專利名稱：基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種生物傳感器及其制備方法和應(yīng)用，尤其涉及ー種酪氨酸酶生物傳感器及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，對(duì)苯ニ酚、鄰苯ニ酚等有機(jī)污染物的主要測(cè)定方法有色譜法、紫外分光法、同步熒光光譜法、分光光度法、導(dǎo)數(shù)光度法、流動(dòng)注射分析法等，但是，這些方法都存在前處理復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、樣品基體效應(yīng)大、分析周期長(zhǎng)等缺陷，對(duì)工作人員的操作水平要求高且儀器昂貴，很難在中小型企業(yè)中推廣應(yīng)用。例如采用分光光度法檢測(cè)時(shí)，由于對(duì)底物濁度的要求和光干擾物質(zhì)的影響，限制了其精確性和使用范圍；而采用液相和氣相色譜法檢測(cè)，檢測(cè)前需要對(duì)樣品進(jìn)行分離，分離過(guò)程通常需要預(yù)處理，操作步驟比較繁瑣和耗時(shí)，檢測(cè)儀器 相對(duì)昂貴，且不便攜帯，不能進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。生物傳感器是基于生物有機(jī)成分(如酶、抗體、核酸、細(xì)胞、微生物等)，對(duì)待檢物質(zhì)進(jìn)行專ー的識(shí)別，產(chǎn)生的信號(hào)經(jīng)過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)、光信號(hào)，進(jìn)而定量檢測(cè)出待測(cè)物質(zhì)的ー項(xiàng)新技術(shù)。運(yùn)用生物傳感器來(lái)檢測(cè)環(huán)境中的重金屬、病原微生物、有害有機(jī)物具有特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)效率高、成本低廉的特點(diǎn)，因此成為了環(huán)境保護(hù)工作中的ー個(gè)研究熱點(diǎn)。目前，科研人員正努力提高生物傳感器的穩(wěn)定性、重復(fù)性以及結(jié)構(gòu)的可靠性，其中，利用各種新型材料固定生物敏感元件并保持活性是發(fā)展生物傳感器的ー個(gè)重要方向。制作生物酶?jìng)鞲衅鞯年P(guān)鍵是如何高效地固定酶，并保持酶的活性。常用的酶固定方法有吸附固定法、包埋固定法、共價(jià)固定法和交聯(lián)固定法，這些方法存在固定不牢固、固定中使用的交聯(lián)劑影響酶的活性、以及容易使用到對(duì)環(huán)境有害的物質(zhì)等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種成本低廉、制作簡(jiǎn)單、使用壽命長(zhǎng)、酶活性高、檢測(cè)精度和效率高的基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器，還相應(yīng)提供ー種酪氨酸酶生物傳感器的制備方法，以便通過(guò)ー種成本低廉、エ藝簡(jiǎn)單、制作快速的エ藝使酪氨酸酶的固定具有更好的穩(wěn)定性和高活性的保持；在此基礎(chǔ)上，還提供一種前述酪氨酸酶生物傳感器的應(yīng)用，該應(yīng)用能夠以低成本、簡(jiǎn)化操作、快速響應(yīng)、高檢測(cè)精度及較強(qiáng)抗干擾性強(qiáng)等特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)鄰苯ニ酚、對(duì)苯ニ酚等苯ニ酚類物質(zhì)的高效檢測(cè)。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為ー種基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器，所述生物傳感器包括ー玻碳電極，所述玻碳電極的檢測(cè)端表面沉積有納米金粒子，納米金粒子外表面吸附ー層L-賴氨酸(L-Lysine)薄膜，所述L-賴氨酸薄膜外側(cè)加載一層有序介孔碳載納米金(OMC-Au)，有序介孔碳載納米金上吸附(物理吸附)有酪氨酸酶。