一種篩選超氧陰離子清除劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種篩選超氧陰離子清除劑的方法。解決現(xiàn)有技術(shù)中篩選超氧陰離子清除劑的方法存在檢測困難，準(zhǔn)確度低，重現(xiàn)性差的技術(shù)問題。本方法是選用鄰苯三酚堿性自氧化體系，結(jié)合紫外-可見分光光度法對超氧陰離子清除劑的清除作用進(jìn)行評價(jià)，通過檢測與超氧陰離子作用后捕集劑2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜吸光度的變化計(jì)算出清除劑對超氧陰離子的清除率。本方法可用于分析天然產(chǎn)物提取物或單體對超氧陰離子體外清除率，具有重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種篩選超氧陰離子清除劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種篩選超氧陰離子清除劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]活性氧包括超氧陰離子、羥基自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧等，這些粒子均十分微小。由于存在未配對的自由電子，活性氧的化學(xué)性質(zhì)十分活躍?；钚匝跬巧锷^程中的一種副產(chǎn)品，當(dāng)其過量時(shí)，機(jī)體內(nèi)的活性氧會(huì)對細(xì)胞和基因結(jié)構(gòu)造成損壞，引發(fā)多種疾病，如細(xì)胞毒性、衰老、癌癥等。超氧陰離子是其他幾種活性氧的源頭，超氧陰離子清除劑可以清除機(jī)體內(nèi)的超氧陰離子，保護(hù)機(jī)體免受氧化損害。目前，超氧陰離子清除劑的種類有很多，為了得到清除效果最好的超氧陰離子清除劑，近年來，對篩選超氧陰離子清除劑的方法的研究備受:關(guān)注。
[0003]現(xiàn)有用于篩選超氧陰離子清除劑的方法是:已有的產(chǎn)生超氧陰離子的方法主要為黃嘌呤氧化酶催化法，但是黃嘌呤氧化酶催化法容易產(chǎn)生假陽性和假陰性結(jié)果，使檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。而對超氧陰離子的檢測與定量，主要是用紫外-可見分光光度法、電子自旋共振法、化學(xué)發(fā)光法。其中，紫外-可見分光光度法是根據(jù)物質(zhì)分子對波長為200-760nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的一種定性、定量和結(jié)構(gòu)分析方法，該方法操作簡單、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。電子自旋共振法雖然能夠直接檢測產(chǎn)生的超氧陰離子的信號(hào)，但由于超氧陰離子壽命短，檢測比較困難。而化學(xué)發(fā)光法是一種通過使用化學(xué)發(fā)光劑使體系產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，間接的檢測超氧陰離子的方法，該方法由于發(fā)光時(shí)間短暫，測定困難并易產(chǎn)生誤差，重現(xiàn)性較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中篩選超氧陰離子清除劑的方法存在檢測困難，準(zhǔn)確度低，重現(xiàn)性差的技術(shù)問題，而提供了一種選用鄰苯三酚堿性自氧化體系，結(jié)合紫外-可見分光光度法篩選超氧陰離子清除劑的方法。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題， 本發(fā)明的篩選超氧陰離子清除劑的方法的技術(shù)方案具體如下:
[0006]一種篩選超氧陰離子清除劑的方法，該方法包括以下步驟:
[0007]步驟a、超氧陰離子產(chǎn)生體系緩沖溶液的配制
[0008]配制pH值為8.5~9.5的30-50毫摩爾/升的碳酸氫銨緩沖溶液；
[0009]步驟b、標(biāo)準(zhǔn)品的配制
[0010]用步驟a中的碳酸氫銨緩沖溶液將標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為50微摩爾/升的標(biāo)準(zhǔn)溶液，所述的標(biāo)準(zhǔn)品為2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽；
[0011]步驟C、對照品、樣品和空白樣品的制備
[0012]對照品的制備:取40微升0.4^8毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升碳酸氫銨緩沖溶液或甲醇，加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應(yīng)10-40分鐘后，作為對照品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定；
[0013]樣品的制備:取40微升0.4、毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升超氧陰離子清除劑，加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應(yīng)10-40分鐘后，作為樣品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定；
[0014]空白樣品的制備:取40微升0.4^8毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升超氧陰離子清除劑，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升水溶液，37°C反應(yīng)10-40分鐘后，作為空白樣品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定；
[0015]步驟d、對照品、樣品和空白樣品的檢測
[0016]設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米，在內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中對步驟c中制備的對照品、樣品和空白樣品進(jìn)行測定，得到對照品、樣品和空白樣品的吸光度
值A(chǔ)對照品、A樣品和A空自樣品；
