一種誘導(dǎo)短壽抗體反應(yīng)的血吸蟲(chóng)抗原和檢測(cè)該抗體反應(yīng)的血吸蟲(chóng)病診斷試劑盒及檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】一種誘導(dǎo)短壽抗體反應(yīng)的血吸蟲(chóng)抗原和檢測(cè)該抗體反應(yīng)的血吸蟲(chóng)病診斷試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于血吸蟲(chóng)病防治與免疫學(xué)診斷【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用免疫印漬技術(shù)與質(zhì)譜分析方法鑒定出能在血吸蟲(chóng)感染者體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性短壽抗體反應(yīng)的三磷酸甘油醛脫氫酶（SjGAPDH）等蛋白分子，采用基因工程技術(shù)制備了重組SjGAPDH蛋白，構(gòu)建了以重組SjGAPDH蛋白檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)感染患者體內(nèi)抗SjGAPDH蛋白特異性短壽抗體反應(yīng)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，達(dá)到對(duì)血吸蟲(chóng)感染患者進(jìn)行診斷，及對(duì)其治療效果進(jìn)行評(píng)估的目的。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種誘導(dǎo)短壽抗體反應(yīng)的血吸蟲(chóng)抗原和檢測(cè)該抗體反應(yīng)的血吸蟲(chóng)病診斷試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)抗原依賴(lài)性特異性短壽抗體反應(yīng)的抗原、制備、診斷試劑盒及檢測(cè)方法，涉及采用免疫印潰技術(shù)與蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲(chóng)三磷酸甘油醛脫氫酶(Sj GAPDH)等在日本血吸蟲(chóng)感染者體內(nèi)能誘導(dǎo)特異性的抗原依賴(lài)性短壽抗體反應(yīng)的分子，制備了重組的Sj GAPDH蛋白，建立了用于血吸蟲(chóng)病診斷與療效考核的檢測(cè)抗Sj GAPDH特異性短壽抗體反應(yīng)的試劑盒，屬于免疫學(xué)診斷【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]血吸蟲(chóng)病是最重要的人類(lèi)熱帶病之一，全世界有76個(gè)國(guó)家有血吸蟲(chóng)病流行，估計(jì)血吸蟲(chóng)病人2千萬(wàn)，有6億居民受到血吸蟲(chóng)感染的威脅。血吸蟲(chóng)病流行不僅嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，亦嚴(yán)重阻礙當(dāng)?shù)氐纳鐣?huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。缺少有效的血吸蟲(chóng)病診斷與流行病學(xué)調(diào)查手段是導(dǎo)致血吸蟲(chóng)病流行難以阻斷的重要原因之一。檢測(cè)患者糞便中的血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵及血清中的血吸蟲(chóng)循環(huán)抗原是對(duì)血吸蟲(chóng)感染進(jìn)行確診的主要手段，糞檢蟲(chóng)卵一直以來(lái)都是血吸蟲(chóng)感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但隨著血吸蟲(chóng)病治療藥物一吡喹酮的大規(guī)模應(yīng)用，尤其是在中國(guó)，血吸蟲(chóng)病流行區(qū)人群的血吸蟲(chóng)感染率與感染度已明顯下降，患者糞便中的蟲(chóng)卵數(shù)量及血清中的血吸蟲(chóng)循環(huán)抗原的量明顯減少，檢測(cè)方法的敏感性亦隨之下降，漏檢率很高，已難以滿足臨床診斷的需要。因此，有必要發(fā)展有效的血吸蟲(chóng)感染診斷措施，發(fā)現(xiàn)傳染源并及時(shí)消滅之，以促進(jìn)血吸蟲(chóng)病流行的控制工作。
[0003]抗體是宿主抵御外來(lái)病原體感染的一種介質(zhì)，是宿主免疫系統(tǒng)受到感染病原體抗原成分的刺激后產(chǎn)生。血吸蟲(chóng)寄生于宿主血液循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)，在其生命過(guò)程中不斷向宿主血液中排泄分泌一些抗原成分，這些抗原成分作為異物，刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)并伴隨著大量的抗體產(chǎn)生。通過(guò)檢測(cè)被檢測(cè)者體內(nèi)是否存在抗血吸蟲(chóng)抗原的特異性抗體，即可確定被測(cè)者是否曾經(jīng)感染過(guò)血吸蟲(chóng)?？贵w檢測(cè)方法已廣泛用于血吸蟲(chóng)病的篩查。常用的方法有:間接血凝法(IHA)、環(huán)卵沉淀法(COPT )、尾蝴膜法(CHR)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、免疫層析法(Dipstick，又稱(chēng)試紙條法)和免疫滲濾法等。常用的抗原為可溶性蟲(chóng)卵抗原?？扇苄韵x(chóng)卵抗原(SEA)是一個(gè)由眾多抗原成份組成的混合物，用SEA作為抗體檢測(cè)抗原存在一定的缺點(diǎn)，如易與其它寄生蟲(chóng)抗原產(chǎn)生交叉反應(yīng)，患者體內(nèi)抗SEA抗體在其被治愈后依然可以存在很長(zhǎng)的時(shí)間，甚至可存在一生。檢測(cè)抗SEA抗體只能用于有血吸蟲(chóng)感染史者的篩查，而不能用于對(duì)正在感染的患者進(jìn)行確診。已有研究結(jié)果表明，由于抗原結(jié)構(gòu)與性質(zhì)之間的差異，不同的抗原誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)存在明顯的差異，有的是抗原特異性的，有的是非特異性的；有的抗體反應(yīng)可以在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期維持，甚至一生，稱(chēng)之為長(zhǎng)壽抗體反應(yīng)；而有的抗原誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)在宿主體內(nèi)存在的時(shí)間與體內(nèi)是否存在誘導(dǎo)這一抗體反應(yīng)的特異性抗原相關(guān)。