本發(fā)明的上述技術(shù)方案中，通過(guò)采用有序介孔碳載納米金來(lái)固定酪氨酸酶，回避了化學(xué)修飾酪氨酸酶的操作步驟，大大提高了固定酪氨酸酶的活性；另外，有序介孔碳(OMC)因其具有較大孔容及巨大的比表面積，而納米金(AuNPs)具有高催化活性且能通過(guò)自組裝形成復(fù)合材料的納米結(jié)構(gòu)，這對(duì)本發(fā)明的生物傳感器具有進(jìn)ー步的增效作用。作為ー個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供ー種上述的基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器的制備方法，包括以下步驟(I)修飾有序介孔碳向準(zhǔn)備好的有序介孔碳(OMC)材料中加入氯金酸溶液并超聲分散12h 24h,超聲后加入朽1檬酸鈉溶液和硼氫化鈉溶液(朽1檬酸鈉具有還原性,可將金離子還原)，經(jīng)離心、洗滌、干燥后，修飾得到有序介孔碳載納米金；將有序介孔碳載納米金加至溶劑(例如ニ甲基甲酰胺)超聲分散后得到有序介孔碳載納米金懸浮液；(2)沉積納米金在一置備好的玻碳電極的檢測(cè)端表面用電化學(xué)方法沉積納米金顆粒，得到納米金修飾電扱，晾干備用；(3)沉積L-賴氨酸將步驟⑵中制得的納米金修飾電極的檢測(cè)端浸入配制好的 L-賴氨酸溶液(賴氨酸水溶液)中，用電化學(xué)方法使納米金顆粒外表面形成ー層L-賴氨酸薄膜，得到L-賴氨酸-納米金修飾電極；(4)加載有序介孔碳載納米金將步驟(I)中制得的有序介孔碳載納米金懸浮液滴加到步驟(3)中制得的L-賴氨酸-納米金修飾電極的檢測(cè)端表面，晾干后得到復(fù)合材料修飾電極；(本步驟為純物理加載，未經(jīng)任何化學(xué)修飾)；(5)固定酪氨酸酶在步驟(4)中制得的復(fù)合材料修飾電極上滴加(或?qū)㈦姌O浸入)配制好的酪氨酸酶溶液，通過(guò)充分的物理吸附作用使酪氨酸酶固定于復(fù)合材料修飾電極的有序介孔碳載納米金粒子上，得到酪氨酸酶生物傳感器。上述的制備方法，所述步驟(I)中，有序介孔碳的與氯金酸、檸檬酸鈉和硼氫化鈉的質(zhì)量比優(yōu)選為I : O. 05 O. 12 0.01 0.00075。所述氯金酸溶液、檸檬酸鈉溶液、硼氫化鈉溶液的質(zhì)量濃度均優(yōu)選為O. 07% O. I %。上述的制備方法，所述步驟⑶中，L-賴氨酸溶液的濃度范圍優(yōu)選為1.0Xl(T3mol/L I. O X l(T2mol/L。上述的制備方法，所述步驟(I)中，所述有機(jī)溶劑優(yōu)選為ニ甲基甲酰胺(DMF)，所述有序介孔碳載納米金懸浮液的濃度優(yōu)選為I. Omg/mL 3mg/mL ;所述步驟(4)中，檢測(cè)端表面滴加有序介孔碳載納米金懸浮液體積范圍優(yōu)選為5 μ L 10 μし上述的制備方法，所述步驟(5)中，所述酪氨酸酶溶液的pH優(yōu)選值為4. 5 9. 2，所述酪氨酸酶溶液中酪氨酸酶的濃度優(yōu)選為O. 05mg/ μ L O. Img/μ L(—般其用量為5 μ L 10 μ L) 0上述的制備方法，所述有序介孔碳優(yōu)選是采用包括以下步驟的制備方法制得(I)合成硅基分子篩SBA-15 :將嵌段共聚物Ρ123置于鹽酸中溶解，然后逐滴加入正硅酸こ酯(Ρ123與正硅酸こ酯的質(zhì)量比優(yōu)選為8 17)，攪拌后水浴加熱，溫度控制在30°C 35°C，然后將混合物移至轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在140°C 150°C水熱24h，抽濾，洗滌至中性，風(fēng)干，再放入箱式電阻爐中焙燒(控制升溫速率為T(mén)C /min，在550°C空氣中焙燒4h 5h)，得到硅基分子篩SBA-15 ；(2)合成有序介孔碳將制得的硅基分子篩SBA-15與水、蔗糖、濃硫酸混合(混合的質(zhì)量比優(yōu)選為I : 5 I. 25 2. 5 O. 14)，混合物置于100°C 160°C溫度下干燥(保持IOh 12h)直至混合物變?yōu)楹谏缓髮Ⅻ\色的混合物置于惰性氣體保護(hù)下在自制管式石英電阻爐中進(jìn)行高溫?zé)峤?控制升溫速率優(yōu)選5°C /min,在900°C中焙燒4h 5h)，使蔗糖完全碳化，再用NaOH溶液(優(yōu)選lmol/L 3mol/L)去除熱解產(chǎn)物中的ニ氧化娃分子篩模板，過(guò)濾、洗滌、干燥后即得到有序介孔碳。