專利名稱：孕馬血清促性腺激素雙抗體夾心elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種ELISA檢測(cè)試劑盒，具體地說(shuō)是一種檢測(cè)孕馬血清促性腺激素的雙抗體夾心ELISA試劑盒。
背景技術(shù)：
孕馬血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotrophin PMSG)又稱馬絨毛膜促性腺激素(equine chorionic gonadotropin, eCG)。PMSG 是從懷孕 40-120 天母馬血液中提純的一種糖蛋白激素，是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的促性腺激素，在生產(chǎn)上常用以代替較昂貴的促卵泡素(FSH)而廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的誘發(fā)發(fā)情、超數(shù)排卵或增加排卵率(如提高雙羔率)；對(duì)卵巢發(fā)育不全或雄性生精能力衰退等也都可收到一定療效。由于孕馬血清中PMSG的含量受多種因素的影響，不同妊娠期、不同品種、同一品種不同年齡及胎次等都對(duì)其影響較大。因此在用血清提純PMSG之前，能對(duì)血清中PMSG效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于生產(chǎn)提純具有重 要的指導(dǎo)意義。綜合生殖激素的檢測(cè)方法有多種多樣，主要有放射性免疫分析法、免疫膠體金檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、反向間接血凝法、色譜技術(shù)、化學(xué)發(fā)光技術(shù)及生物傳感器技術(shù)等。目前，我國(guó)關(guān)于PMSG的檢測(cè)有3種方法。其一是大鼠卵巢增重法，該法是依據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥規(guī)范》(1993)血促性素(孕馬血清促性腺激素PMSG)生物檢定法，采用PMSG能促進(jìn)大鼠卵巢增長(zhǎng)的原理，將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品注入相同來(lái)源的大鼠體內(nèi)，根據(jù)卵巢增重情況繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將同體積待檢樣品注入同系相同生理狀況的大鼠體內(nèi)，測(cè)定其卵巢增重從而確定激素含量。由于該法靈敏度低、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物變數(shù)大、影響因素較多，不易于生產(chǎn)與科研中推廣應(yīng)用。其二是反向間接血凝法，該法的原理是將純化的PMSG抗體吸附到雙醛化得羊紅血球表面，遇到相應(yīng)抗原，血球即被動(dòng)凝集，按完全凝集孔樣本的稀釋倍數(shù)即可得到抗原的血凝效價(jià)。此法雖達(dá)到快速檢測(cè)目的，但不同批次醛化紅血球差異大，且抗體純度要求高，質(zhì)量要求均一，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果的差異大，也不適于生產(chǎn)應(yīng)用。其三是放射性免疫檢測(cè)法，使放射性標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原(待測(cè)物)與不足量的特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合，反應(yīng)后分離并測(cè)量放射性而求得未標(biāo)記抗原的量。此法快速準(zhǔn)確，樣品需要量少，但由于此種方法具有高度放射性，對(duì)操作人員健康有害，同時(shí)檢測(cè)所需的儀器較昂貴，也不利于推廣應(yīng)用。另外免疫膠體金檢測(cè)法只能實(shí)現(xiàn)定性和半定量檢測(cè)，目前階段不宜推廣使用。色譜技術(shù)、化學(xué)發(fā)光技術(shù)及生物傳感器技術(shù)同樣也可以用于激素檢測(cè)，但由于其檢測(cè)條件的限制性，在試驗(yàn)室中作為科研檢測(cè)方法可以應(yīng)用，但不適合于野外檢測(cè)，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)的指導(dǎo)意義不大。ELISA憑借其高度的靈敏度、良好的特異性、檢測(cè)速度及低檢測(cè)成本等優(yōu)勢(shì)已被廣泛應(yīng)用于生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)等學(xué)科的分析檢測(cè)中。