當(dāng)這種特異性抗原存在時(shí)，這種抗體反應(yīng)同時(shí)存在，否則這種抗體反應(yīng)則消失，這種抗體反應(yīng)稱(chēng)為“短壽抗體反應(yīng)”。參與這種短壽抗體反應(yīng)的抗體的產(chǎn)生是抗原依賴(lài)性的，與宿主體內(nèi)是否存在病原體感染密切相關(guān)，當(dāng)病人治愈后，病原體在病人體內(nèi)消失，這種抗體反應(yīng)亦迅速下降或徹底消失。因此檢測(cè)參與這種短壽抗體反應(yīng)的抗原依賴(lài)性抗體具有對(duì)正在感染血吸蟲(chóng)的病人進(jìn)行確診與對(duì)治療效果進(jìn)行評(píng)估的價(jià)值，可以替代病原學(xué)診斷方法。
[0004]本發(fā)明采用免疫印潰技術(shù)與蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)，鑒定出血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)排泄分泌物中Sj GAPDH等一批蛋白分子能在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)抗原依賴(lài)的特異性短壽抗體反應(yīng)，采用基因工程技術(shù)制備重組Sj GAPDH蛋白分子，建立檢測(cè)抗Sj GAPDH蛋白分子短壽抗體反應(yīng)的酶聯(lián)免疫方法及診斷試劑盒。證明了使用Sj GAPDH蛋白分子檢測(cè)特異性抗體反應(yīng)具有高度特異性，與其它寄生蟲(chóng)無(wú)交叉反應(yīng)；血吸蟲(chóng)病患者體內(nèi)抗Sj GAPDH抗體反應(yīng)隨著治療后時(shí)間的延長(zhǎng)迅速下降，在治療后8-12周可轉(zhuǎn)為陰性，具有療效考核價(jià)值，為日本血吸蟲(chóng)病的診斷與流行病學(xué)調(diào)查 提供一個(gè)新工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定誘導(dǎo)抗原依賴(lài)性特異性短壽抗體反應(yīng)的血吸蟲(chóng)抗原分子及其基因的方法。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供一種純化的在宿主體內(nèi)能誘導(dǎo)短壽抗體反應(yīng)的重組日本血吸蟲(chóng)三磷酸甘油醛脫氫酶(Sj GAPDH)蛋白抗原，及其基因工程制備方法。
[0007]本發(fā)明的第三個(gè)目的還在于提供一種檢測(cè)血吸蟲(chóng)感染者體內(nèi)抗Sj GAPDH特異性抗體的試劑盒及檢測(cè)方法。
[0008]為達(dá)到鑒定在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)抗原依賴(lài)的特異性短壽抗體反應(yīng)蛋白抗原的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:采用二維電泳免疫印潰方法鑒定日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)排泄分泌抗原成分中能誘導(dǎo)抗原依賴(lài)的特異性短壽抗體反應(yīng)的蛋白斑點(diǎn)，然后通過(guò)蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析確定該蛋白斑點(diǎn)的分子本質(zhì)及編碼基因。
[0009]具體地，將血吸蟲(chóng)尾蝴感染家兔，42天后通過(guò)門(mén)靜脈灌注收集血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)。將血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)在體外進(jìn)行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液中的血吸蟲(chóng)排泄分泌抗原，將排泄分泌抗原進(jìn)行蛋白質(zhì)二維電泳，使不同的蛋白分子按其等電點(diǎn)及分子量的大小進(jìn)行分離，然后將其電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將吸附有血吸蟲(chóng)排泄分泌抗原的硝酸纖維素膜分別與健康兔血清、血吸蟲(chóng)感染兔血清及經(jīng)吡喹酮治療后的血吸蟲(chóng)感染兔血清進(jìn)行免疫識(shí)別反應(yīng)，比較同一蛋白斑點(diǎn)分別與健康兔血清、血吸蟲(chóng)感染兔血清及經(jīng)吡喹酮治療后的血吸蟲(chóng)感染兔血清的識(shí)別情況，鑒定出42個(gè)蛋白斑點(diǎn)不能與健康兔血清反應(yīng)，能與血吸蟲(chóng)感染兔血清發(fā)生明顯的反應(yīng)，但與治療后血吸蟲(chóng)感染兔血清的反應(yīng)隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減弱，部分蛋白的抗體IgG反應(yīng)至治療后8-12周消失，證明這些蛋白分子在血吸蟲(chóng)感染家兔體內(nèi)能誘導(dǎo)短壽特異抗體反應(yīng)。
[0010]為鑒定上述能誘導(dǎo)短壽抗體反應(yīng)的蛋白的本質(zhì)及編碼基因，本發(fā)明從二維電泳膠上將相應(yīng)的蛋白斑點(diǎn)切下，進(jìn)行MALD1-T0F質(zhì)譜鑒定和基因比對(duì)，確定在血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)排泄分泌抗原中能誘導(dǎo)短壽抗體反應(yīng)的分子主要是:三磷酸甘油醛脫氫酶(Sj GAPDH)，果糖-1，2-二磷酯醛縮酶(Sj FBPA)，未知功能蛋白 SJCHGC 00411、SJCHGC 05757、SJCHGC01391、SJCHGC 02266等等，此外還有一批蛋白斑點(diǎn)未能鑒定出其基因本質(zhì)。
[0011]一種在血吸蟲(chóng)感染人或家兔體內(nèi)誘導(dǎo)抗原依賴(lài)的特異性短壽抗體反應(yīng)的日本血吸蟲(chóng)三磷酸甘油醛脫氫酶Sj GAPDH蛋白，其編碼基因的核苷酸序列與SEQ ID N0.1的同源性在90%以上，其蛋白質(zhì)氨基酸與SEQ ID N0.2的同源性保持在90%以上。
[0012]一種重組Sj GAPDH蛋白的構(gòu)建方法，