本發(fā)明的上述制備方法不僅エ藝簡(jiǎn)單、成本低廉、制作快速，而且使酪氨酸酶的固定更穩(wěn)固，井能維持酪氨酸酶的高活性。作為ー個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供ー種上述的酪氨酸酶生物傳感器在檢測(cè)苯ニ酚中的應(yīng)用，檢測(cè)時(shí)的具體操作方法包括以下步驟以所述的酪氨酸酶生物傳感器作為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極，鉬電極作為對(duì)電極，建立三電極系統(tǒng)，將所述三電極系統(tǒng)與電化學(xué)工作站連接，將工作電極的檢測(cè)端置于待測(cè)溶液中，通過(guò)電化學(xué)工作站檢 測(cè)出待測(cè)溶液中進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)時(shí)的氧化電流大小，然后根據(jù)苯ニ酚濃度與氧化電流變化的線性回歸方程，即可定性或定量地測(cè)定待測(cè)溶液中的苯ニ酚。上述的應(yīng)用中，所述苯ニ酚特別優(yōu)選為對(duì)苯ニ酚或鄰苯ニ酚；所述對(duì)苯ニ酚濃度與氧化電流變化的線性回歸方程優(yōu)選為Phq = 66. 954-9. 5357IgCag(I)式⑴中，Phq為對(duì)苯ニ酚檢測(cè)時(shí)的電流變化值，單位為μ A ；CHQ為待測(cè)溶液中對(duì)苯ニ酚的濃度值，單位為M ;式⑴的相關(guān)系數(shù)為R2 = O. 9565，檢測(cè)下限為5X 10_8M ；所述鄰苯ニ酚濃度與氧化電流變化的線性回歸方程優(yōu)選為Pcc = 88. 394-13. 0811gCcc(2)式⑵中，P。。為鄰苯ニ酚檢測(cè)時(shí)的電流變化值，單位為μ A ；Ccc為待測(cè)溶液中鄰苯ニ酚的濃度值，單位為M ;式⑵的相關(guān)系數(shù)為R2 = O. 9771，檢測(cè)下限為2.5 X 10_8M;所述對(duì)苯ニ酚、鄰苯ニ酚的線性檢測(cè)范圍均為4X 10_7M 8. OX 10_5M。上述的應(yīng)用中，所述三電極系統(tǒng)檢測(cè)待測(cè)溶液時(shí)用到的電待測(cè)溶液的響應(yīng)電流較大且穩(wěn)定。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于I.本發(fā)明的基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器不僅成本低廉、制作簡(jiǎn)單，而且采用了多層組合的修飾方式，具有優(yōu)化的微觀結(jié)構(gòu)。首先，將納米金顆粒用電化學(xué)的方法沉積在電極表面，使其具有優(yōu)越的電子傳遞能力和導(dǎo)電性能，然后通過(guò)L-賴氨酸薄膜層，將有序介孔碳載納米金加載在電極上，這能夠顯著提高生物傳感器和待測(cè)溶液間電子的轉(zhuǎn)移速度，能夠快速獲得穩(wěn)定的響應(yīng)電流，最后用物理吸附法將酪氨酸酶固定在有序介孔碳載納米金上，因有序介孔碳具有很好的生物相容性，其能夠維持酪氨酸酶的高活性，使酪氨酸酶生物傳感器使用壽命更長(zhǎng)，酪氨酸酶活性更高?？梢?jiàn)，本發(fā)明的酪氨酸酶生物傳感器充分集成了現(xiàn)有技術(shù)中的各種技術(shù)手段，使組合后的生物傳感器實(shí)現(xiàn)了各技術(shù)手段的優(yōu)勢(shì)互ネト、協(xié)同增效，大大提高了生物傳感器的穩(wěn)定性、重復(fù)性和傳感器結(jié)構(gòu)的可靠性，提高了現(xiàn)有生物傳感器的檢測(cè)水平。2.本發(fā)明酪氨酸酶生物傳感器的制備方法不僅エ藝步驟簡(jiǎn)單、エ藝成本小、制作效率高，借助物理吸附法將酪氨酸酶固定到有序介孔碳載納米金修飾的玻碳電極上，使酪氨酸酶固定更穩(wěn)固，井能維持酪氨酸酶的高活性。3.本發(fā)明的基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器可用于檢測(cè)鄰苯ニ酚、對(duì)苯ニ酚等有機(jī)酚類污染物，由于生物傳感器上酪氨酸酶的高活性，對(duì)于鄰苯ニ酚、對(duì)苯ニ酚的氧化能夠起到良好的催化效果，本發(fā)明的酪氨酸酶生物傳感器具有卓越的電子傳導(dǎo)能力，使得每次達(dá)到穩(wěn)定響應(yīng)電流的時(shí)間很短，因此，在可測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，測(cè)定結(jié)果較理想，用于水樣測(cè)定的加標(biāo)回收率在96. 