[0017]步驟e、超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率的計(jì)算
[0018]超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率按照以下公式計(jì)算:
[0019]I樣品=[A對照品-(A樣品-A空白樣品)]/ A對照品X 100%
[0020]式中，I為超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率；
[0021]Ams為對照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0022]A#s為樣品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0023]A空白樣品為空白樣品中2_ (4-碘苯)_3_ (4_硝基苯)-5- (2’ 4_ 二橫基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱。
[0024]在上述技術(shù)方案中，步驟a中所述的緩沖溶液優(yōu)選pH值為9.0~9.5，最優(yōu)選pH值為9.3。
[0025]在上述技術(shù)方案中，步驟c中所述的乙二胺四乙酸二鈉鹽的濃度優(yōu)選為0.4-2毫
摩爾/升，最優(yōu)選為2毫摩爾/升。
[0026]在上述技術(shù)方案中，所述的超氧陰離子清除劑是天然產(chǎn)物提取物銀杏葉水提物、刺五加葉水提物、單體木犀草素或單體蘆丁。
[0027]本發(fā)明的篩選超氧陰離子清除劑的方法有益效果是:
[0028]本發(fā)明的篩選超氧陰離子清除劑的方法，是選用鄰苯三酚堿性自氧化體系，結(jié)合紫外-可見分光光度法對超氧陰離子清除劑對的清除作用進(jìn)行評價(jià)，避免了黃嘌呤氧化酶催化法容易產(chǎn)生假陽性和假陰性結(jié)果，同時(shí)克服了電子自旋共振法和化學(xué)發(fā)光法在檢測超氧陰離子時(shí)，由于超氧陰離子壽命短和發(fā)光時(shí)間短暫，檢測比較困難的問題。
[0029]另外，本發(fā)明的篩選超氧陰離子清除劑的方法重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，操作簡便。
【具體實(shí)施方式】[0030]本發(fā)明的發(fā)明思想為:本發(fā)明是選用鄰苯三酚堿性自氧化體系，結(jié)合紫外-可見分光光度法對超氧陰離子清除劑的清除作用進(jìn)行評價(jià)。
[0031]本發(fā)明選用鄰苯三酚堿性自氧化體系產(chǎn)生超氧陰離子，以2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽為超氧陰離子捕集劑，加入超氧陰離子清除劑，產(chǎn)物水溶性甲臜在450納米下具有光吸收，通過產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度變化計(jì)算出超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率。本方法可用于分析天然產(chǎn)物提取物或單體對超氧陰離子的體外清除率。
[0032]超氧陰離子清除劑清除超氧陰離子，從而導(dǎo)致與2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽反應(yīng)的超氧陰離子的量減少，致使捕集劑2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4_ 二磺基苯)_2H_四氮唑鈉鹽的還原產(chǎn)物水溶性甲臜染料的量減少；所以超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率可以通過捕集劑2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜染料含量的變化進(jìn)行計(jì)算的；通過測定對照品、樣品和空白樣品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，可以對超氧陰離子清除劑的清除作用進(jìn)行評價(jià)。
[0033]實(shí)施例1
[0034]本發(fā)明提供的一種篩選超氧陰離子清除劑的方法，其包括以下步驟:
[0035]步驟a、超氧陰離子產(chǎn)生體系緩沖溶液的配制
[0036]配制濃度為50毫摩爾/升的碳酸氫銨緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值為9.3 ;
[0037]步驟b、標(biāo)準(zhǔn)品的配制
[0038]用步驟a中的碳酸氫銨緩沖溶液將標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為50微摩爾/升的標(biāo)準(zhǔn)溶液，所述的標(biāo)準(zhǔn)品為2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑鈉鹽，能和超氧陰離子反應(yīng)產(chǎn)生水溶性甲臜染料；
[0039]步驟C、對照品、樣品和空白樣品的制備
[0040]對照品的制備:反應(yīng)總體積160微升，先加入40微升2毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升碳酸氫銨緩沖溶液，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應(yīng)12分鐘后，作為對照品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定；
[0041]樣品的制備:反應(yīng)總體積160微升，先加入40微升2毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升10毫克/毫升銀杏葉水提物(碳酸氫銨緩沖溶液稀釋的)，加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應(yīng)12分鐘后，作為樣品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定；
[0042]空白樣品的制備:反應(yīng)總體積160微升，先加入40微升2毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升10毫克/毫升銀杏葉水提物(碳酸氫銨緩沖溶液稀釋的)，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升水溶液，37°C反應(yīng)12分鐘后，作為空白樣品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定；
