抗肺炎衣原體抗體抗體層5，在檢測層8上包被有檢測線7和控制線6。其中加樣端吸水層4和吸水端吸水層9由多層濾紙制成；檢測層8為硝酸纖維素膜；金標(biāo)抗體層為玻璃纖維或無紡布浸取膠體金標(biāo)記抗體。檢測試劑制備程序包括制備金標(biāo)抗體層5和檢測層8的控制線6、檢測線7的包被，然后再在襯板10上組合金標(biāo)測試條和檢測卡I。在塑料墊板10的兩端分別粘貼加樣 端吸水紙層4與吸水端吸水層9 ;在其中段粘貼包被檢測線和控制線的纖維素膜層8，在加樣端吸水紙層4與纖維素膜層8的交接部位，夾貼含金標(biāo)抗體層5的玻璃纖維，玻璃纖維的4/5部分在加樣端吸水紙層4中間，1/5部分在纖維素膜層8上。然后按4毫米寬、8厘米長規(guī)格切條。再參照圖5，將檢測條組裝于塑料盒內(nèi)形成檢測卡I。盒蓋上加樣孔2正對測試條的加樣端吸水紙層4，觀察孔3正對纖維素膜的檢測層8。上述的金標(biāo)抗體層的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備，取IOOmg氯金酸溶于IOOOml三蒸水中，加入15ml、在濃度為1%的檸檬酸三鈉，煮沸15分鐘，可得到15 50納米的膠體金溶液；ii膠體金標(biāo)記抗人IgG單克隆抗體，取IOOm/膠體金溶液,用O. 2m碳酸鉀溶液調(diào)pH8. 4, A 6mg抗人IgG單克隆抗體,攪拌20分鐘,再加入240mg牛血清白蛋白(BSA)，繼續(xù)攪拌5分鐘，4°C靜置2 4小時；iii將上述膠體金溶液經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 15分鐘，去沉淀物，得上清液；iv將上清液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心60分鐘離心得沉淀物；v將沉淀物溶于4ml O. 02M PH7. 4Tris-Hcl緩沖液得膠體金溶液，該緩沖液中含O. 25%BSA和O. 02%疊氮鈉；vi將膠體金溶液浸入玻璃纖維或無紡布至液體開始滲出為止，37°C干燥2小時形成金標(biāo)抗體層5。所述的檢測層8是在硝酸纖維素膜上設(shè)有重組肺炎衣原體MOMP抗原構(gòu)成的檢測線7和由羊或兔抗鼠IgG抗體形成的質(zhì)控線6。其制備方法是取上述I)所制備的重組肺炎衣原體MOMP抗原，調(diào)濃度為I. 5mg/ml，加入2%的甲醇，用噴膜機在纖維素膜中段噴檢測線7 ;再取羊或兔抗鼠IgG調(diào)濃度為I. 5mg/ml，用噴膜機在纖維素膜中段，距檢測線O. 5cm處，噴控制線6，按20 μ l/10cm設(shè)置噴膜量，噴膜后置于37°C干燥2小時，再片O. 01mlpH7. O含10%小牛血清的PBS，在37°C下封閉30分鐘，O. 01mlpH7. O的PBS漂洗，37°C干燥。3)肺炎衣原體抗體的測定取樣品血清10 μ I滴于檢測板I的樣品孔2內(nèi)，再滴加100 μ I樣品稀釋液于樣品孔2內(nèi)，在觀察窗3觀察檢測結(jié)果，觀察結(jié)果20分鐘內(nèi)有效。若樣品血清中含有抗肺炎衣原體抗體，則在觀察窗內(nèi)看檢測線和控制線兩條紅色線，檢測結(jié)果判定為陽性；若血清中不含含有抗肺炎衣原體抗體，則在觀察窗內(nèi)控制線位置看一條條紅色線，檢測結(jié)果判定為陰性；若觀察窗內(nèi)一條紅色都看不到，則檢測無效。上述樣品稀釋液可以選用O. Olml pH7. OPBS和O. 9 % NaCl，優(yōu)選O. OlmlpH7. OPBS,因為它顯色結(jié)果穩(wěn)定。4)對人血清的敏感性和特異