2% 102. 6%之間，與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比，成本低廉、操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)速度快、檢測(cè)精度高、抗干擾性強(qiáng)。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例中酪氨酸酶生物傳感器的自組裝過(guò)程示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例中酪氨酸酶生物傳感器的檢測(cè)反應(yīng)原理圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例中制得的有序介孔碳的掃描電鏡圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例中制得的有序介孔碳的透射電鏡圖。圖5為本發(fā)明實(shí)施例中制得的有序介孔碳載納米金的透射電鏡圖。 圖6為本發(fā)明實(shí)施例中制得的(OMC-Au/L-Lysine/Au)修飾電極掃描電鏡圖。圖7為本發(fā)明實(shí)施例中制得的有序介孔碳載納米金和有序介孔碳的XRD衍射對(duì)比圖，其中a表示有序介孔碳，b表示有序介孔碳載納米金。圖8為本發(fā)明實(shí)施例的酪氨酸酶生物傳感器在制作過(guò)程中各種中間體的電化學(xué)阻抗圖譜。圖9為本發(fā)明實(shí)施例中酪氨酸酶生物傳感器檢測(cè)時(shí)的pH值優(yōu)化圖。圖10為本發(fā)明實(shí)施例中酪氨酸酶生物傳感器檢測(cè)時(shí)的pH值優(yōu)化圖。圖11為本發(fā)明實(shí)施例2中檢測(cè)對(duì)苯ニ酚、鄰苯ニ酚時(shí)的差分脈沖伏安法曲線圖。圖12為本發(fā)明實(shí)施例2中檢測(cè)對(duì)苯ニ酚時(shí)的DPV圖，其中內(nèi)插圖為不同濃度與之對(duì)應(yīng)的響應(yīng)電流。圖13為本發(fā)明實(shí)施例2中檢測(cè)鄰苯ニ酚時(shí)的DPV圖，其中內(nèi)插圖為不同濃度與之對(duì)應(yīng)的響應(yīng)電流。圖例說(shuō)明I.玻碳電極；2.納米金粒子；3. L-賴氨酸薄膜；4.有序介孔碳載納米金；5.酪氨酸酶。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步描述。實(shí)施例I :一種如圖I所示的本發(fā)明基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器，該生物傳感器包括ー玻碳電極1，玻碳電極I的檢測(cè)端表面沉積有納米金粒子2，納米金粒子2外表面吸附ー層L-賴氨酸薄膜3，L-賴氨酸薄膜3外側(cè)加載一層有序介孔碳載納米金4，有序介孔碳載納米金4上物理吸附有酪氨酸酶5。本實(shí)施例的基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器的制備方法，包括以下步驟I.制備有序介孔碳。I. I介孔硅模板SBA-15的合成將8. Og嵌段共聚物Pluronic P123置于鹽酸(270g H2O和320mL、l. 54M的鹽酸混配而成)中，于35°C水浴中攪拌直至其溶解，然后逐滴加入17g正硅酸こ酯(TEOS)，將此混合物在35°C下攪拌20h，然后將混合物轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在140°C溫度下水浴加熱24h，將所得產(chǎn)物抽濾、再用蒸餾水洗滌至濾液為中性，室溫下風(fēng)干，干燥后得到白色粉末；為了去除其中的模板劑，將白色粉末放入箱式電阻爐中焙燒，控制升溫速率為1°C /min，在550°C空氣中焙燒4h，研磨即得硅基分子篩SBA-15白色粉末。I. 2合成有序介孔碳取Ig上述制得的SBA-15，另取5mL水溶解蔗糖I. 25g和