為達(dá)到制備純化重組三磷酸甘油醛脫氫酶蛋白的目的，本發(fā)明提供一種制備編碼SjGAPDH基因的方法。
[0013](I)日本血吸蟲(chóng)三磷酸甘油醛脫氫酶Sj GAPDH編碼基因的制備
根據(jù)已發(fā)表的Sj GAPDH基因SEQ ID N0.1的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)用于擴(kuò)增Sj GAPDH開(kāi)放閱讀框基因片段的基因特異性引物，
Sj GAPDHl:5’ -ATGCTAGCATGTCGAAGGCTAAGGTTGGTATCAAT-3'含有 Nhel 酶切位點(diǎn)；
Sj GAPDH2:5’ -AAGAGCTCTTAAGAATGGTCGACTCTATGC-3’,含有 Sacl 酶切位點(diǎn)；
采用RT-PCR方法從日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA中擴(kuò)增出Sj GAPDH的編碼區(qū)基因片段。將Sj GAPDH基因片段進(jìn)行TA克隆，制備重組質(zhì)粒Sj GAPDH/pEGM_T。
[0014]編碼Sj GAPDH的基因序列與核甘酸序列SEQ ID NO:1保持90%以上的同源性。
[0015](2)本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建了體外表達(dá)Sj GAPDH蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒SjGAPDH-pET28a的方法。具體地，通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶Nhel和Sacl對(duì)重組質(zhì)粒Sj GAPDH/PGEM-T進(jìn)行限制性酶切，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，回收5 ’端帶有Nhe1、3 ’端帶SacI酶切位點(diǎn)的Sj GAPDH基因片 段；同法對(duì)表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)進(jìn)行限制性酶切制備5’端帶有Nhel酶切位點(diǎn)，3’端帶有Sacl酶切位點(diǎn)的的線性化pET28a(+)質(zhì)粒；將Sj GAPDH基因片段與線性化質(zhì)粒pET28a(+)按1: 3的比例混合，用T4 DNA連接酶連接構(gòu)成重組表達(dá)質(zhì)粒SjGAPDH/pET28a ;但Sj GAPDH蛋白表達(dá)還可以采用除pET28a(+)以外的其它原核、真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明優(yōu)選的質(zhì)粒是pET28a(+)。
[0016](3)本發(fā)明提供一種表達(dá)重組Sj GAPDH蛋白基因工程菌株的構(gòu)建方法。具體地，將重組表達(dá)質(zhì)粒Sj GAPDH-pET28a轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，通過(guò)卡那霉素篩選含有重組表達(dá)質(zhì)粒Sj GAPDH-pET28a的工程菌落。重組Sj GAPDH蛋白可使用除大腸桿菌BL21以外的其它受體菌進(jìn)行表達(dá)，本發(fā)明優(yōu)選的受體菌是大腸桿菌BL21。
[0017](4)本發(fā)明還提供一種大量表達(dá)與純化重組Sj GAPDH蛋白的方法。具體地，將含有重組表達(dá)質(zhì)粒Sj GAPDH-pET28a的表達(dá)工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，第二天轉(zhuǎn)種到大體積的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)4小時(shí)以后加入終濃度為ImM的異丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)誘導(dǎo)。表達(dá)細(xì)菌的沉淀物用于表達(dá)分析與純化。
[0018]Sj GAPDH蛋白表達(dá)可以通過(guò)一般生化與免疫手段進(jìn)行分析，但不限局于SDS-PAGE和 Westernblotting 等方法。
[0019]本發(fā)明也提供一種重組Sj GAPDH蛋白的分離純化方法。
[0020]具體地，該分離純化方法利用了重組表達(dá)的Sj GAPDH蛋白未端上帶有一個(gè)由6個(gè)組氨酸HIS組成的標(biāo)簽的特點(diǎn)，選擇鎳離子(Ni+)螯合親和層析膠捕獲了表達(dá)產(chǎn)物中的重組Sj GAPDH蛋白質(zhì)，將表達(dá)產(chǎn)物上清液過(guò)鎳離子親和層析柱，使用咪唑進(jìn)行交換，獲得純度可以達(dá)到98%以上的純化重組Sj GAPDH蛋白。
[0021]本發(fā)明還提供一種以重組Sj GAPDH蛋白為檢測(cè)抗原的日本血吸蟲(chóng)感染酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。該試劑盒具有對(duì)血吸蟲(chóng)感染進(jìn)行診斷與對(duì)治療效果進(jìn)行評(píng)估的價(jià)值。該試劑盒的工作原理是:當(dāng)患者體內(nèi)存在活血吸蟲(chóng)時(shí)，患者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗Sj GAPDH蛋白的抗原特異性短壽抗體反應(yīng)，血清中存在抗Sj GAPDH蛋白的特異性抗體IgG。當(dāng)患者經(jīng)過(guò)藥物治療，體內(nèi)的血吸蟲(chóng)被清除，抗Sj GAPDH蛋白的抗原特異性短壽抗體反應(yīng)迅速消失，血清中抗Sj GAPDH蛋白特異性抗體IgG水平亦迅速下降或消失。因此，經(jīng)過(guò)檢測(cè)患者血清中是否存在抗Sj GAPDH蛋白的特異性抗體IgG即可對(duì)患者是否感染血吸蟲(chóng)做出診斷,或通過(guò)對(duì)血吸蟲(chóng)病患者治療前、治療后體內(nèi)抗Sj GAPDH蛋白特異性抗體IgG水平的變化進(jìn)行比較來(lái)評(píng)估治療效果。
[0022]試劑盒的組成如下:
(1)預(yù)包被重組SjGAPDH蛋白抗原的96孔微孔板，濃度為I U g/孔；
(2)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG二抗，IOOmLX I瓶，用抗體稀釋液稀釋?zhuān)ぷ鳚舛葹?1: 10000 ； (3)血吸蟲(chóng)抗體IgG陽(yáng)性對(duì)照品，IOOmLXI瓶，抗日本血吸蟲(chóng)Sj GAPDH蛋白的抗體IgG,濃度為I U g/mL ；