用本發(fā)明抗原及檢測方法制備肺炎衣原體抗體(IgG)金標(biāo)檢測試劑，檢測36份肺炎衣原體抗體陽性(IgG)患者血清和84份肺炎衣原體抗體陰性(IgG)血清樣品來進(jìn)行特異性和敏感性試驗。同時，為了驗證本發(fā)明的效果，對用本發(fā)明的肺炎衣原體抗原進(jìn)行的金標(biāo)檢測試劑與歐蒙公司(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG)產(chǎn)的肺炎衣原體抗體(IgG)ELISA試劑盒進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表I、表2。表I :本發(fā)明抗原的特異性及敏感性檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種肺炎衣原體抗原，它是一種采用基因工程技術(shù)人工合成抗原。
2.權(quán)利要求I的肺炎衣原體抗原，它與沙眼衣原體和鸚鵡熱衣原體抗體不發(fā)生非特異性交叉反應(yīng)。
3.一種制備肺炎衣原體抗原的方法，包括PCR克隆擴增肺炎衣原體MOMP抗原基因序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體，大腸桿菌表達(dá)肺炎衣原體MOMP抗原蛋白，采用透析法、梯度稀釋法、和凝膠層析法復(fù)性包涵體，獲得具有三維結(jié)構(gòu)和免疫活性的重組肺炎衣原體MOMP抗原。
4.一種肺炎衣原體抗體快速檢測方法，包括應(yīng)用權(quán)利要求1-3中任一權(quán)項的肺炎衣原體抗原。
5.權(quán)利要求4中肺炎衣原體抗體快速檢測方法，包括權(quán)利要求1-3中的肺炎衣原體抗原固定到一種硝酸纖維素膜，一種標(biāo)記抗體(二抗)固定到固相載體上，待測樣品與標(biāo)記抗體(二抗)接觸，若待測樣品中存在肺炎衣原體抗體，則肺炎衣原體抗體與標(biāo)記二抗反應(yīng)形成抗體一標(biāo)記二抗復(fù)合物，“復(fù)合物”在硝酸纖維素膜水平移動，遇到固定到膜上的肺炎衣原體抗原產(chǎn)生反應(yīng)，帶有標(biāo)記物的“復(fù)合物”就被特異地固定到抗原上，固定抗原的位置就會有顯色反應(yīng)，若待測樣品不含肺炎衣原體抗體，則“復(fù)合物”不能固定到抗原的位置上，此處就沒有顯色反應(yīng)，可依據(jù)硝酸纖維素膜上固定抗原位置是否有顯色反應(yīng)，來判斷檢測結(jié)果，即待測樣品中是否有肺炎衣原體抗體。
6.權(quán)利要求5檢測肺炎衣原體抗體檢測方法，其中待測樣品是人的血清、血漿或全血。
7.上面權(quán)利要求5或6中測定肺炎衣原體抗體檢測的方法，其中的標(biāo)記抗體(二抗)是標(biāo)記的抗人IgG抗體或抗人IgM抗體。
8.權(quán)利要求5-7中標(biāo)記抗體是膠體金或彩色膠乳標(biāo)記的抗體。
9.一種快速檢測肺炎衣原體抗體的試劑，它所用抗原為權(quán)利要求1-3中的肺炎衣原體抗原。
10.上述權(quán)利要求9中用于快速檢測肺炎衣原體抗體的試劑，其中的標(biāo)記抗體是膠體金標(biāo)記抗體或彩色膠乳標(biāo)記抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種肺炎衣原體基因工程表達(dá)人工抗原；制備該抗原的方法，該方法包括包括PCR克隆擴增肺炎衣原體MOMP抗原基因序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體，大腸桿菌表達(dá)肺炎衣原體MOMP抗原蛋白，采用透析法、梯度稀釋法、和凝膠層析法復(fù)性包涵體，獲得具有三維結(jié)構(gòu)和免疫活性的重組肺炎衣原體MOMP抗原；一種檢測肺炎衣原體抗體快速檢測方法，該方法包括應(yīng)用肺炎衣原體抗原；一種用于肺炎衣原體抗體檢測的快速檢測試劑，該試劑包含肺炎衣原體抗原。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種肺炎衣原體抗原，該抗原具有高度的特異性。本發(fā)明提供了制備該抗原的方法，快速測定肺炎衣原體抗體的方法，以及用于快速測定肺炎衣原體抗體的試劑。
文檔編號G01N33/68GK102887944SQ20121032632
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月6日
發(fā)明者李克生, 杜慧芬, 周海飛 申請人:李克生