O.HgH2SO4，并與SBA-15混合，將混合物置于箱式電阻爐中并在100°C溫度下保持6h，然后將溫度升高至160°C，再保溫6h，使混合物的顔色成為黑色；然后將黑色的混合物于氮?dú)饬鞅Ｗo(hù)下在900°C的石英管式爐中進(jìn)行熱解，并使蔗糖碳化，熱解6h后保存碳化聚合物，并用3M NaOH溶液充分去除ニ氧化硅分子篩模板，過(guò)濾出來(lái)之后用去離子水洗滌至中性，干燥后即獲得有序介孔碳(OMC)。本實(shí)施例制得的有序介孔碳的掃描電鏡圖如圖3所示，本實(shí)施例制得的有序介孔碳的透射電鏡圖如圖4所示，由圖3、圖4可知該有序介孔碳為棒狀結(jié)構(gòu)。2.修飾有序介孔碳。取步驟I制備好的2mg有序介孔碳材料，向其中加入O. I % (下文中未特別說(shuō)明的百分?jǐn)?shù)均表示質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氯金酸溶液100mg(即有序介孔碳與氯金酸溶液的質(zhì)量比為
I 50)，超聲分散12h 24h，然后加入I %的檸檬酸鈉溶液lmL，Imin后加入O. 075%硼氫化鈉溶液lmL，超聲30min后得到黒色溶液，直到溶液的顏色沒(méi)有改變，再將黑色溶液經(jīng)離心(4000rpm轉(zhuǎn)速下高速旋轉(zhuǎn))，用去離子水洗滌，最后置于80°C條件下干燥，修飾得到有序介孔碳載納米金。本實(shí)施例制得的有序介孔碳載納米金的透射電鏡圖如圖5所示，相比圖4可見(jiàn)，納米金粒子已經(jīng)成功負(fù)載在有序介孔碳上。通過(guò)X射線衍射測(cè)定有序介孔碳載納米金和有序介孔碳，其XRD衍射圖譜如7所示，圖7進(jìn)ー步表明有序介孔碳載納米金材料制備成功。3.沉積納米金。在一置備好的玻碳電極的檢測(cè)端表面用電化學(xué)方法沉積納米金顆粒，具體操作方法是，將該玻碳電極放入O. I %的HAuCl4水溶液中，電流時(shí)間曲線(I-T)法掃描，初始電位為-O. 2 O. 5v,時(shí)間IOOs 400s，得到納米金修飾電極，晾干備用。4.沉積L-賴氨酸。 將步驟3中制得的納米金修飾電極的檢測(cè)端浸入配制好的I. OX 10_3 mo I/L的L-賴氨酸水溶液(將L-賴氨酸溶于pH = 8. O的PBS緩沖液中)中，用電化學(xué)方法使納米金顆粒外表面形成ー層L-賴氨酸薄膜，具體是采用CV法掃描，-2. Ov 2. Ov, 30段，掃描速率O. 05v/s,得到L-賴氨酸-納米金修飾電極。5.加載有序介孔碳載納米金。將步驟2制得的Img有序介孔碳載納米金在ImL有機(jī)溶劑ニ甲基甲酰胺中超聲分散lh，得到I. Omg/mL的有序介孔碳載納米金懸浮液(黒色)，然后將該有序介孔碳載納米金懸浮液滴加到步驟4中制得的L-賴氨酸-納米金修飾電極的檢測(cè)端表面(4cm2的圓柱形電極表面滴加5 μ L 10 μ L),晾干后得到復(fù)合材料修飾電極,其掃描電鏡圖如圖6所不，由圖6可知，有序介孔碳載金、L-賴氨酸依次由外至內(nèi)分布在納米金粒子的外表面，這說(shuō)明有序介孔碳載金/L-賴氨酸/納米金修飾電極的固定化過(guò)程是可行的。6.固定酪氨酸酶。將步驟5中制得的復(fù)合材料修飾電極的檢測(cè)端浸入配制好5 μ L 10 μ L的酪氨酸酶溶液(O. 05mg/ μ L O. Img/ μ L)中，通過(guò)充分的物理吸附作用使酪氨酸酶固定于復(fù)合材料修飾電極的有序介孔碳載納米金粒子上，得到酪氨酸酶生物傳感器。將該酪氨酸酶生物傳感器保存于4°C條件下備用。用電化學(xué)交流阻抗圖譜(EIS)法分別表征上述制備過(guò)程中玻碳電極(GCE)、納米金修飾電極(GC/Au)、L-賴氨酸-納米金修飾電極(GC/Au/L-Lysine)、復(fù)合材料修飾電極(GC/Au/L-Lysine/OMC-Au)以及生物傳感器(GC/Au/L-Lysine/OMC-Au/tyrosinase)，其結(jié)果如圖8所示，由8可見(jiàn)，GCE的半圓很大，這說(shuō)明GCE的電阻大，表明GCE傳導(dǎo)電子的能力很弱；而當(dāng)納米金、L-賴氨酸及有序介孔碳載納米金修飾后半圓很小，電阻顯著降低，其電子傳遞速度大大提高，這說(shuō)明有序介孔碳和納米金大大增強(qiáng)了電子傳遞能力；而在最后固定酪氨酸酶后的生物傳感器，其工作電極的電子傳導(dǎo)速度介于以上兩者之間(參見(jiàn)圖8)，其主要原因是L-賴氨酸以及酪 氨酸酶的吸附在一定程度上阻礙了電子的快速傳遞，但相比GCE本身，本發(fā)明的酪氨酸酶生物傳感器傳遞電子的速度還是得到了明顯的提高，應(yīng)用時(shí)能顯著提高工作電極和電解液間電子的轉(zhuǎn)移速度，快速獲得穩(wěn)定的響應(yīng)電流。