(4)血吸蟲(chóng)抗體IgG陰性對(duì)照品，IOOmLXI瓶，純化的健康人IgG，濃度為I y g/mL ；
(5)顯色液A,5mLX I瓶,顯色液A配制:檸檬酸0.42g,過(guò)氧化脲0.08g,無(wú)水醋酸鈉
2.45g,乙酰苯胺0.014g,蒸懼水加至200mL ；
(6)顯色液B，5mLXI瓶，顯色液B配制:檸檬酸0.38g，3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽TMB-HCl 0.09g,乙二胺四乙酸二鈉EDTA-2Na 0.067g，硫柳汞0.02g ;蒸餾水加至180mL ；
(7)濃縮洗滌液，50mLXl瓶，含0.05% Tween-20的PBST濃縮液；用蒸餾水或去離子水稀釋?zhuān)ぷ鳚舛葹?: 20;
(8)樣品稀釋液，12mLXI瓶，含2%BSA的PBST ；
(9)抗體稀釋液，25mLXI瓶，含2%BSA的PBST ；
(10)終止液，6mLXl瓶，2M H2SO4 ；
(11)操作說(shuō)明書(shū)；
(12)外包裝盒。
[0023]所述的試劑盒，使用一種能在血吸蟲(chóng)感染宿主體內(nèi)誘導(dǎo)抗原依賴(lài)性特異性短壽抗體反應(yīng)的血吸蟲(chóng)抗原，作為抗體IgG的檢測(cè)抗原，該抗原分子是重組Sj GAPDH蛋白；所述的重組Sj GAPDH抗原為日本血吸蟲(chóng)三磷酸甘油醛脫氫酶，其氨基酸序列與SEQ ID N0.2應(yīng)保持90%以上的同源性。
[0024]所述的試劑盒，所述的抗原分子使用Sj GAPDH以外的其它能誘導(dǎo)特異性短壽抗體反應(yīng)的日本血吸蟲(chóng)抗原分子，如:果糖-1，2- 二磷酯醛縮酶Sj FBPA,未知功能蛋白SJCHGC00411、SJCHGC 05757、SJCHGC 01391、SJCHGC 02266。
[0025]所述的試劑盒，亦可使用生物素-親和素信號(hào)放大系統(tǒng)來(lái)進(jìn)一步改進(jìn)本發(fā)明試劑盒的敏感性。
[0026]所述的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG 二抗的工作濃度為1: 10000稀釋。
[0027]所述的血吸蟲(chóng)抗體IgG陽(yáng)性對(duì)照品系由純化的抗日本血吸蟲(chóng)Sj GAPDH抗體IgG用PBS配制而成，采用本試劑盒檢測(cè)其吸光值A(chǔ)450nm > 0.5。
[0028]所述的血吸蟲(chóng)抗體IgG陰性對(duì)照系由純化的健康人IgG用PBS配制而成，采用本試劑盒檢測(cè)其吸光值A(chǔ)450nm≤0.1。
[0029]所述的顯色液A含有過(guò)氧還氫。[0030]所述的顯色液B含有3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽TMB-HCl (TMB-HC1)。
[0031]所述的濃縮洗滌液(20倍)為磷酸緩沖液，含有一定濃度的Tween-20。
[0032]所述的樣品稀釋液、抗體稀釋液為磷酸緩沖液。
[0033]所述終止液為2M的硫酸溶液。
[0034]本發(fā)明還提供一種檢測(cè)參與抗Sj GAPDH蛋白短壽抗體反應(yīng)的抗體IgG的檢測(cè)方法。具體檢測(cè)過(guò)程如下:
1、試劑盒在室溫平衡30min。濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水進(jìn)行20倍稀釋?zhuān)孟♂屜礈煲骸?br> [0035]2、取所需要使用的孔數(shù)(包括樣本檢測(cè)孔，陽(yáng)性對(duì)照孔，陰性對(duì)照孔，空白孔)的酶標(biāo)條，每次檢測(cè)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照孔一個(gè)，陰性對(duì)照孔一個(gè)，空白對(duì)照孔2個(gè)，剩余的酶標(biāo)條放入密封袋中保存。
[0036]3、將酶標(biāo)條固定于板架上，檢測(cè)孔加入IOOmL樣品稀釋液，再加入ImL待檢測(cè)樣品血清(或直接加入1: 100稀釋的血清樣本)，對(duì)照孔分別直接加入相應(yīng)的對(duì)照樣本。在37°C溫箱溫 育45 min。
[0037]4、甩盡孔中液體，加入稀釋洗滌液至滿孔(約350mL)，震蕩30s后室溫靜置30s，再加入稀釋洗滌液洗滌，如此重復(fù)5次。
[0038]5、各孔加入HRP標(biāo)記羊抗人IgG抗體稀釋液(1:10000稀釋)IOOmL,在37°C溫箱溫育45 min。
[0039]6、同上方法用稀釋洗滌液洗板5次，吸干各孔殘留液體，將A、B液等體積混勻后，各孔均加入A、B混合顯色液50mL,室溫避光顯色5min,各孔加入終止液50mL,輕微振蕩混勻。
[0040]7、以空白對(duì)照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450nm的吸光值。
[0041]8、檢測(cè)參與抗Sj GAPDH蛋白短壽抗體反應(yīng)的抗體IgG結(jié)果判斷:
判讀前所有對(duì)照孔與樣本孔的A450nm值均應(yīng)減去空白對(duì)照孔的A450nm值；具體地: 陽(yáng)性:樣本孔的A450nm值≥陰性對(duì)照孔A450nm值的2.1倍，抗Sj GAPDH抗體陽(yáng)性。
[0042]陰性:樣本孔的A450nm值≤陰性對(duì)照孔A450nm值的2.1倍?？筍j GAPDH抗體陰性。
[0043]本發(fā)明的有益效果:證明了日本血吸蟲(chóng)三磷酸甘油醛脫氫酶(Sj GAPDH)等蛋白分子在被感染宿主體內(nèi)能誘導(dǎo)抗原依賴(lài)性特異性短壽抗體反應(yīng)。采用基因工程技術(shù)制備了純化的重組Sj GAPDH蛋白。建立了檢測(cè)參與特異性抗Sj GAPDH蛋白短壽抗體反應(yīng)的抗體IgG酶聯(lián)免疫學(xué)方法及試劑盒。該方法與常規(guī)的血吸蟲(chóng)抗體檢測(cè)方法相比具有能對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染進(jìn)行確診與療效考核的功能，具有更好的敏感性與特異性，可為日本血吸蟲(chóng)病的診斷與療效考核提供一種新的手段。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0044]圖1排泄分泌抗原二維電泳免疫印潰反應(yīng)圖；a、ESAg 二維電泳考馬斯亮藍(lán)染色圖；b、ESAg與血吸蟲(chóng)感染前兔血清反應(yīng)；c、ESAg與血吸蟲(chóng)感染后6周的兔血清反應(yīng)；d、ESAg與治療后4周的兔血清反應(yīng)；e、ESAg與治療后8周的兔血清反應(yīng)；f、ESAg與治療后12周的兔血清反應(yīng)。[0045]圖2誘導(dǎo)短壽抗體反應(yīng)的36/37 kDa蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果；