[0043]步驟d、對照品、樣品和空白樣品的檢測
[0044]對照品檢測:以96孔板為載體，在內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測定，設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c制備的對照品進(jìn)行測定，得到對照品的
吸光度值A(chǔ)對照品；
[0045]樣品檢測:以96孔板為載體，在內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測定，設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的樣品進(jìn)行測定，得到樣品的吸光度值
A樣品；
[0046]空白樣品檢測:以96孔板為載體，在內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測定，設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的空白樣品進(jìn)行測定，得到空白樣
品的吸光度值A(chǔ)空白樣品；
[0047]步驟e、超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率的計(jì)算
[0048]超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率按照以下公式計(jì)算:
[0049]I樣品=[A對照品-(A樣品-A空白樣品)]/ A對照品X 100%
[0050]式中，I為超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率；
[0051]A對照品為對照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0052]A#s為樣品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0053]A空白樣品為空白樣品中2_ (4-碘苯)_3_ (4_硝基苯)-5- (2’ 4_ 二橫基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0054]根據(jù)測得的對照品、樣品和空白樣品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，經(jīng)計(jì)算得到
2.5毫克/毫升銀杏葉水提物對超氧陰離子的清除率I為53%。
[0055]超氧陰離子清除劑銀杏葉水提物對超氧陰離子的清除率，是超氧陰離子清除劑銀杏葉水提物清除超氧陰離子，從而導(dǎo)致與2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽反應(yīng)的超氧陰離子的量減少，致使捕集劑2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的還原產(chǎn)物水溶性甲臜染料的量減少；所以超氧陰離子清除劑銀杏葉水提物對超氧陰離子的清除率是通過捕集劑2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜染料含量的變化進(jìn)行評價(jià)。
[0056]實(shí)施例2
[0057]本發(fā)明提供的一種篩選超氧陰離子清除劑的方法，其包括以下步驟:
[0058]步驟a、超氧陰離子產(chǎn)生體系緩沖溶液的配制
[0059]配制濃度為30毫摩爾/升的碳酸氫銨緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值為9.5 ;
[0060]步驟b、標(biāo)準(zhǔn)品的配制
[0061]用步驟a中的碳酸氫銨緩沖溶液將標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為50微摩爾/升的標(biāo)準(zhǔn)溶液，所述的標(biāo)準(zhǔn)品為2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑鈉鹽，能和超氧陰離子反應(yīng)產(chǎn)生水溶性甲臜染料；
[0062]步驟C、對照品、樣品和空白樣品的制備
[0063]對照品的制備:反應(yīng)總體積160微升，先加入40微升8毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升碳酸氫銨緩沖溶液，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應(yīng)10分鐘后，作為對照品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定；
[0064]樣品的制備:反應(yīng)總體積160微升，先加入40微升8毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升10毫克/毫升刺五加葉水提物(碳酸氫銨緩沖溶液稀釋的)，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應(yīng)10分鐘后，作為樣品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定；
[0065]空白樣品的制備:反應(yīng)總體積160微升，先加入40微升8毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升10毫克/毫升刺五加葉水提物(碳酸氫銨緩沖溶液稀釋的)，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升水溶液，37°C反應(yīng)10分鐘后，作為空白樣品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定；
[0066]步驟d、對照品、樣品和空白樣品的檢測
[0067]對照品檢測:以96孔板為載體，在內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測定，設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c制備的對照品進(jìn)行測定，得到對照品的
吸光度值A(chǔ)5iws ；