由以上制備過(guò)程及表征圖譜數(shù)據(jù)可見(jiàn)，本實(shí)施例的酪氨酸酶生物傳感器不僅使用壽命長(zhǎng)、酪氨酸酶活性高，而且制備方法成本低廉、エ藝簡(jiǎn)單、制作快速，酪氨酸酶不經(jīng)過(guò)任何化學(xué)修飾而是借助吸附法固定到玻碳電極表面，使酪氨酸酶的固定更穩(wěn)固，井能維持酪氨酸酶的高活性。本發(fā)明的上述固定方法也能用于與酪氨酸酶具有近似性質(zhì)的其他生物有機(jī)成分的生物傳感器的構(gòu)建。實(shí)施例2 :酪氨酸酶生物傳感器的檢測(cè)應(yīng)用將本發(fā)明實(shí)施例I的基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器作為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極，鉬電極作為對(duì)電極，建立三電極系統(tǒng)，將三電極系統(tǒng)與電化學(xué)工作站連接，對(duì)待測(cè)溶液中的對(duì)苯ニ酚、鄰苯ニ酚濃度進(jìn)行檢測(cè)。工作條件所用的電解液為l/15mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，在pH = 4. 5
9.2范圍內(nèi)測(cè)定酪氨酸酶生物傳感器對(duì)同一濃度鄰苯ニ酚的電流響應(yīng)值，優(yōu)化結(jié)果如圖9和圖10所示，選定pH = 6. 98為最佳pH值，因?yàn)樵诖藀H值下，其響應(yīng)電流大且穩(wěn)定。本發(fā)明的酪氨酸酶生物傳感器的檢測(cè)原理如圖2所示酪氨酸酶催化氧化鄰苯ニ酚成鄰醌，鄰醌在電極上得到電子，又被還原成鄰苯ニ酚，通過(guò)檢測(cè)還原電流的大小來(lái)定量指示待測(cè)液中鄰苯ニ酚的濃度；但對(duì)苯ニ酚不是酪氨酸酶的直接底物，在酪氨酸酶和鄰醌的作用下形成對(duì)醌，同樣對(duì)醌在電極上得到電子，又被還原成對(duì)苯ニ酚，通過(guò)檢測(cè)還原電流的大小來(lái)定量指示待測(cè)液中對(duì)苯ニ酚的濃度，由于對(duì)苯ニ酚不是酪氨酸酶的直接底物，因此，在后面檢測(cè)下限中，鄰苯ニ酚的檢測(cè)下限更低。本發(fā)明檢測(cè)過(guò)程的主反應(yīng)式如下所示CC+CL..........Mggggg......O... quilHinc+21^0 .HQ+O. tyrmmmc+o-qumme ybemoquinom+1Hfj0 .o-quinone (benzoquinone) +2e+2H+ — CC (HQ)。采用差分脈沖伏安法(DPV)測(cè)定對(duì)苯ニ酚、鄰苯ニ酚濃度，測(cè)量池中加入IOmL的PBS電解液，里面放置ー個(gè)磁力攪拌子，每測(cè)定一次后，用PBS清洗電極三次，再用于下一次測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果如圖11、圖12和圖13所示。
由圖12可見(jiàn)，對(duì)苯ニ酚濃度與氧化電流變化的線性回歸方程優(yōu)選為Phq = 66. 954-9. 53571gCHQ(I)式⑴中，Phq為對(duì)苯ニ酚檢測(cè)時(shí)的電流變化值，單位為μ A ；CHQ為待測(cè)溶液中對(duì)苯ニ酚的濃度值，單位為M ;式⑴的相關(guān)系數(shù)為R2 = O. 9565，檢測(cè)下限為5X 10_8M。由圖13可見(jiàn)，鄰苯ニ酚濃度與氧化電流變化的線性回歸方程優(yōu)選為Pcc = 88. 394-13. 0811gCcc(2)式⑵中，P。。為鄰苯ニ酚檢測(cè)時(shí)的電流變化值，單位為μ A ；Ccc為待測(cè)溶液中鄰苯ニ酚的濃度值，單位為M ;式(2)的相關(guān)系數(shù)為R2 = O. 9771，檢測(cè)下限為2.5 X 10_8M。所述對(duì)苯ニ酚、鄰苯ニ酚的線性檢測(cè)范圍均為4X KT7M 8. OX 1(Γ5Μ。