A、SjGAPDH質(zhì)譜指紋圖。誘導(dǎo)短壽抗體反應(yīng)的蛋白點(diǎn)(pi 6-9，MW30-36kDa以及pi為4-5, MW 25-36 kDa) 2，3，4，5，6，7，8，9，11 鑒定為三磷酸甘油脫氫酶；12，14，15 果糖 1，6-二磷酸醛縮酶；1，10，13，16，17 未被鑒定出;18，19,20,21 鑒定為 SJCHGC 02266 ;26，27，30 鑒定為 SJCHGC 01391 ;34，35 鑒定為 SJCHGC 05757 ；
B、三磷酸甘油脫氫酶酶切肽段的肽指紋圖譜(SjFBPA質(zhì)譜指紋圖)；
C、果糖1，6_二磷酸醛縮酶酶切肽段的肽指紋圖譜。
[0046]圖3 Sj GAPDH基因擴(kuò)增的電泳圖:M、lkb DNA分子量標(biāo)志物；l、Sj GAPDH基因的擴(kuò)增產(chǎn)物(1017 bp的線性帶)。
[0047]圖4重組Sj GAPDH表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、蛋白表達(dá)與純化；
(a)表達(dá)SjGAPDH重組質(zhì)粒的酶切分析圖:M、Ikb DNA分子量標(biāo)志物；1、重組表達(dá)質(zhì)粒Sj GAPDH-pET28a飽Nhe I/Sac I酶切產(chǎn)物，包括5300 bp的線性pET28a帶與1017 bp的Sj GAPDH 帶；
(b)Sj GAPDH的重組表達(dá)SDS-PAGE圖(箭頭代表重組表達(dá)Sj GAPDH蛋白位置)；M、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；1、含質(zhì)粒Sj GAPDH-pET28a的大腸桿菌BL21的裂解產(chǎn)物；2、含質(zhì)粒pET-28a的大腸桿菌BL21的裂解產(chǎn)物；3、BL21大腸桿菌的裂解產(chǎn)物。
[0048](c)重組 Sj GAPDH蛋白純化產(chǎn)物；1-2純化的重組表達(dá)Sj GAPDH蛋白；M、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量。
[0049]圖5 14份血吸蟲(chóng)糞檢陽(yáng)性病人吡喹酮治療前后血清中抗GAPDH抗體IgG水平檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0050]以下所提供的實(shí)施例，可以更詳細(xì)地解釋本
【發(fā)明內(nèi)容】
。但是，本發(fā)明的內(nèi)容并不限于這些實(shí)施例所闡述的內(nèi)容。
[0051]實(shí)施例1日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)排泄分泌抗原的制備
以1500條血吸蟲(chóng)尾蝴感染家兔，42天后經(jīng)門(mén)靜脈用抗凝生理鹽水灌注，收集成蟲(chóng)。用無(wú)菌PBS反復(fù)洗滌成蟲(chóng)去除表面附著蛋白后，置于冷的無(wú)離子水中，37°C培養(yǎng)箱中放置15分鐘，取出成蟲(chóng)。將剩余的培養(yǎng)物以12000g，4°C離心30分鐘，去除沉淀物，將上清冷凍干燥濃縮，以BR0ADF0RD方法測(cè)定蛋白濃度。
[0052]實(shí)施例2血吸蟲(chóng)感染家兔治療前、后不同時(shí)間血清樣本的制備
取健康的青年新西蘭白兔3只，在感染血吸蟲(chóng)前經(jīng)耳緣靜脈采血，收集未感染時(shí)家兔血清。然后每只兔用200條日本血吸蟲(chóng)尾蝴經(jīng)腹部皮膚貼片法感染，于感染后2周、4周和6周經(jīng)耳緣靜脈采血，分離血清。感染6周(42天)給感染兔口服吡喹酮(350mg/kg)進(jìn)行治療，連續(xù)治療2天，然后每2周采血一次，收集血清，一直持續(xù)至治療后16周。
[0053]實(shí)施例3 二維電泳免疫印潰法鑒定誘導(dǎo)短壽抗體反應(yīng)的成蟲(chóng)排泄分泌抗原成分以相同數(shù)量的血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)排泄分泌抗原蛋白(lmg)，同時(shí)進(jìn)行6個(gè)24cm膠條(IPG, pi3-10)的二維電泳。電泳結(jié)束，其中一塊膠SDS-PAGE膠進(jìn)行考馬斯亮蘭染色(圖la)，另5塊膠進(jìn)行免疫印潰電轉(zhuǎn)移，將每塊膠上分離的蛋白斑點(diǎn)分別轉(zhuǎn)移5塊同樣大小的硝酸纖維素膜上。然后，用5%脫脂奶粉PBS溶液進(jìn)行封閉。封閉好的NC膜，一塊膠與未感染前的健康兔血清進(jìn)行反應(yīng)，一塊膠與感染后6周的兔血清反應(yīng)，一塊膠與治療后4周的兔血清反應(yīng)，一塊膠與治療后8周的兔血清反應(yīng),一塊膠與治療后12周的兔血清反應(yīng)，37°C反應(yīng)2小時(shí)。用PBST (PBS含0.05%的Tween-20)洗膜3次，每次10分鐘，然后與HRP標(biāo)記的羊抗人IgG二抗進(jìn)行反應(yīng)，37°C反應(yīng)2小時(shí)。用PBST洗膜3次，每次10分鐘。最后用3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物顯色，室溫下顯色5-10分鐘，流水沖洗中止反應(yīng)，觀察各蛋白點(diǎn)與感染不同階段兔血清的反應(yīng)狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于Pl 6-9的30-36kDa蛋白和pi為4-5的25-36kDa蛋白為主要的誘導(dǎo)短壽抗體反應(yīng)的抗原，它們與健康兔血清不發(fā)生反應(yīng)(圖lb)，但能被感染后6w的兔血清強(qiáng)烈識(shí)別(圖lc)，與治療后4w血清反應(yīng)強(qiáng)度明顯減弱，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)在感染后在8-12w基本消失(圖1 d-f)，表明這些斑點(diǎn)的蛋白分子在家兔體內(nèi)可誘導(dǎo)短壽抗體反應(yīng)。其中42個(gè)可能為誘導(dǎo)短壽抗體反應(yīng)的蛋白點(diǎn)經(jīng)過(guò)ABI 4700 mass質(zhì)譜分析儀進(jìn)行鑒定?；蜩b定結(jié)果如表1。蛋白點(diǎn)1-17 (分子量約在36kDa，pI在6-9)被鑒定為血吸蟲(chóng)的三磷酸甘油酸脫氫酶(GAPDH，36.5 kDa)和果糖I，6 二磷酸醛縮酶。蛋白點(diǎn)18-42 (分子量約在 25-36kDa，pi 在 4-5)被鑒定為血吸蟲(chóng)的 SJCHGC 05757，SJCHGC 01391以及SJCHGC 02266蛋白(圖2)。