[0068]樣品檢測:以96孔板為載體，在內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測定，設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的樣品進(jìn)行測定，得到樣品的吸光度值
A樣品；
[0069]空白樣品檢測:以96孔板為載體，在內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測定，設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的空白樣品進(jìn)行測定，得到空白樣
品的吸光度值A(chǔ)空白樣品；
[0070]步驟e、超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率的計(jì)算
[0071]超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率按照以下公式計(jì)算:
[0072]I樣品=[A對照品-(A樣品一A空白樣品)]/ A對照品X 100%
[0073]式中，I為超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率；
[0074]A對照品為對照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0075]A#s為樣品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0076]A空白樣品為空白樣品中2_ (4-碘苯)_3_ (4_硝基苯)-5- (2’ 4_ 二橫基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0077]根據(jù)測得的對照品、樣品和空白樣品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，經(jīng)計(jì)算得到
2.5毫克/毫升刺五加葉水提物對超氧陰離子的清除率I為50%。
[0078]超氧陰離子清除劑刺五加葉水提物對超氧陰離子的清除率，是刺五加葉水提物清除超氧陰離子，從而導(dǎo)致與2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑鈉鹽反應(yīng)的超氧陰離子的量減少，致使捕集劑2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的還原產(chǎn)物水溶性甲臜染料的量減少；所以超氧陰離子清除劑刺五加葉水提物對超氧陰離子的清除率是通過捕集劑2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜染料含量的變化進(jìn)行評價(jià)。
[0079]實(shí)施例3
[0080]本發(fā)明提供的一種篩選超氧陰離子清除劑的方法，其包括以下步驟:
[0081]步驟a、超氧陰離子產(chǎn)生體系緩沖溶液的配制
[0082]配制濃度為40毫摩爾/升的碳酸氫銨緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值為8.5 ;
[0083]步驟b、標(biāo)準(zhǔn)品的配制
[0084]用步驟a中的碳酸氫銨緩沖溶液將標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為50微摩爾/升的標(biāo)準(zhǔn)溶液，所述的標(biāo)準(zhǔn)品為2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑鈉鹽，能和超氧陰離子反應(yīng)產(chǎn)生水溶性甲臜染料；
[0085]步驟C、對照品、樣品和空白樣品的制備
[0086]對照品的制備:反應(yīng)總體積160微升，先加入40微升0.4毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽,加入40微升甲醇，加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應(yīng)40分鐘后，作為對照品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定；
[0087]樣品的制備:反應(yīng)總體積160微升，先加入40微升0.4毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升2毫摩爾/升木犀草素(甲醇溶解的)，加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應(yīng)40分鐘后，作為樣品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定；
[0088]空白樣品的制備:反應(yīng)總體積160微升，先加入40微升0.4毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升2毫摩爾/升木犀草素(甲醇溶解的)，加入40微升50微摩爾/升的的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升水溶液，37°C反應(yīng)40分鐘后，作為空白樣品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定；
[0089]步驟d、對照品、樣品和空白樣品的檢測
[0090]對照品檢測:以96孔板為載體，在內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測定，設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c制備的對照品進(jìn)行測定，得到對照品的
吸光度值A(chǔ)5iws ；
[0091]樣品檢測:以96孔板為載體，在內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測定，設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的樣品進(jìn)行測定，得到樣品的吸光度值
A樣品；
[0092]空白樣品檢測:以96孔板為載體，在內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測定，設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的空白樣品進(jìn)行測定，得到空白樣
品的吸光度值A(chǔ)空白樣品；
[0093]步驟e、超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率的計(jì)算