將本實(shí)施例的酪氨酸酶生物傳感器用于實(shí)際水樣樣品的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下表I、表2所示，該表中原水取自湘江橘子洲大橋段，C1為原水過(guò)濾后測(cè)定的對(duì)苯ニ酚、鄰苯ニ酚的濃度(均為O),經(jīng)過(guò)過(guò)濾后加入確定濃度的對(duì)苯ニ酹、鄰苯ニ酹,制成Α、B、C、D四個(gè)水樣，四個(gè)水樣的配制濃度如C2欄所示，而C3欄為本發(fā)明酪氨酸酶生物傳感器按照本實(shí)施例的檢測(cè)方法和檢測(cè)條件測(cè)定的濃度值。從加標(biāo)回收率可以看出，本發(fā)明的生物傳感器在可測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率基本在95. 7% 103. 8%之間，測(cè)定結(jié)果理想，相比傳統(tǒng)的高效液相色譜法，本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，且不受其它污染物的干擾。表I電化學(xué)傳感器檢測(cè)水中的對(duì)苯ニ酚
權(quán)利要求
1.一種基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器，所述生物傳感器包括一玻碳電極，其特征在于所述玻碳電極的檢測(cè)端表面沉積有納米金粒子，納米金粒子外表面吸附一層L-賴氨酸薄膜，所述L-賴氨酸薄膜外側(cè)加載一層有序介孔碳載納米金，有序介孔碳載納米金上吸附有酪氨酸酶。
2.一種如權(quán)利要求I所述的基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器的制備方法，包括以下步驟 (1)修飾有序介孔碳向準(zhǔn)備好的有序介孔碳材料中加入氯金酸溶液，超聲后加入朽1檬酸鈉溶液和硼氫化鈉溶液，經(jīng)離心、洗滌、干燥后，修飾得到有序介孔碳載納米金；將有序介孔碳載納米金加至溶劑超聲分散后得到有序介孔碳載納米金懸浮液； (2)沉積納米金在一置備好的玻碳電極的檢測(cè)端表面用電化學(xué)方法沉積納米金顆粒，得到納米金修飾電極，晾干備用； (3)沉積L-賴氨酸將步驟(2)中制得的納米金修飾電極的檢測(cè)端浸入配制好的L-賴氨酸溶液中，用電化學(xué)方法使納米金顆粒外表面形成一層L-賴氨酸薄膜，得到L-賴氨酸-納米金修飾電極； (4)加載有序介孔碳載納米金將步驟(I)中制得的有序介孔碳載納米金懸浮液滴加到步驟(3)中制得的L-賴氨酸-納米金修飾電極的檢測(cè)端表面，晾干后得到復(fù)合材料修飾電極； (5)固定酪氨酸酶在步驟(4)中制得的復(fù)合材料修飾電極上滴加配制好的酪氨酸酶溶液，通過(guò)充分的物理吸附作用使酪氨酸酶固定于復(fù)合材料修飾電極的有序介孔碳載納米金粒子上，得到酪氨酸酶生物傳感器。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中，有序介孔碳與氯金酸、檸檬酸鈉和硼氫化鈉的質(zhì)量比為I : O. 05 O. 12 O. 01 0.00075。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中，L-賴氨酸溶液的濃度范圍為 1.0X10_3mol/L I. OX 10_2mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中，所述有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺，所述有序介孔碳載納米金懸浮液的濃度為I. Omg/mL 3mg/mL ;所述步驟(4)中，檢測(cè)端表面滴加5 μ L 10 μ L的有序介孔碳載納米金懸浮液。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中，所述酪氨酸酶溶液的PH值為4. 5 9. 2，所述酪氨酸酶溶液中酪氨酸酶的濃度為O. 05mg/ μ L O. Img/ μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求2 6中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述有序介孔碳是采用包括以下步驟的制備方法制得 (1)合成硅基分子篩SBA-15:將嵌段共聚物P123置于鹽酸中溶解，然后逐滴加入正硅酸乙酯，攪拌后水浴加熱，溫度控制在30°C 35°C，然后將混合物移至轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在140°C 150°C水熱，抽濾，洗滌至中性，風(fēng)干，再放入電阻爐中焙燒，得到硅基分子篩SBA-I5 ； (2)合成有序介孔碳將制得的硅基分子篩SBA-15與水、蔗糖、濃硫酸混合，混合物置于100°C 160°C溫度下干燥直至混合物變?yōu)楹谏?