[0054]實(shí)施例4日本血吸蟲(chóng)三磷酸甘油醛脫氫酶(Sj GAPDH)的基因克隆 根據(jù)SEQ ID N0.1的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物。引物核苷酸序列如下:
Sj GAPDHl:5’ -ATGCTAGCATGTCGAAGGCTAAGGTTGGTATCAAT-3’ (含有 Nhel 酶切位點(diǎn))；
Sj GAPDH2: 5’ -AAGAGCTCTTAAGAATGGTCGACTCTATGC-3’ (含有 Sacl 酶切位點(diǎn))。
[0055]引物由上海英俊 生物技術(shù)有限公司合成。
[0056]Sj GAPDH 基因擴(kuò)增，
RT-PCR反應(yīng)條件:在一個(gè)0.2mL的PCR管中，加入10XRT PCR緩沖液5ML (含Mg2+)，dNTPs 4ML，總 RNA 3ML (5Ong),引物 Sj GAPDHl 和 Sj GAPDH2 各 IML (?剛)，RT-Taq混合酶1ML，加DEPC水到終體積50ML.PCR條件:94°C變性2min ；再按94°C，30sec ；55°C，Imin，72°C，2min, 一共30個(gè)循環(huán)。最后，72°C，保溫IOmin。采用低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳方法回收純化Sj GAPDH基因片段。具體用0.7%的agarose膠電泳酶切產(chǎn)物，切下1017bp左右的目的條帶(圖3)，再用Promega公司的PCR產(chǎn)物快速膠回收試劑盒純化Sj GAPDH基因DNA片段。將Sj GAPDH基因片段與Promega公司的TA克隆載體pGEM_T連接(摩爾濃度比為1: 3)，構(gòu)建Sj GAPDH/pGEM-T重組質(zhì)粒，并將連結(jié)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，再經(jīng)含Ampicilin的LB平板通過(guò)藍(lán)白篩選獲得含Sj GAPDH/pGEM-T重組質(zhì)粒菌株。酶切分析，進(jìn)行DNA序列分析，確定Sj GAPDH基因序列的正確性。
[0057]實(shí)施例5:Sj GAPDH-pET28a重組達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與蛋白質(zhì)表達(dá)純化 以下以Sj GAPDH基因?yàn)槔?，說(shuō)明表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0058]本發(fā)明采用pET28a(+)為表達(dá)載體質(zhì)粒，其制備方法為常用分子生物學(xué)方法。即通過(guò)培養(yǎng)含有表達(dá)載體的菌種，提取獲得該質(zhì)粒。制備質(zhì)粒后_20°C保存待用。
[0059]具體如下,先對(duì)表達(dá)載體質(zhì)粒pET28a(+),進(jìn)行Nhe1、SacI雙酶切。具體條件如下。表達(dá)載體質(zhì)粒 pET28a(+)，IOML ；Nhel lML, Sacl 1ML，IOX 緩沖液 5ML ；ddH20, 33ML，總體積為50ML。37°C恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)3小時(shí)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收線性化的pET28a質(zhì)粒DNA。Sj GAPDH/pGEM-T DNA作同樣的雙酶切，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收分子量約1017 bp的Sj GAPDH基因片段。[0060]將回收的Sj GAPDH DNA與上述雙酶切的表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒Sj GAPDH-pET28a。連接體系一般為10ML，雙酶切的pET28a (+)質(zhì)粒載體與雙酶切SjGAPDH DNA 的摩爾比為 1: 3，10XT4 DNA Iigase 緩沖液 1ML，T4 DNA ligase 1ML，加無(wú)菌水至總體積為10ML。連接反應(yīng)16°C恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)16小時(shí)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。陽(yáng)性克隆的鑒定是通過(guò)含卡那霉素的LB平板挑選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒DNA。
[0061]用限制性?xún)?nèi)切酶Nhel、Sacl對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切分析。在一 0.5mL的離心管中，加入重組質(zhì)粒 Sj GAPDH-pET28a 30mL,Nhel 2mL，Sacl 2mL，10X 酶切緩沖液 5mL，無(wú)離子水llmL，總體積為50mL。37°C水浴保溫3小時(shí)。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙淀染色，紫外燈下觀察酶切結(jié)果。結(jié)果證實(shí)，Sj GAPDH基因被正確插入到表達(dá)質(zhì)粒 pET28a(+)中，圖 4a。
[0062]將含重組質(zhì)粒Sj GAPDH/pET28a的工程菌接種到50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，第二天將50mL培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接入IL LB培養(yǎng)基中(I: 100稀釋)繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，再加入終濃度為ImM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有重組質(zhì)粒Sj GAPDH/pET28a的工程菌能表達(dá)與預(yù)計(jì)大小39kDa的重組Sj GAPDH蛋白(增加了 6個(gè)組氨酸)，圖4b。