近年來(lái)，隨著生物醫(yī)學(xué)的研究進(jìn)展，免疫學(xué)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)有力的推動(dòng)了醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中各個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展。目前美國(guó)DRG公司生產(chǎn)的孕馬血清促性腺激素快速檢測(cè)試劑盒，能夠在短短幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成多個(gè)樣品的檢測(cè)，準(zhǔn)確省時(shí)。但由于進(jìn)口價(jià)格昂貴，一個(gè)96孔檢測(cè)板需要花費(fèi)180(Γ2000元，同時(shí)由于DRG公司生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)范圍為0-80IU，國(guó)內(nèi)有些馬種的最高含量達(dá)到140IU，超出了其檢測(cè)范圍，因此急需建立一種快速、準(zhǔn)確、省時(shí)、簡(jiǎn)便易操作的檢測(cè)PMSG含量的方法并研制試劑盒，解決進(jìn)口昂貴、檢測(cè)范圍窄的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種孕馬血清促性腺激素單克隆抗體。本發(fā)明的目的之二在于提供一種用于檢測(cè)孕馬血清促性腺激素的雙抗體夾心ELISA試劑盒，以克服上述不足。本發(fā)明提供一種孕馬血清促性腺激素PMSG單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D-3，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 6450。本發(fā)明提供一種孕馬血清促性腺激素PMSG單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株A-4，其保藏 編號(hào)為 CGMCC No. 6449。雜交瘤細(xì)胞株D-3和A-4已于2012年9月5日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，簡(jiǎn)稱CGMCC，郵編100101)保藏，分類命名為雜交瘤細(xì)胞，保藏號(hào)分別為CGMCC No. 6450和CGMCCNo. 6449。本發(fā)明提供的一種孕馬血清促性腺激素PMSG單克隆抗體，是由雜交瘤細(xì)胞株D-3或A-4分泌獲得，所述雜交瘤細(xì)胞株D-3的保藏編號(hào)為CGMCC No. 6450，所述雜交瘤細(xì)胞株A-4的保藏編號(hào)為CGMCCNo. 6449。本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)PMSG的試劑、藥劑或試劑盒，其包括上述的PMSG單克隆抗體。本發(fā)明提供一種檢測(cè)PMSG的方法，包括使用上述的PMSG單克隆抗體。本發(fā)明還提供了上述PMSG單克隆抗體在制備檢測(cè)PMSG試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)孕馬血清促性腺激素PMSG的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其包括(I)包被PMSG單克隆抗體的酶標(biāo)板；(2)酶標(biāo)記的PMSG單克隆抗體；其中，包被在酶標(biāo)板的PMSG單克隆抗體與酶標(biāo)記PMSG單克隆抗體分別針對(duì)PMSG蛋白不同的抗原決定簇。進(jìn)一步地，本發(fā)明試劑盒中包被在酶標(biāo)板的PMSG單克隆抗體與酶標(biāo)記PMSG單克隆抗體分別為雜交瘤細(xì)胞株D-3或A-4分泌獲得。優(yōu)選地，所述包被在酶標(biāo)板的PMSG單克隆抗體為雜交瘤細(xì)胞株D-3分泌獲得，酶標(biāo)記PMSG單克隆抗體為雜交瘤細(xì)胞株A-4分泌獲得。所述雜交瘤細(xì)胞株D-3的保藏編號(hào)為CGMCC No. 6450，所述雜交瘤細(xì)胞株A-4的保藏編號(hào)為CGMCC No. 6449。本發(fā)明提供的PMSG試劑盒，還包括以下試劑中的一種或多種洗滌液、酶標(biāo)抗體稀釋液、底物顯色液、終止液、PMSG標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明的試劑盒中，酶標(biāo)記PMSG單克隆抗體的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶，具體標(biāo)記方法包括如下步驟取5mg的HRP溶于ImL三蒸水,加入新鮮配制的O. lmol/L NaIO4O. 2mL，室溫下避光攪拌20min，混勻后裝入透析袋中，以O(shè). 001mol/L pH 4. 4醋酸鈉緩沖液4°C透析過(guò)夜，加20 μ L0. 2mol/L ρΗ9· 5碳酸鹽緩沖溶液，使pH升高到9. 0-9. 5，加入含有IOmg純化PMSG單克隆抗體IgG lmL，混勻后裝入預(yù)先活化的透析袋中，以O(shè). 05mol/L pH9. 6碳酸鹽緩沖液4°C透析過(guò)夜，使辣根過(guò)氧化物酶與抗體充分結(jié)合，取出透析袋中的液體，加入4mg/mL的硼氫化鈉100 μ L，置4°C還原6_8小時(shí)，加入等體積的飽和硫酸銨，4°C放置過(guò)夜，3000rpm,離心IOmin,將所得的沉淀溶于Iml O. 01mol/L的PBS中，裝入透析袋中以