[0094]超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率按照以下公式計(jì)算:
[0095]I樣品=[A對照品-(A樣品一A空白樣品)]/ A對照品X 100%
[0096]式中，I為超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率；
[0097]A對照品為對照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；[0098] A#s為樣品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[00"] A空白樣品為空白樣品中2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二橫基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0100]根據(jù)測得的對照品、樣品和空白樣品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，經(jīng)計(jì)算得到500微摩爾/升木犀草素對超氧陰離子的清除率I為93%。
[0101]超氧陰離子清除劑木犀草素對超氧陰離子的清除率，是超氧陰離子清除劑木犀草素清除超氧陰離子，從而導(dǎo)致與2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽反應(yīng)的超氧陰離子的量減少，致使捕集劑2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的還原產(chǎn)物水溶性甲臜染料的量減少；所以超氧陰離子清除劑木犀草素對超氧陰離子的清除率是通過捕集劑2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜染料含量的變化進(jìn)行評價(jià)。
[0102]實(shí)施例4
[0103]本發(fā)明提供的一種篩選超氧陰離子清除劑的方法，其包括以下步驟:
[0104]步驟a、超氧陰離子產(chǎn)生體系緩沖溶液的配制
[0105]配制濃度為45毫摩爾/升的碳酸氫銨緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值為9.0 ；
[0106]步驟b、標(biāo)準(zhǔn)品的配制
[0107]用步驟a中的碳酸氫銨緩沖溶液將標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為50微摩爾/升的標(biāo)準(zhǔn)溶液，所述的標(biāo)準(zhǔn)品為2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑鈉鹽，能和超氧陰離子反應(yīng)產(chǎn)生水溶性甲臜染料；
[0108]步驟C、對照品、樣品和空白樣品的制備
[0109]對照品的制備:反應(yīng)總體積160微升，先加入40微升4毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽,加入40微升甲醇，加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應(yīng)34分鐘后，作為對照品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定；
[0110]樣品的制備:反應(yīng)總體積160微升，先加入40微升4毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升2毫摩爾/升蘆丁(甲醇溶解的)，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽,最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應(yīng)34分鐘后，作為樣品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定;
[0111]空白樣品的制備:反應(yīng)總體積160微升，先加入40微升4毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升2毫摩爾/升蘆丁(甲醇溶解的)，加入40微升50微摩爾/升的的
2-(4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升水溶液，37°C反應(yīng)34分鐘后，作為空白樣品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定；
[0112]步驟d、對照品、樣品和空白樣品的檢測
[0113]對照品檢測:以96孔板為載體，在內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測定，設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c制備的對照品進(jìn)行測定，得到對照品的
吸光度值A(chǔ)5iws ；[0114]樣品檢測:以96孔板為載體，在內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測定，設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的樣品進(jìn)行測定，得到樣品的吸光度值
A樣品；
[0115]空白樣品檢測:以96孔板為載體，在內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測定，設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米，對步驟c配制的空白樣品進(jìn)行測定，得到空白樣
品的吸光度值A(chǔ)空白樣品；
[0116]步驟e、超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率的計(jì)算
[0117]超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率按照以下公式計(jì)算:
[0118]I樣品=[A對照品-(A樣品一A空白樣品)]/ A對照品X 100%
[0119]式中，I為超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率；