[0063]將表達(dá)產(chǎn)物細(xì)菌進(jìn)行裂解，高速離心，上清液過(guò)鎳離子螯合膠柱使帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的重組Sj GAPDH蛋白結(jié)合在膠上，再用咪唑?qū)⒌鞍讖哪z上洗脫，SDS-PAGE分析顯示獲得了高純度的重組Sj GAPDH 蛋白，圖4c。
[0064]實(shí)施例6檢測(cè)參與抗Sj GAPDH特異性短壽抗體反應(yīng)的抗體IgG試劑盒的構(gòu)建 本發(fā)明試劑盒由以下成份組成:
1、預(yù)包被重組SjGAPDH抗原的微孔板(96孔，濃度為I ii g/孔)。
[0065]2、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG 二抗(IOOmLX I瓶濃度為1: 10000)。
[0066]3、血吸蟲(chóng)抗體IgG陽(yáng)性對(duì)照品(IOOmLXl瓶，抗日本血吸蟲(chóng)Sj GAPDH蛋白的抗體IgG,濃度為 Iy g/mL)。
[0067]4、血吸蟲(chóng)抗體IgG陰性對(duì)照品(IOOmLX I瓶，純化的健康人IgG，濃度為I y g/mL)。
[0068]5、顯色液A,5mLX I瓶,檸檬酸0.42g,過(guò)氧化脲0.08g,無(wú)水醋酸鈉2.45g,乙酰苯胺0.014g,蒸懼水加至200mL ；
6、顯色液B，5mLXI瓶，檸檬酸0.38g，3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽TMB-HCl 0.09g,乙二胺四乙酸二鈉EDTA-2Na 0.067g，硫柳汞0.02g ;蒸餾水加至180mL ；
7、濃縮洗滌液(20倍)(50mLXI瓶)。20 X PBST濃縮液(Tween-20的終濃度為0.05%)
8、樣品稀釋液(12mLX I瓶)。含2%BSA的PBST
9、抗體稀釋液(25mLXI瓶)。含2%BSA的PBST
10、終止液(6mLXl瓶)。2M H2SO4
I1、操作說(shuō)明書(shū)1份。
[0069]實(shí)施例7:試劑盒檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)樣本效果評(píng)估
使用試劑盒按操作說(shuō)明書(shū)對(duì)40份糞檢陽(yáng)性血吸蟲(chóng)病人血清進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為82.5%，30份糞檢陽(yáng)性肝吸蟲(chóng)病人血清，陽(yáng)性率為6.7%，20份肺吸蟲(chóng)病人血清陽(yáng)性率為25%。對(duì)照試驗(yàn)使用SEA為檢測(cè)抗原進(jìn)行檢測(cè)，其陽(yáng)性則分別為100%，20%和65%.與糞檢結(jié)果相t匕，GAPDH的檢測(cè)敏感性和特異性分別為82.5%和91.3%，PPV和NPV分別為82.5%和91.3%，而SEA的檢測(cè)敏感性雖然為100%，但特異性?xún)H為76.3%，PPV和NPV分別為67.8%和100%(表 I)。
[0070]表1 GAPDH和SEA檢測(cè)臨床樣本效果的比較
【權(quán)利要求】
1.一種在血吸蟲(chóng)感染人或家兔體內(nèi)誘導(dǎo)抗原依賴(lài)的特異性短壽抗體反應(yīng)的日本血吸蟲(chóng)三磷酸甘油醛脫氫酶Sj GAPDH蛋白，其編碼基因的核苷酸序列與SEQ ID N0.1的同源性在90%以上，其蛋白質(zhì)氨基酸與SEQ ID N0.2的同源性保持在90%以上。
2.—種重組Sj GAPDH蛋白的構(gòu)建方法，其特征在于: (1)日本血吸蟲(chóng)三磷酸甘油醛脫氫酶SjGAPDH編碼基因的制備 根據(jù)已發(fā)表的Sj GAPDH基因SEQ ID N0.1的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物: Sj GAPDHl:5’ -ATGCTAGCATGTCGAAGGCTAAGGTTGGTATCAAT-3'含有 Nhel 酶切位點(diǎn)； Sj GAPDH2:5’ -AAGAGCTCTTAAGAATGGTCGACTCTATGC-3’,含有 Sacl 酶切位點(diǎn)； 采用RT-PCR方法從日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA中擴(kuò)增出Sj GAPDH的編碼區(qū)基因片段；將Sj GAPDH基因片段插入到TA克隆載體pGEM-T中構(gòu)建成功含Sj GAPDH基因序列的重組質(zhì)粒 Sj GAPDH/pGEM-T ； 編碼Sj GAPDH的基因序列與核甘酸序列SEQ ID NO:1保持90%以上的同源性； (2)體外表達(dá)SjGAPDH蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒Sj GAPDH-pET28a的構(gòu)建 用限制性?xún)?nèi)切酶Nhel和Sacl對(duì)重組質(zhì)粒Sj GAPDH/pGEM-T進(jìn)行限制性酶切，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，回收5’端帶有Nhel、3’端帶Sacl酶切位點(diǎn)的Sj GAPDH基因片段；同法對(duì)表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)進(jìn)行限制性酶切制備5’端帶有Nhel、3’端帶Sacl酶切位點(diǎn)的線性化pET28a(+)質(zhì)粒；將Sj GAPDH基因片段與線性化質(zhì)粒pET28a(+)按1: 3的比例混合，用T4 DNA連接酶連接構(gòu)成重組表達(dá)質(zhì)粒Sj GAPDH/pET28a ;但Sj GAPDH蛋白表達(dá)還可以采用除pET28a(+)以外的其它原核 、真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)，本發(fā)明優(yōu)選的質(zhì)粒是pET28a(+)； (3)將重組表達(dá)質(zhì)粒SjGAPDH-pET28a轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，通過(guò)卡那霉素篩選含有重組表達(dá)質(zhì)粒Sj GAPDH-pET28a的工程菌落；重組Sj GAPDH_pET28a可以采用除大腸桿菌BL21以外的其它受體菌進(jìn)行表達(dá)，本發(fā)明優(yōu)選的受體菌是大腸桿菌BL21 ； (4)大量表達(dá)與純化重組SjGAPDH蛋白 將含有重組表達(dá)質(zhì)粒Sj GAPDH-pET28a的表達(dá)工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，第二天轉(zhuǎn)種到大體積的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)4小時(shí)，然后加入終濃度為ImM的異丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)誘導(dǎo)；表達(dá)細(xì)菌的沉淀物用于表達(dá)分析與純化； 將表達(dá)產(chǎn)物上清液過(guò)鎳離子親和層析柱，通過(guò)親和層析的方法制備純化的重組SjGAPDH蛋白。