O.01mol/L的PBS透析過(guò)夜充分除去硫酸銨，透析24_36h，離心除去沉淀，即得純化酶標(biāo)記抗體。本發(fā)明試劑盒中，PMSG單克隆抗體的包被方法是將12. 44 μ g/mL的單克隆抗體按ΙΟΟμ L/孔加入到酶標(biāo)板中，37°C孵育2h，用含0. 05%吐溫-20和0. 05%疊氮化鈉，ph7. 4的0. 02M磷酸鹽緩沖液PBST溶液洗滌。本發(fā)明檢測(cè)孕馬血清促性腺激素試劑盒可以彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)生物檢定方法的不足。僅需要幾個(gè)小時(shí)就能測(cè)得結(jié)果，相對(duì)于生物檢定法需要5天左右時(shí)間具有明顯時(shí)間優(yōu)勢(shì)；相對(duì)于操作過(guò)程來(lái)說(shuō)，本試驗(yàn)僅需要簡(jiǎn)單加樣，而且一塊96孔微量板可以檢測(cè)80-90個(gè)樣品，遠(yuǎn) 比生物法操作簡(jiǎn)單易行；本試驗(yàn)方案耗費(fèi)材料少，用量都在微量水平，每個(gè)樣品檢測(cè)成本為1(Γ15元，更適合于生產(chǎn)應(yīng)用。運(yùn)用本發(fā)明檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PMSG最低檢測(cè)限為30mIU/ml，檢測(cè)范圍在3(T200mIU。本發(fā)明為生產(chǎn)中PMSG的快速檢測(cè)提供了可靠的手段。本發(fā)明試劑盒便于操作、使用成本低、穩(wěn)定性和重復(fù)性好，適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。


圖I為5只BALB/c系小鼠免疫PMSG后的抗血清吸光度圖。圖2為不同酶標(biāo)板條的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)上的1-6分別代表標(biāo)準(zhǔn)品的濃度O、30、90、271、810、2430mIU,縱坐標(biāo)為吸光度值。圖3為酶標(biāo)抗體不同工作濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖4標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例I孕馬血清促性腺激素單克隆抗體的制備及鑒定I 材料I. I實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物公司；小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0購(gòu)自中科院動(dòng)物所。I. 2主要儀器和試劑酶標(biāo)儀MK3購(gòu)自熱電公司；酶標(biāo)板購(gòu)自Nunc公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Coster公司。弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑(FIA)由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；PMSG純品、HAT和HT選擇培養(yǎng)基等購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，除特殊說(shuō)明外均為分析純。
2 方法2. I動(dòng)物免疫取PMSG提純品作為免疫原，分別用PBS (O. 01mol/L, pH7. 2)稀釋至lmg/mL左右備用。免疫小鼠時(shí)，取免疫原與等量的弗氏佐劑，制成乳化劑，按照下表的免疫程序免疫6-8周齡BALB/c小鼠5只(分別編號(hào)為I#、2#、3#、4#、5# )，每只小鼠100 μ L，免疫間隔為2周。三免后第7天，小鼠尾部采血，室溫靜置Ih，4°C過(guò)夜，IOOOOrpm離心lOmin，收集血清，4°C保存。表IBALB/c小鼠的免疫方案
權(quán)利要求
1.一種孕馬血清促性腺激素PMSG單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D-3，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.6450。
2.—種孕馬血清促性腺激素PMSG單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株A-4，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.6449。