，然后將黑色的混合物置于惰性氣體保護(hù)下進(jìn)行高溫?zé)峤?，使蔗糖完全碳化，再用NaOH溶液去除熱解產(chǎn)物中的二氧化硅分子篩模板，過(guò)濾、洗滌、干燥后即得到有序介孔碳。
8.—種如權(quán)利要求I所述的酪氨酸酶生物傳感器或者權(quán)利要求2 7中任一項(xiàng)所述制備方法制得的酪氨酸酶生物傳感器在檢測(cè)苯二酚中的應(yīng)用，檢測(cè)時(shí)的具體操作方法包括以下步驟以所述的酪氨酸酶生物傳感器作為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極，鉬電極作為對(duì)電極，建立三電極系統(tǒng)，將所述三電極系統(tǒng)與電化學(xué)工作站連接，將工作電極的檢測(cè)端置于待測(cè)溶液中，通過(guò)電化學(xué)工作站檢測(cè)出待測(cè)溶液中進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)時(shí)的氧化電流大小，然后根據(jù)苯二酚濃度與氧化電流變化的線性回歸方程，即可定性或定量地測(cè)定待測(cè)溶液中的苯二酚。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述苯二酚為對(duì)苯二酚或鄰苯二酚； 所述對(duì)苯二酚濃度與氧化電流變化的線性回歸方程為Phq = 66. 954-9. 5357IgCag (I) 式⑴中，Phq為對(duì)苯二酚檢測(cè)時(shí)的電流變化值，單位為μ A ;CHQ為待測(cè)溶液中對(duì)苯二酚的濃度值，單位為M ;式(I)的相關(guān)系數(shù)為R2 = O. 9565，檢測(cè)下限為5 X 10_8M; 所述鄰苯二酚濃度與氧化電流變化的線性回歸方程為 Pcc = 88. 394-13. 0811gCcc(2) 式(2)中，P。。為鄰苯二酚檢測(cè)時(shí)的電流變化值，單位為μ A 為待測(cè)溶液中鄰苯二酚的濃度值，單位為M ;式(2)的相關(guān)系數(shù)為R2 = O. 9771，檢測(cè)下限為2.5 X 10_8M; 所述對(duì)苯二酚、鄰苯二酚的線性檢測(cè)范圍均為4X 10_7M 8. OX 10_5M。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于所述三電極系統(tǒng)檢測(cè)待測(cè)溶液時(shí)用到的電解液為PH值為4. 5 9. 2的磷酸鹽緩沖溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器，包括一玻碳電極，玻碳電極的檢測(cè)端表面沉積有納米金粒子，納米金粒子外表面吸附L-賴氨酸薄膜，L-賴氨酸薄膜外側(cè)加載有序介孔碳載納米金，有序介孔碳載納米金上吸附有酪氨酸酶；其制備方法包括以下步驟首先制備有序介孔碳載納米金懸浮液；然后在玻碳電極上用電化學(xué)方法沉積納米金顆粒，再將納米金修飾電極的檢測(cè)端浸入L-賴氨酸溶液中，用電化學(xué)方法使納米金顆粒外表面形成一層L-賴氨酸薄膜，再將有序介孔碳載納米金懸浮液滴加到檢測(cè)端表面，晾干后再滴加酪氨酸酶溶液，得到酪氨酸酶生物傳感器。本發(fā)明具有成本低、制作簡(jiǎn)單、使用壽命長(zhǎng)、酶活性高、檢測(cè)精度和效率高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N27/327GK102854233SQ20121034445
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月17日
發(fā)明者湯琳, 周耀渝, 曾光明, 龔繼來(lái), 李貞 , 劉媛媛, 章毅, 楊貴德, 嚴(yán)洲, 雷曉霞 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)