3.—種檢測(cè)參與抗原特異性短壽抗體反應(yīng)的抗體IgG的酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒由以下成分組成: (1)采用權(quán)利要求2所述的重組SjGAPDH蛋白，預(yù)包被重組Sj GAPDH蛋白抗原的96孔微孔板，濃度為Iug/孔； (2)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG二抗，IOOmLX I瓶，用抗體稀釋液稀釋?zhuān)ぷ鳚舛葹?1: 10000 ； (3)血吸蟲(chóng)抗體IgG陽(yáng)性對(duì)照品，IOOmLXI瓶，抗日本血吸蟲(chóng)Sj GAPDH蛋白的抗體IgG,濃度為I U g/mL ； (4)血吸蟲(chóng)抗體IgG陰性對(duì)照品，IOOmLXI瓶，純化的健康人IgG，濃度為I y g/mL ； (5)顯色液A,5mLX I瓶,顯色液A配制:檸檬酸0.42g,過(guò)氧化脲0.08g,無(wú)水醋酸鈉.2.45g,乙酰苯胺0.014g,蒸懼水定容至200mL ； (6)顯色液B,5mLX I瓶,顯色液B配制:檸檬酸0.38g, 3, 3, 5, 5-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽TMB-HCl 0.09g，乙二胺四乙酸二鈉EDTA-2Na 0.067g，硫柳汞0.02g;蒸餾水定容至18OmL ； (7)濃縮洗滌液，50mLXI瓶，含0.05% Tween-20的PBST濃縮液；用蒸餾水或去離子水稀釋?zhuān)ぷ鳚舛葹?: 20; (8)樣品稀釋液，12mLXI瓶，含2%BSA的PBST ； (9)抗體稀釋液，25mLXI瓶，含2%BSA的PBST ； (10)終止液，6mLXl瓶，2M H2SO4 ； (11)操作說(shuō)明書(shū)； (12)外包裝盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于該試劑盒使用一種能在血吸蟲(chóng)感染宿主體內(nèi)誘導(dǎo)抗原依賴(lài)性特異性短壽抗體反應(yīng)的血吸蟲(chóng)抗原，作為抗體IgG的檢測(cè)抗原，該抗原分子是重組Sj GAPDH蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的抗原分子使用SjGAPDH以外的其它能誘導(dǎo)特異性短壽抗體反應(yīng) 的日本血吸蟲(chóng)抗原分子，如:果糖-1，2- 二磷酯醛縮酶SjFBPA，未知功能蛋白 SJCHGC 00411、SJCHGC 05757、SJCHGC 01391、SJCHGC 02266。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于:亦可使用生物素-親和素信號(hào)放大系統(tǒng)來(lái)進(jìn)一步改進(jìn)本發(fā)明試劑盒的敏感性。
7.—種權(quán)利要求3所述的試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于抗Sj GAPDH蛋白參與短壽抗體反應(yīng)的抗體IgG的檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程如下: (1)試劑盒在室溫平衡30min，濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水進(jìn)行20倍稀釋?zhuān)孟♂屜礈煲海? (2)取所需要使用的孔數(shù)的酶標(biāo)條，剩余的酶標(biāo)條仍放入密封袋中保存，每次檢測(cè)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照孔一個(gè)，陰性對(duì)照孔一個(gè)，空白孔2個(gè)； (3)將酶標(biāo)條固定于板架上，檢測(cè)孔加入IOOmL樣品稀釋液，再加入ImL待檢測(cè)樣品血清，或直接加入用樣品稀釋液進(jìn)行1: 100稀釋的血清樣本，對(duì)照孔分別直接加入相應(yīng)的對(duì)照樣本，在37°C溫箱溫育45min ； (4)甩盡孔中液體，加入稀釋洗滌液到滿孔350mL，震蕩30s后室溫靜置30s，再加入稀釋洗滌液洗滌，如此重復(fù)5次； (5)各孔加入用抗體稀釋液1:10000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗人IgGIOOmL,在37°C溫箱溫育 45 min ； (6)用稀釋洗滌液洗板5次，吸干各孔殘留液體，將顯色液A、B等體積混勻后，各孔均加入A、B混合顯色液50mL,室溫避光顯色5 min,各孔加入終止液50mL,輕微振蕩混勻； (7)以空白對(duì)照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450nm的吸光值； (8)檢測(cè)參與抗SjGAPDH蛋白短壽抗體反應(yīng)的抗體IgG結(jié)果判斷: 判讀前所有對(duì)照孔與樣本孔的A450nm值均應(yīng)減去空白對(duì)照孔的A450nm值；陽(yáng)性:樣本孔的A450nm值≥陰性對(duì)照孔A450nm值的2.1倍，抗Sj GAPDH抗體陽(yáng)性； 陰性:樣本孔的A450nm值≤陰性對(duì)照孔A450nm值的2.1倍，抗Sj GAPDH抗體陰性。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK103667200SQ201210328791
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月6日
【發(fā)明者】余傳信, 王玠, 殷旭仁, 華萬(wàn)全 申請(qǐng)人:江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所