3.一種孕馬血清促性腺激素PMSG單克隆抗體，其由雜交瘤細(xì)胞株D-3或A-4分泌獲得，所述雜交瘤細(xì)胞株D-3的保藏編號(hào)為CGMCCNo. 6450，所述雜交瘤細(xì)胞株A-4的保藏編號(hào)為 CGMCC No. 6449。
4.一種用于檢測(cè)PMSG的試劑、藥劑或試劑盒，其包括權(quán)利要求3所述的單克隆抗體。
5.—種檢測(cè)PMSG的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求3所述的單克隆抗體。
6.檢測(cè)孕馬血清促性腺激素ELISA試劑盒，其包括 (1)包被PMSG單克隆抗體的酶標(biāo)板； (2)酶標(biāo)記的PMSG單克隆抗體； 其中，包被在酶標(biāo)板的PMSG單克隆抗體與酶標(biāo)記PMSG單克隆抗體分別針對(duì)PMSG蛋白不同的抗原決定簇。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述包被在酶標(biāo)板的PMSG單克隆抗體與酶標(biāo)記PMSG單克隆抗體分別為雜交瘤細(xì)胞株D-3或A-4分泌獲得。
8.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述包被在酶標(biāo)板的PMSG單克隆抗體為雜交瘤細(xì)胞株D-3分泌獲得，酶標(biāo)記PMSG單克隆抗體為雜交瘤細(xì)胞株A-4分泌獲得。
9.如權(quán)利要求6-8任一所述的試劑盒，其還包括以下試劑中的一種或多種洗滌液、酶標(biāo)抗體稀釋液、底物顯色液、終止液、PMSG標(biāo)準(zhǔn)品。
10.如權(quán)利要求6-8任一所述的試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)記PMSG單克隆抗體的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶，具體標(biāo)記方法包括如下步驟取5mg的HRP溶于ImL三蒸水，加入新鮮配制的O. lmol/L NaIO4O. 2mL,室溫下避光攪拌20min,混勻后裝入透析袋中，以O(shè).001mol/L ρΗ4· 4醋酸鈉緩沖液4°C透析過(guò)夜，加20 μ L O. 2mol/L ρΗ9· 5碳酸鹽緩沖溶液，使PH升高到9. 0-9. 5，加入含有IOmg純化PMSG單克隆抗體IgGlmL，混勻后裝入預(yù)先活化的透析袋中，以0.05mol/L pH 9. 6碳酸鹽緩沖液4°C透析過(guò)夜，使辣根過(guò)氧化物酶與抗體充分結(jié)合，取出透析袋中的液體，加入4mg/mL的硼氫化鈉100μ L，置4°C還原6_8小時(shí)，加入等體積的飽和硫酸銨，4°C放置過(guò)夜,3000rpm,離心IOmin,將所得的沉淀溶于Iml0.01mol/L的PBS中，裝入透析袋中以0. 01mol/L的PBS透析過(guò)夜充分除去硫酸銨，透析24-36h，離心除去沉淀，即得純化酶標(biāo)記抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種孕馬血清促性腺激素(PMSG)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D-3和A-4，其保藏編號(hào)為CGMCC No.6450和CGMCCNo.6449。本發(fā)明還提供PMSG雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，其包括包被PMSG單克隆抗體的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記的PMSG單克隆抗體，捕獲抗體和檢測(cè)抗體分別針對(duì)PMSG蛋白不同的抗原決定簇。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)定性快、定量準(zhǔn)、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，并能對(duì)成品制劑進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校對(duì)，與現(xiàn)有商品化PMSG檢測(cè)試劑盒相比，費(fèi)用低、檢測(cè)靈敏度高，且檢測(cè)PMSG最低檢測(cè)限為30mIU/ml，檢測(cè)范圍在30~200mIU，適合推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102876634SQ20121035103
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者韓國(guó)才, 蘇曉倩, 鄧亮 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)