[0120]Ams為對照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0121]A#s為樣品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0122]A空白樣品為空白樣品中2_ (4-碘苯)_3_ (4_硝基苯)-5- (2’ 4_ 二橫基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱；
[0123]根據(jù)測得的對照品、樣品和空白樣品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，經(jīng)計(jì)算得到500微摩爾/升蘆丁對超氧陰離子的清除率I為61%。
[0124]超氧陰離子清除劑蘆丁對超氧陰離子的清除率，是超氧陰離子清除劑蘆丁清除超氧陰離子，從而導(dǎo)致與2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽反應(yīng)的超氧陰離子的量減少，致使捕集劑2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的還原產(chǎn)物水溶性甲臜染料的量減少；所以超氧陰離子清除劑蘆丁對超氧陰離子的清除率是通過捕集劑2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜染料含量的變化進(jìn)行評價(jià)。
[0125]顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。
【權(quán)利要求】
1.一種篩選超氧陰離子清除劑的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 步驟a、超氧陰離子產(chǎn)生體系緩沖溶液的配制 配制PH值為8.5~9.5的30-50毫摩爾/升的碳酸氫銨緩沖溶液； 步驟b、標(biāo)準(zhǔn)品的配制 用步驟a中的碳酸氫銨緩沖溶液將標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為50微摩爾/升的標(biāo)準(zhǔn)溶液，所述的標(biāo)準(zhǔn)品為2- (4-碘苯)-3- ( 4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽； 步驟C、對照品、樣品和空白樣品的制備 對照品的制備:取40微升0.1~8毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升碳酸氫銨緩沖溶液或甲醇，加入40微升50微摩爾/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應(yīng)10-40分鐘后，作為對照品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定； 樣品的制備:取40微升0.1~8毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升超氧陰離子清除劑，加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升I毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37°C反應(yīng)10-40分鐘后，作為樣品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定； 空白樣品的制備:取40微升0.4^8毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升超氧陰離子清除劑，加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升水溶液，37°C反應(yīng)10-40分鐘后，作為空白樣品，供內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測定； 步驟d、對照品、樣品和空白樣品的檢測 設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米，在內(nèi)置紫外可見分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中對步驟c中制備的對照品、樣品和空白樣品進(jìn)行測定，得到對照品、樣品和空白樣品的吸光度值A(chǔ)w照品、A樣品矛卩A空白樣品； 步驟e、超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率的計(jì)算 超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率按照以下公式計(jì)算: I樣品=[A對照品"(A樣品"A空白樣品)]/ A對照品X 100% 式中，I為超氧陰離子清除劑對超氧陰離子的清除率； AwmsS對照品中2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱； A#s為樣品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱； A空白樣品為空白樣品中2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二橫基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無量綱。
2.如權(quán)利要求1所述的篩選超氧陰離子清除劑的方法，其特征在于，步驟a中所述的緩沖溶液pH值為9.0~9.5。
3.如權(quán)利要求2所述的篩選超氧陰離子清除劑的方法，其特征在于，步驟a中所述的緩沖溶液PH值為9.3。
4.如權(quán)利要求1所述的篩選超氧陰離子清除劑的方法，其特征在于，步驟c中所述的乙二胺四乙酸二鈉鹽的濃度為0.4~2毫摩爾/升。
5.如權(quán)利要求4所述的篩選超氧陰離子清除劑的方法，其特征在于，步驟c中所述的乙二胺四乙酸二鈉鹽的濃度為2毫摩爾/升。
6.如權(quán)利要求1所述的篩選超氧陰離子清除劑的方法，其特征在于，所述的超氧陰離子清除劑是天然產(chǎn)物提取物銀杏葉水提物、刺五加葉水提物、單體木犀草素或單體蘆丁。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK103674862SQ201210341636
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月14日
【發(fā)明者】劉志強(qiáng), 徐晨, 劉舒, 邢俊鵬, 宋鳳瑞, 鄭重, 劉淑瑩 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所